Các phương pháp chuyển gen ở thực vật và ứng dụng

Các phương pháp chuyển gen ở thực vật và ứng dụng

Các phương pháp

Chuyển gen ở thực vật

và ứng dụng

và ứng dụng Chuyên đề

chuyển gen ở thực vật

Hệ thống nuôi cấy nuôi cấy và tái sinh in vitro

Vectơ chuyển gen

Phương pháp chuyển DNA vào mô, tế bào

thực vật Chọn lọc và xác định các thể biến nạp Phân tích và mô tả cây chuyển gen

HÖ thèng t¸i sinh hiÖu qu¶

 TÝnh toµn năng cña tÕ bµo thùc vËt

 Mét sè tÕ bµo cã kh¶ n ng n ng ă ă t¸i sinh vµ biÕn n¹p;

 Mét sè kh¸c Mét sè kh¸c + cã kh¶ năng hoÆc

+ hoµn toµn kh«ng cã kh¶ năng t¸i sinh vµ biÕn n¹p

 Kh¶ năng t¸i sinh phô thuéc :

* D¹ng vËt liÖu ban ®Çu

- Ph«i non, m« sÑo t¹o thµnh tõ ph«i non

- Chåi t¸i sinh trùc tiÕp hay th«ng qua ph«i soma t¹o thµnh tõ

cuèng l¸, l¸ mÇm, mÈu l¸, th©n mÇm

* ĐiÒu kiÖn nu«i cÊy, kiÓu gen, tuæi m«, c¸c chÊt ĐHST

Vectơ chuyển gen

 Đ Đ oạn oạn khởi động gen :

- Không đặc hiệu (đoạn khởi động cơ định): Ubi-P; CaMV35S-P; Act-P, NOS-P; Adh-P

- Đặc hiệu với các yếu tố cis chuyên biệt

 Đ Đ oạn kết thúc gen : oạn kết thúc gen :

- Chứa đuôi polyA như AATTAA (AACCAA)

- CaMV35S; NOS

 Gen thỉ thị:

+ Chỉ thị chọn lọc: hpt; npt II; pat, pmi; xylA

+ Chỉ thị sàng lọc: cat; lacZ, gus; lux, gfp

Chuyển gen gián tiếp Chuyển gen trực tiếp

ủ hạt khô với dung dịch DNA

Kỹ thuật siêu âm; Silicon carbide Phương pháp Agrolistic

Chọn lọc các tế bào chuyển gen

Mô tả cây chuyển gen

Thử nghiệm đồng ruộng cây chuyển gen

- PCR : xác định sự có mặt của gen được chuyển nạp

- Southern : xác định số bản sao của gen được chuyển nạp

- Nothern và Western : xác định biểu hiện gen và sinh tổng hợp protein

- Đánh giá về kiểu hinh và kiểu gen

- ánh giá rủi ro, ảnh hưởng của cây chuyển gen đến môi trường, con người Đ

- oạn trinh tự lặp lại 25bp (đoạn biên): dấu hiệu nhận biết cho quá trinh chuyển và Đ xâm nhập của T-DNA vào TBTV

- oạn biên phải có yếu tố điều khiển Đ cis cần cho quá trình chuyển T-DNA;

- oạn biên trái gián tiếp tham gia vào quá Đ trỡnh chuyển T-DNA và là dấu hiệu để quá trinh này kết thúc binh thường

Phương pháp chuyển gen thông qua A tumefaciens

Cấu trúc và chức n ng của Ti-plasmid Cấu trúc và chức n ng của Ti-plasmid ă ă

Cấu trúc và chức n ng của đoạn T-DNA Cấu trúc và chức n ng của đoạn T-DNA ă ă

- DNA mạch vòng, sợi kép

- 4 vùng tương đồng:

+ T-DNA và vùng VIR: hinh thành khối u ở thực vật

+ vùng chứa gen mã hoá cho việc sao chép plasmid

và chuyển nạp

C¬ chÕ ph©n tö cña chuyÓn gen th«ng qua

A tumefaciens

Ưu điểm:

- Số bản sao của gen chuyển nạp thấp, hiệu quả chuyển gen cao;

- Tránh được sự hình thành các cây chuyển gen khảm;

- Kỹ thuật không phức tạp; Không đòi hỏi thiết bị đắt tiền

Nhược điểm:

