BẢN THẢO Xây dựng quy trình phân tích Cd trong máu

BẢN THẢO: Xây dựng quy trình phân tích Cd máu ĐẶT VẤN ĐỀ Ô nhiễm kim loại nặng vấn đề giới quan tâm ảnh hưởng nghiêm trọng đến sức khỏe người dù lượng nhỏ Mức độ sử dụng hóa chất nói chung Cadimi (Cd) nói riêng ngày gia tăng điều tránh khỏi q trình cơng nghiệp hóa, đại hóa Tuy nhiên, trình khai thác, chế biến sử dụng kim loại, tác dụng mặt kinh tế đồng thời gây tác hại đáng kể sức khỏe người đăc biệt Cadimi – kim loại có ảnh hưởng nghiêm trọng Thế giới có nhiều nghiên cứu ảnh hưởng Cadimi đến người lao động (NLĐ) làm việc ngành nghề luyện kim, khai thác mỏ, sản xuất nhựa, công nghiệp điện, sản xuất pin, ác quy… nhiều nước giới công nhận Cadimi tác nhân gây nên bệnh nghề nghiệp bảo hiểm Việc xây dựng quy trình phân tích Cadimi máu nói riêng dịch sinh học nói chung nhiều nhà khoa học giới tiến hành có nhiều phương pháp cơng bố, việc xác định Cadimi dịch sinh học nhanh chóng xác Góp phần vào việc bảo vệ sức khỏe NLĐ trước tác động Cadimi ngành sản xuất Ở Việt Nam, có số nghiên cứu ảnh hưởng kim loại đến NLĐ số ngành nghề nhiễm độc Cadimi công nhận bệnh nghề nghiệp năm 2011 theo Thông tư 42/2011/TT-BYT Từ lâu, kim loại xuất phổ biến ngành luyện kim màu, khai thác mỏ, sản xuất nhựa… ảnh hưởng nghiêm trọng đến sức khỏe NLĐ Tuy nhiên, phương pháp phân tích Cadimi dịch sinh học có nhiều hạn chế việc phân tích Cadimi nước tiểu Viện sức khỏe nghề nghiệp – dùng phương pháp cực phổ xung vi phân So với phương pháp khác giới phương pháp phổ phát xạ nguyên tử hay phương pháp quang phổ hấp thụ nguyên tử độ xác, ngưỡng phát hiện… nhiều hạn chế Mặt khác việc xây dựng quy trình phân tích Cadimi máu Việt Nam thiết bị công nghệ đại gần chưa quan tâm Vì NLĐ chịu ảnh hưởng nguyên tố chưa bảo vệ cách thỏa đáng Với lý nêu việc “Nghiên cứu xây dựng quy trình xác định nồng độ Cadimi máu phương pháp quang phổ hấp thụ nguyên tử” thực vơi mục tiêu là: Xây dựng quy trình xác định nồng độ Cadimi máu quang phổ hấp thụ nguyên tử kỹ thuật không lửa Giới hạn phát hai quy trình 0.1µg/l, độ xác 85% ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Đối tượng nghiên cứu Quy trình phân tích Cd máu máu 35 cán làm việc Tổng Liên Đoàn lao động Việt Nam 2.2.Phương pháp nghiên cứu 2.2.1 Thiết kế nghiên cứu Thử nghiệm phòng thí nghiệm kết hợp với nghiên cứu cắt ngang 2.2.2 Phương pháp nghiên cứu Thử nghiệm ứng dụng phương pháp phân tích Quang phổ hấp thụ nguyên tử kỹ GF-AAS Bảng 1: Thiết bị, dụng cụ, hóa chất sử dụng Thiết bị Dụng cụ Hóa chất - Máy quang phổ hấp thụ - Bình định mức 10ml, 20ml, 50ml, - Triton X-100,- HNO3 nguyên tử AA 900 hãng Perkin Elmer, Mỹ 100ml, 1000ml Đức - (NH4)2HPO4, - Mg(NO3)2 - Micopipet kênh: loại với thể - Pd(NO3)2 - Tủ lạnh,tủ âm sâu,cân phân tích: 0,2-500 µl đầu tip - Dung dịch Cd chuẩn tích, Máy cất nước lần Pháp, Đức… - Khí Argon tinh khiết WSC/4D Hamilton, Tất dụng cụ ngân Mỹ … 99.995% HNO3 10% lần lần 24 Chuẩn bị dung dịch Phương pháp phân tích xây dựng theo nghiên cứu Ivanenko N B (2012), Nunes JA (2010), Olmedo P (2010) Các dung dịch phân tích chuẩn bị sau: - Dung dịch modiffier (dung dịch cải biến nền): 0.1%TritonX-100, 2.5%NH4H2PO4, 0.15%Mg(NO3)2, 0.033% Pb(NO3)2 - Dung dịch rửa: 0.1% Triton X-100, 0.2%HNO3(70%) - Pha dung dịch chuẩn (pha HNO3 0.1%): Dung dịch Cd có nồng độ Cd 20µg/L - Xử lý mẫu: Mẫu lấy từ tủ âm sâu giã đông cách để ngăn mát tủ lạnh thường sau giã đông đưa ngồi để để phân tích Trước phân