TRÍCH LY CÁC HỢP CHẤTHỌ LIMONOID(AZL)TỪ BÁNH DẦU NEEMVÀ BƯỚC ĐẦU ĐÁNH GIÁ KHẢ NĂNG KHÁNG KHUẨN CỦA NÓ

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH KHOA CƠNG NGHỆ THỰC PHẨM KHĨA LUẬN TỐT NGHIỆP TRÍCH LY CÁC HỢP CHẤTHỌ LIMONOID(AZL)TỪ BÁNH DẦU NEEMVÀ BƯỚC ĐẦU ĐÁNH GIÁ KHẢ NĂNG KHÁNG KHUẨN CỦA NÓ Ngànhhọc : BQCB NSTP Dinh DưỡngNgười Sinh viênthựchiện : TrầnNgơHồngĐăngKhoa Niênkhóa : 2008 – 2012 Tháng 08/2012 ông L gian qua i liê Azadirachtia indica A Juss) Staphylococcus aureus ii Ụ Ụ i ii MỤC LỤC iii DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT T T v DANH SÁCH CÁC B NG SỐ vi DANH SÁCH CÁC HÌNH VÀ BIỂU ĐỒ vii tv 1.2.M hương TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 Gi i thi u v Neem 2.1.1 Phân lo i 2.1.2 Mô t nh ng ng d ng truy n th ng c a neem 2.1.3 Ngu n g c c a neem 2.1.4 Giá tr y h c c a Neem 2.1.5 Các ho t ch t có ho t tính sinh h c neem c v tình hình nghiên c u neem 10 2.2.1 Trên th gi i 10 2.2.2 Ở Vi t Nam 11 2.3.Kh c 12 m sinh h c c a loài vi khu n gây s d ng nghiên c u 12 2.4.1 Escherichia coli 13 2.4.2 Salmonella 14 2.4.3 Staphylococcus aureus 15 hương VẬT LIỆU VÀ PHƯ 3.1 Th G PHÁP GH Ê ỨU 18 m th c hi n nghiên c u 18 3.2 Nguyên v t li u nghiên c u 18 iii 3.2.1 H t neem 18 3.2.2 V t li u d ng c 18 3.2.3 Vi khu ng nuôi c y s d ng nghiên c u 18 m 19 3.3.1 Thí nghi : ng AZL bánh d u h t neem (Tr n Kim Qui, 2006) 19 3.3.2 Thí nghi d : nh tính kh IRBY B n c a AZL trích ly t bánh ER 25 hương KẾT QU VÀ TH O LUẬN 31 4.1 K t qu 4.2 K t qu thí nghi IRBY B ng AZL bánh d u neem 31 giá kh n c a AZL ER 33 hương KẾT LUẬ VÀ ĐỀ NGHỊ 36 5.1 K t lu n 36 ngh 36 TÀI LIỆU THAM KH O 38 PHỤ LỤC 40 PHỤ LỤC : S v ng PHỤ LỤC : Thành ph c th c ph m t ng c 40 ng nuôi c y vi sinh v t 41 PHỤ LỤC : K t qu thơ c a thí nghi m 42 PHỤ LỤC : K t qu x lý th ng kê s li u c a thí nghi m ph n mêm Minitab 15 43 iv DA H SÁ H Á HỮ V Ế A indica Azadirachta indica AZ Azadirachtin AZL Azadirachtin Related Limonoids AZL/DCM c sau trình tinh s ch dichloromethane AZL/EtOH Cao c sau q trình trích ly v i ethanol CTL Cao trích ly DCM Dichloromethane GS G HCSH Ho t ch t sinh h c MHA Mueller Hinton Agar NIAID National Institute of Allergy and Infectious Diseases NIH National Institutes of Health NN&PTNT B Nông Nghi p & Phát Tri n Nông Thôn OD625 Optical Density (m c song 625 nm) Vi n sinh h c nhi TP Thành ph TS Ti TSB Triptic Soy Broth Ø ĩ ng kính v i DA H SÁ H Á B G SỐ B ng 3.1 Cách chu n b huy n d ch chu n hóa ch t 27 B ng 4.1 K t qu trích ly AZL t bánh d u neem 32 B ng 4.2 M c pha lỗng c a cao trích ly AZL/DCM DMSO 10% 34 B ng 4.3 K t qu thí nghi nh tính kh n c a AZL 34 vi DANH SÁCH CÁC HÌ H VÀ B ỂU ĐỒ Hình 2.1 Cây neem: Lá, hoa, qu h t neem Hình 2.2 Cơng th c c u t o c a Azadirachtin Hình 2.3 Cơng th c c u t o c a h p ch t limonoid Hình 2.4 Hình thái hi n vi c a E.coli 13 ng i 14 Hình 2.6 Ảnh hi n vi c a vi khu n S.aureus 16 Hình 3.1 Quy trình tách