Được áp dụng rất thành công ở hầu hết các loại cây hai lá mầm,

đối với cây 1 lá mầm còn hạn chế

Hệ thống chuyển gen thông qua A tumefaciens

Hệ thống vectơ chuyển nạp

Hệ vector nhị thể

 Vectơ chuyển gen: Ti-plasmid nhỏ có khả năng tự sao chép và có phổ vật chủ rộng với đoạn T-DNA được cắt bỏ hết các gen không cần thiết, gắn thêm các đơn vị sao chép; các gen chọn lọc, gen đánh dấu và vùng MCS nằm

 Vector bổ trợ Vector bổ trợ: nằm trong A tumefaciens, với toàn bộ vùng VIR được giữ

lại nhưng loại bỏ hoàn toàn vùng T-DNA và RB, LB

Hệ thống vectơ chuyển nạp

Hệ vectơ liên hợp

Tái tổ hợp giữa vùng tương đồng nằm trên plasmid vi khuẩn với

vùng T-DNA trên Ti-plasmid của A tumefaciens Trong đó, vùng

VIR được gi lại, loại bỏ vùng mã hoá chức năng gây khối u và thay thế bằng những đoạn DNA mới trong Ti-plasmid

Ưu điểm :

- Có thể áp dụng với hầu hết các loại mô, tế bào

- Chuyển DNA ngoại lai vào tế bào nhanh

- Vectơ và quy trỡnh chuyển gen đơn giản

- Cần một lượng nhỏ plasmid DNA

- Biểu hiện gen tạm thời có thể được quan sát sau vài ngày

- Khả năng áp dụng cao trong chuyển gen vào các dòng/giống cây

trồng thương mại

Nhược điểm :

Số bản sao của gen chuyển nạp cao, gây khó khăn cho việc phân tích biểu hiện của gen đã chuyển, dẫn tới sự biểu hiện của các gen không bền vững; Hiệu quả chuyển gen thấp.

Phương pháp chuyển gen bằng súng bắn gen

Hệ thống vectơ chuyển nạp gen

- Vectơ có kích thước từ 4-7kb

- Cấu trúc của DNA: plasmid thẳng hoặc vòng; sợi đơn hoặc sợi đôi

Các yếu tố ảnh hưởng đến hiệu quả quá trinh bắn gen

- Yếu tố vật lý: vận tốc hạt, số lượng, kích thước hạt và lượng DNA bọc

hạt

- Yếu tố sinh học: dạng mẫu mô đích, điều kiện xử lý áp suất thẩm

thấu, thời gian tiền nuôi cấy

Các dạng mẫu mô đích

Tế bào huyền phù, mô sẹo, phôi non, mô phân sinh chồi đỉnh, mô phân sinh chồi hoa, hạt phấn, mô lá nguyên vẹn, mảnh lá.

- Hiệu quả chuyển gen rất khác nhau giữa các kiểu gen của cùng một loài

- Chuyển gen vào cây lúa ít phụ thuộc vào kiểu gen nhất (40 dòng/giống được

Mô sẹo phôi hoá

Phôi non mới tách: dạng mẫu mô đích tốt nhất, có khả năng tái sinh cao,

Huyền phù tế bào: dạng tế bào đầu tiên chuyển gen ở lúa

chuyển gen ở cây một lá mầm thông qua A tumefaciens

ảnh hưởng của kiểu gen

Chủng Agrobacterium và plasmid

- 3 chủng vi khuẩn lây nhiễm hiệu quả: LBA4404, C58 và EHA 101

- vectơ nhị thể hay siêu vectơ nhị thể có bổ sung các bản sao virG cho hiệu

quả chuyển gen cao

Các điều kiện xử lý đối với mẫu mô đích, lây nhiễm và đồng nuôi cấy

- Tiền xử lý mẫu mô biến nạp: xử lý co nguyên sinh, thổi khô;

- Xử lý chống thối hoại mô biến nạp: bổ sung vào môi trường ascorbic acid, cysteine, nitrat bạc

- Xử lý áp suất thẩm thấu: bổ sung vào môi trường nuôi cộng sinh sucrose

và glucose nồng độ cao.