d u bánh d u h t neem 20 Hình3.2 Quy trình trích ly AZL ethanol 21 Hình 3.3 Quy trình tinh s ch cao AZL/ethanol DCM 22 ng chu n th hi n m i quan h gi a n AZL m quang 24 Hình 3.5 Các thao tác chu n b m quang 25 c khác c a huy n d ch McFarland 26 c th c hi n thí nghi m 29 n 29 Hình 4.1 Hình nh c a qu , h t, nhân h t v h t neem 31 Hình 4.2 Màu xanh l c c a AZL dung d ch v i thu c th Salkowski 32 Hình 4.3 Vòng vơ khu c t o b i ho t ng c ch phát tri n vi khu n c a AZL trích ly t bánh d u neem 34 vii hương G H ỆU 1.1 Đặt vấn đề –B Y i s c kh e ằ (Azadirachta indica Ấ Ấ Neem u th k c du nh p vào nhi u qu nhi c bi n tích r ng neem cao – 10m i T i Vi t Nam hi Nh ng nghiên c u v thành qu c nhi u k t qu kh quan Tuy nhiên n ch ĩ c ch vi khu ĩ c áp d ng ch y u nơng nghi p Vì v y, nh ng hi u bi t khoa h c v d b o qu n th c ph m, cho phép d c bi t kh c s phát tri n c a ũ ngành công nghi p ch t b o qu n th c ph m có ngu n g c t c kh e khác Vì nh Th y Phan Th c y h c, lâm c tính c a neem ng c công ngh th c ph m r t c n thi t s n ph c is a ng d n c a c hi 1.2 Mục đích ng AZL bánh d u h t neem Hi u bi õ khu n gây ng kh c ch c a AZL lên s phát tri n c a m t s loài vi c th c ph m th c hi n m vng góc v i m ng Khi l c ĩ n quan sát tr c di n tránh sai s có th x y làm sai l ch k t qu K t qu lý th ng kê theo ki u thí nghi m hồn toàn ng u nhiên m t y u t ph n m m Minitab phiên ph n 15 30 hương KẾ QU VÀ H O UẬ 4.1 Kết trích ly định lượng AZ bánh dầu neem Quả neem Hạt neem Nhân hạt neem Vỏ hạt neem Hình 4.15 Hình ảnh quả, hạt, nhân hạt vỏ hạt neem H c s y khô, tách v r c th c hi n bằ u Quá trình ép d u t nhân h t i hi u KOMET T 9kg h c 670g d u neem 8.33kg bánh d u D u neem chi m 7.44% nhân h t neem Q trình trích ly AZL t bánh d c th c hi 3.2 hình 3.3 31 hình 3.1, hình AZL hóa xanh dung d ch v i thu c th Salkowski M màu xanh l c th hi n n m nh t c a c a AZL có cao trích ly Hình 4.16 Màu xanh lục AZL dung dịch với thuốc thử Salkowski Q c th c hi công th c n i suy t ng chu n m hình 3.6 tính tốn theo quang c a dung d ch AZ 95% : Y= 8.7014X +0.0001 K t qu trích ly AZL t bánh d c th hi n b ng 4.1 Bảng 4.2 Kết trích ly AZL từ bánh dầu neem STT Bánh d u (g) 10 Cao trích ly AZL/DCM C1 (mg/ml) C2 (mg/ml) % AZL 0.43 0.3 0.0560 0.803% 0.51 0.21 0.0287 0.820% 0.69 0.5 0.0623 0.859% (g) % AZL trung bình bánh d u neem ng AZL có bánh d i th p (0.836%, v i k t qu trích ly c a tác gi khác (3.46%, 2006) Tuy nhiên v 0.836% ± 0.03 12.3%, Tr n Kim Qui, n ngành lâm nghi p Ấ 15%) 32 16.6%) so (0.5%, ằng dung mơi, có nhi u y u t ng hóa ch t, thao tác thí nghi gian thí nghi u ki n b o qu n m u thí nghi Trong gi i h n c Trung Qu c v n k t qu ng thí nghi m, th i … tài, chúng tơi s d ng dung mơi, hóa ch t có ngu n g c tinh t th p Trong m nhân t quy tinh t c a dung môi n hi u qu E n k t qu trích ly AZL t t, nhiên có nh ng h p ch t khác ũ ch trích làm D v y c n s d n q trình trích ly Chính tinh s ch d ch trích ethanol Các y, l c, … thao tác q trình thí nghi khơng chu ũ ẽ n k t qu thí nghi m Các dung mơi s d ng u có th thu h i l thi t b u c hi u ki n PTN h n ch v c Th i gian ngâm khu y cô quay chân không m i m u bánh d u q trình trích ly r t dài, nhi u l n ph i t m d ng thí nghi …; gi hành chính, m u ki n nhi tác nhân quan tr ng làm gi Hàm ũ nh sau qu neem chín hồn tồn u ch ng t rằ r t nhi u vào ngu n nguyên li b o qu n m ng AZL d ch trích ng AZL nhân h t neem YE u ki n khách quan (h t ng AZL h t neem ph thu c tu i th m thu ho ch Chính v y, s d ng h t neem công nghi p, c n ph o qu n thích h p ngu n nguyên li m C n ph i có nh ng gi m thi u s m t mát ch t có ho t tính sinh h c 4.2 Kết thí nghiệm định tính đánh giá khả kháng khuẩn AZ phương pháp K RBY BAUER Có ch ng vi khu c s d ng thí nghi m: Escherichia coli (Gram -), Salmonella (Gram -), Staphylococcus aureus (Gram +) 33 D M dung d ch có n D u tiên Ti p t O m t n a cho t i nh Q dung d c D c c nêu rõ b ng 4.2 Bảng 4.3 Mức pha loãng cao trích ly AZL/DCM DMSO 10% Bánh d u (g) % AZL bánh d u 20 0.836 M AZL (mg) 167.2 16720 ppm pha loãng 8360 ppm 4180 ppm 2090 ppm K t qu c a thí nghi m tính kháng khu n c a AZL ch ng vi khu n E coli, Salmonella Staphylococcus aureus vòng kháng khu c th hi n b ng 4.3 Hình nh v c t o thành ho ng c ch vi khu n c a AZL th hi n hình 4.3 Hình 4.17 Vòng vô khuẩn tạo hoạt động ức chế phát triển vi khuẩn AZL trích ly từ bánh dầu neem Bảng 4.4 Kết thí nghiệm định tính khả kháng khuẩn AZL Ch ng vi khu n N 34 x lý (ppm) i ch ng DMSO 16720 8360 4180 2090 10% S.aureus Vòng (gram +) vơ E coli khu n (gram -) (mm) Salmonella (gram -) 13.33±0.57a 8.0±0.00b 0 0 7.33±0.57c 0 11.66±0.57 7.66±0.57 6.33±0.57 Nh vào s ti p xúc gi a khoanh gi y b m t th ch MHA, ho t ch t AZL khu ch tán lên b m ng th ch T n s phát tri n c a vi khu n b m t th ch t o thành vòng tròn vơ khu n xung quanh khoanh gi y (hình 4.3) D a vào k t qu thí nghi m, nhìn chung có th nói ho t ch t AZL có kh ch s phát tri n c a c ch ng vi khu n thí nghi d n theo n x lý có Staphylococcus aureus) Có th th y 16720 ppm, AZL c ch hoàn toàn s phát tri n c a c ch ng vi khu n thí nghi m X lý hai n 8360 ppm 4180 ppm ch có kh phát tri n c a S aureus mà Ở n ch c ch gi m ng khác lên vi khu n gram âm (E coli Salmonella) vi khu n c kh c ch s 8360ppm, 4180ppm 2090 ppm, ho t c ch vi khu n gram âm phát tri n 35 hương KẾ UẬ VÀ ĐỀ GHỊ 5.1 Kết luận 5.1.1 Thí nghiệm 1: trích ly hoạt chất AZL từ bánh dầu neem:  c t bánh d i th p so v i k t qu c a m t s nghiên c u khác  ng AZL bánh d u neem ( c so v i tiêu chu n ngành lâm nghi p c a Ấ d u neem ch p nh v 16.6%) chi m 0.836% bánh ng AZL có h t neem khơ ( ≥ 5.1.2 Thí nghiệm 2: định tính khả ức chế vi khuẩn hoạt chất AZL (AZ thu từ thí nghiệm 1): X lý n 16720 ppm, AZL th hi n kh c ch s phát tri n c a t t c ch ng vi khu n thí nghi m Kh c ch vi khu n c Kh c ch vi khu n c a AZL có tác d vi