Mật độ vi khuẩn

Thành phần môi trường lây nhiễm và đồng nuôi cấy

Các chất kháng sinh để loại bỏ Agrobacterium

- Thường sử dụng cefotaxime, carbenicillin, timentin

- Cefotaxime hiệu quả trong chuyển gen ở ngô và lúa

- Carbenicillin hiệu quả trong chuyển gen ở ngô và lúa mỳ

- N6/MS + 2,4-D + casein thích hợp cho chuyển gen vào lúa

- N6/LS + 2,4-D + nitrat bạc thích hợp cho chuyển gen vào ngô

- Acetosyringon có vai trò rất quan trọng trong chuyển gen và tái sinh

 Tế bào phôi sau khi bắn gen bị tổn thương lớn do hệ thống nuôi cấy tế bào có khả năng phôi hoá kém

 Khả năng tái sinh cây giảm, các cây tái sinh thường bị bất thụ và mất hoạt tính của gen đã chuyển nạp

 Các thể chuyển gen nhận được thường có độ hữu thụ thấp và biểu hiện kiểu hinh không binh thường Hơn n a, các cây tái sinh thường có độ kết ữ hạt thấp, già hoá sớm, cây còi cọc

chuyển gen ở cây một lá mầm bằng súng bắn gen

Chuyển gen vào tế bào trần

- Tế bào trần được tách từ huyền phù tế bào phôi hoá tạo thành từ phôi non

- Nuôi cấy huyền phù tế bào để tách tế bào trần phụ thuộc nhiều vào kiểu gen thực vật, tần số tạo biến dị soma cao

chuyển gen ở cây ngô

Chuyển gen thông qua Agrobacterium

- Ti plasmid dạng nopalin có hiệu quả hơn so với Ti plasmid dạng octopin

- Sử dụng siêu vectơ nhị thể, gen hpt/bar, pmi đã được chuyển vào phôi non dòng ngô

A188, HiII và các dòng lai với A188;

- Sử dụng vectơ nhị thể + cystein trong môi trường nuôi cộng sinh chuyển gen vào

phôi non dòng ngô HiII

- Chuyển gen thành công ở ngô bị giới hạn bởi việc sử dụng dòng ngô A188 hoặc

dòng lai trong đó dòng A188 là bố hoặc mẹ làm vật liệu.

- Phôi non mới tách là dạng vật liệu ban đầu có khả năng chuyển nạp tốt nhất

chuyển gen ở cây ngô

Chuyển gen bằng súng bắn gen ở ngô

- Là phương pháp tiên phong và thông dụng hiện nay

- Sử dụng câc dạng mô đích khác nhau: tế bào huyền phù, mô sẹo dạng I, mô sẹo

dạng II, mô phân sinh chồi đỉnh, phôi non Phôi non là dạng mô đích thích hợp nhất

- Sử dụng phôi non không ổn định về số lượng cũng như chất lượng do tác động của

thời tiết và điều kiện nuôi trồng vật liệu cho phôi.

Phương pháp chuyển gen khác được áp dụng đối với cây ngô

- Chuyển gen bằng xung điện: sử dụng phôi non đã xử lý với enzym hoặc mô sẹo dạng I

bị gây tổn thương bằng cơ học hoặc huyền phù tế bào phôi hoá đã xử lý enzym.

- Chuyển gen vào huyền phù tế bào, mô sẹo dạng II sử dụng kim làm bằng cacbua silic

chuyển gen ở cây ngô

So sánh phương pháp chuyển gen bằng súng bắn gen

và thông qua Agrobacterium

- ều phụ thuộc vào kiểu gen, dạng mẫu mô đích Đ

- Là hai phương pháp chủ đạo đối với cây ngô

Chuyển gen thông qua Agrobacterium:

- Sự kết hợp của đoạn DNA đã được xác

định trong bộ gen cây chủ.

- Dạng mô đích: chủ yếu sử dụng phôi

non mới tách

- Hầu hết chuyển gen vào các dòng ngô

mô hình (A188, HiII)

- Tần số biến nạp dao động 0,9-20%

Chuyển gen bằng súng bắn gen:

- Phạm vi của DNA ngoại lai được chuyển vào tế bào thực vật không thể kiểm soát được

- Nhiều bản sao của gen chuyển nạp và dạng kết hợp khá phức tạp

- Khả năng xuất hiện sự bất hoạt gen và sự sắp xếp lại của DNA cao

- Dạng mô đích: mô sẹo, mô sẹo phôi hoá, huyền phù tế bào mô sẹo phôi hoá, phôi non

- Chuyển gen vào các dòng ngô thuần/dòng ngô chọn lọc

- Tần số biến nạp dao động từ 1-18%

Kết luận

giống cây trồng.

loài cây chuyển gen đã được thử nghiệm ngoài đồng ruộng.

tần số biến nạp chưa cao.