khu it l v in AZL x lý ng th i lên c vi khu n gram âm m cho th y có th vi khu c mv y i vi khu n gram âm 5.2 Đề nghị Các k t qu c t hai thí nghi m ch d ng l i Do nh ng h n ch v u tiên pháp nghiên c u gi i h n th th ti n hành nh ng thí nghi m chi ti v kh nh ng d li có th hi n c a AZL 36 õ có th c nh ng k t qu m t cách h th ct ngh : Nghiên c u q trình trích ly AZL t b ph n khác c a Neem Nghiên c c tính kháng khu n c a AZL ch ng vi khu n gây b nh khác ng AZL nhân h t neem 37 À ỆU HA KH O Tài liệu tiếng Việt: D t Linh, 2008 Kỹ thu Nguy n Ti - Dũ i h c M TP H Chí Minh m nghi m vi sinh v t th c ph m – i h c khoa h c t nhiên TP H Chí Minh Nguy n Th Tuy t Nga, 2008 Kh o sát kh c ch n m gây b nh c a ho t ch t chi t xu t t nhân h t neem (Azadirachta indica A.Juss) – i h c Nông Lâm TP H Chí Minh Tr D ng vi sinh v t gây b nh th c ph m – th c t áp d ng th gi i Vi t Nam – i h c bách khoa Hà N i Tr n Kim Qui, 2006 Hoàn thi n quy trình trích ly ho t ch t limonoid qui mô pilot t u ch ph gia thích h làm nguyên li u pha ch thu c b o v th c v t – Trung tâm nghiên c u ng d ng sinh h c TP H Chí Minh Tr nh Xuân Phát, 2007 Nghiên c u th c tr ng ô nhi m th s y u t liên quan t i thành ph Thanh Hóa – tài th ng ph m t ĩ Y– i h c Y Thái Nguyên ũ , Nguy n Ti n Th ng, 2007 Xây d ng qui trình chi t xu t, tinh s ch ng Azadirachtin h t xoan ch u h n (Azadirachta indica A.Juss) Kỷ y u h i th o khoa h c công ngh 2007 Vi n tiêu chu n lâm sang xét nghi m (CLSI), 2011 Quy trình thao tác chu n v th nghi m tính nh y c m kháng sinh 38 Tài liệu tiếng nước ngoài: Bhupinder Kaur Padda Priyanka Khanna Antimicrobial Activity of CH61 using Agar Diffusion Method - An In-Vitro Study JIDA, Vol 5, No 3, March 2011 J H Jorgensen et al., 2006 Direct Comparison of Antimicrobial Susceptibility Testing by the BD Phoenix, bioMérieux ViTek2, and Disk Diffusion Test Methods as Compared to Results Generated by the CLSiBroth Microdilution Test University of Texas Health Science Center and University Hospital KOONA BOUDIDA, 2010 Antibacterial Potential of the Extracts of the Leaves of Azadirachta indica Linn Lin Jiang, 2011 Comparison of disk diffusion, agar dilution and broth microdilution for antimicrobial susceptibility testing of five chitosans - Louisiana State University Mamadou FAYE, 2010 Nouveau Procédé De Fractionnement De La Graine De Neem (Azadirachta Indica A.Jussi) Sénégalais : Production D'un Bio-Pesticide D'huile Et De Tourteau tài ti ĩ i h c Toulouse – Pháp Tài liệu từ Internet : http://fr.wikipedia.org http://vfa.gov.vn 39 PHỤ Ụ PHỤ Ụ : Số vụ ngộ độc thực phẩm từ tháng đến tháng năm 2012 K t qu giám sát T ng s Tháng S v S m c ph i S ca t S ca vong vi n 2098 197 116 2135 121 88 14 1421 579 377 19 6590 810 754 4 T ng 49 12248 1711 13 1336 Ngu n : C c v sinh an toàn th c ph m – B Y T , 2012 (http://vfa.gov.vn/content/article/so-vu-ngo-doc-thuc-pham-thang-1-52012-197.vfa) 40 PHỤ Ụ : hành phần dinh dưỡng môi trường nuôi cấy vi sinh vật MHA (Muller Hinton Agar) La composition g/l Infusion du boeuf Caséine acid hydrolysate 17,5 Amidon 1,5 Agar-agar 17 E ’ ’I Final pH (250C) : 7,3 +/- 0,2 Autoclaver 15 minutes 1210C TSB (Triptic soy broth) La composition g/l Pancreatic digest of casein 17 Papaic digest of soyabean meal NaCl Dipotassium hydrogen phosphate 2,5 Dextrose (glucose) 2,5 E ’ ’I Final pH (250C) : 7,3 +/- 0,2 Autoclaver 15 minutes 1210C 41 PHỤ ỤC : Kết thơ thí nghiệm S th t N x lý S l nl pl i 16720 ppm 8360 ppm Ch ng vi 4180 ppm 2090 ppm ng kính vòng vơ khu n khu n i ch ng 0 0 0 0 0 0 E.coli 7 0 0 0 Salmonella 7 0 0 0 0 14 13 13 12 11 12 8 7 6 Staphylococcus aureus 42 PHỤ Ụ : Kết xử lý thống kê số liệu thí nghiệm phần mêm Minitab 15 One-way ANOVA: diamettre - 16720 versus bacterie - 16720 Source bacterie - 16720 Error Total S = 0.4714 Level N 3 DF SS 64.889 1.333 66.222 R-Sq = 97.99% Mean 8.000 7.333 13.333 StDev 0.000 0.577 0.577 MS 32.444 0.222 F 146.00 P 0.000 R-Sq(adj) = 97.32% Individual 95% CIs For Mean Based on Pooled StDev -+ -+ -+ -+-( * ) ( -* ) ( -* ) -+ -+ -+ -+-8.0 10.0 12.0 14.0 Pooled StDev = 0.471 One-way ANOVA: diamettre - 8360 versus bacterie - 8360 Source bacterie - 8360 Error Total S = 2.357 Level N 3 DF SS 206.89 33.33 240.22 R-Sq = 86.12% Mean 4.667 0.000 11.667 StDev 4.041 0.000 0.577 MS 103.44 5.56 F 18.62 P 0.003 R-Sq(adj) = 81.50% Individual 95% CIs For Mean Based on Pooled StDev -+ -+ -+ -+-( -* ) ( * ) ( -* ) -+ -+ -+ -+-0.0 5.0 10.0 15.0 Pooled StDev = 2.357 One-way ANOVA: diamettre - 4180 versus bacterie - 4180 Source bacterie - 4180 Error DF SS 117.556 0.667 MS 58.778 0.111 43 F 529.00 P 0.000 Total S = 0.3333 Level N 3 118.222 R-Sq = 99.44% Mean 0.0000 0.0000 7.6667 StDev 0.0000 0.0000 0.5774 R-Sq(adj) = 99.25% Individual 95% CIs For Mean Based on Pooled StDev + -+ -+ -+ (-*-) (-*-) (-*-) + -+ -+ -+ 0.0 2.5 5.0 7.5 Pooled StDev = 0.3333 One-way ANOVA: diamettre 2090 versus bacterie - 2090 Source bacterie - 2090 Error Total S = 0.3333 Level N 3 DF SS 80.222 0.667 80.889 R-Sq = 99.18% Mean 0.0000 0.0000 6.3333 StDev 0.0000 0.0000 0.5774 MS 40.111 0.111 F 361.00 P 0.000 R-Sq(adj) = 98.90% Individual 95% CIs For Mean Based on Pooled StDev + -+ -+ -+ (-*-) (-*-) ( *-) + -+ -+ -+ 0.0 2.0 4.0 6.0 Pooled StDev = 0.3333 44 ... qu kh quan Tuy nhiên n ch ĩ c ch vi khu ĩ c áp d ng ch y u nơng nghi p Vì v y, nh ng hi u bi t khoa h c v d b o qu n th c ph m, cho phép d c bi t kh c s phát tri n c a ũ ngành công nghi p ch... thiệu eem Neem loài thu c h À c bi Azadirachta indica A Juss Nó tr thành ch th gi i t ỆU i tên khoa h c c a hàng lo t nghiên c u õ i ta có th chi c tính c a azadirachtin t ch t tr sâu t nhiên... thu c b o v th c v t r t có hi u qu nhi th gi i lá, h t d u neem có ch a r t nhi u ho t ch t tetranortriterpenoid (limonoid), quan tr ng nh t Azadirachtin (AZ) Tuy nhiên AZ không ph i ho t ch