tích phải lắc 0.9 ml modifier + 0.1 ml mẫu lắc đưa vào máy phân tích Mẫu phải đưa vào phân tích ngay, khơng để tiếng tính từ thời điểm trộn xử lý mẫu xong - Mẫu khảo sát: Mẫu khảo sát cho quy trình phân tích Cd máu: 0.8ml modifier + 0.1ml mẫu máu dây dốn + 0.1ml chuẩn KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 3.1 Chuẩn hóa điều kiện cho phép đo phổ hấp thụ nguyên tử cho nguyên tố Cd Việc nghiên cứu chọn thông số đo phù hợp với phép phân tích định lượng ngun tố hóa học cơng việc cần thiết quan trọng kỹ thuật AAS nói chung kỹ thuật khơng lửa nói riêng (GF-AAS) Sử dụng dung dịch chuẩn bị phần phương pháp tiến hành khảo sát thông số máy thu kết sau: Khi khảo sát vạch phổ nguyên tố Cd (với vạch phổ 228.8nm 326.9nm), độ rộng khe đo máy (0.2nm, 0.7nm 2nm), cường độ đèn (từ 65% đến 85% cường độ đèn tối đa) Nhóm nghiên cứu thu kết là: tại vạch phổ 228.8nm, khe đo 0.7nm cường độ đèn 83.33% (200mA) cho độ hấp thụ tốt ổn định Chính nhóm nghiên cứu chọn giá trị giá trị cho việc khảo sát điều kiện 3.1.1 Kết khảo sát điều kiện nguyển tử hóa mẫu Q trình ngun tử hóa mẫu kỹ thuật ngun tử hóa khơng lửa xảy theo giai đoạn thời gian tổng cộng từ 60 - 80 giây Các giai đoạn là: sấy khơ mẫu, tro hoá luyện mẫu, nguyên tử hoá, làm cuvet[1] Mỗi giai đoạn có vai trò định q trình ngun tử hóa mẫu liên quan chặt chẽ với Để có kết phân tích tốt nhóm nghiên cứu tiến hành khảo sát giai đoạn để tìm điều kiện phù hợp cho trình nguyên tử hóa mẫu với giá trị cụ thể sau: Giai đoạn sấy mẫu Giai đoạn sấy mẫu 1: Nhiệt độ sấy mẫu khảo sát khoảng từ (50 0C-1300C) Thời gian tăng nhiệt từ (1-15s) Thời gian giữ nhiệt từ (5-40s) Giai đoạn sấy mẫu 2: Nhiệt độ sấy mẫu khảo sát khoảng từ (300 0C-5000C) Thời gian tăng nhiệt từ (5-25s) Thời gian giữ nhiệt từ (5-40s) Giai đoạn tro hóa luyện mẫu: Nhiệt độ tro hóa luyện mẫu khảo sát khoảng từ (450 0C6500C) Thời gian tăng nhiệt từ (5-25s) Thời gian giữ nhiệt từ (1-5s) Giai đoạn nguyên tử hóa mẫu: Nhiệt độ nguyên tử hóa mẫu khảo sát khoảng từ (1700 0C21000C) Thời gian tăng nhiệt từ (0-5s) Thời gian giữ nhiệt từ (1-5s) Giai đoạn làm cuvet: Nhiệt độ làm khảo sát khoảng từ (2100 0C-24000C) Thời gian tăng nhiệt từ (0-5s) Thời gian giữ nhiệt từ (1-5s) Với điều kiện khảo sát kết thu bảng đây: Bảng 2:Kết khảo sát điều kiện nguyên tử hóa mẫu TT Giai đoạn sấy mẫu Nhiệt độ 0C Thời gian tăng nhiệt (s) Thời gian giữ nhiệt(s) 90 400 550 1900 2000 10 10 20 10 3 Giai đoạn tro hóa Giai đoạn nguyên tử hóa Giai đoạn làm cuvet Tức giá trị bảng nhóm nghiên cứu nhận thấy độ hấp thụ quang tốt ổn định Chính nhóm nghiên cứu để chọn giá trị bảng làm giá trị giai đoạn ngun tử hóa mẫu cho quy trình phân tích Cd máu 3.1.2 Khảo sát yếu tố ảnh hưởng đến phép đo phổ hấp thụ không lửa Nhóm nghiên cứu xác định số yếu tố ảnh hưởng là: axit, nồng độ axit, thành phần nồng độ chất cải biến (modifier) Kết khảo sát cụ thể trình bày đây: 3.1.2.1 Khảo sát ảnh hưởng nồng độ axit HNO3 Theo kết nghiên cứu Phạm Luận[1], Nunes[5] Ivanenko[4], O Faroon [7] phân tích kim loại nặng máy quang phổ hấp thụ nguyên tử không lửa axit HNO xem axit phù hợp cho kết tốt Chính nhóm nghiên cứu chọn axit HNO axit dùng để phân tích Cd mẫu máu nước tiểu Tuy nhiên, nồng độ axit ảnh hưởng lớn đến kết phép đo, chí nồng độ axit HNO3 cao 5% ảnh hưởng đến độ bền lò Nồng độ axit khác tạo nên độ nhớt dung dịch khác kết phân tích khác Để đảm bảo kết phân tích nhóm nghiên cứu tiến hành phân tích ảnh hưởng nồng độ axit HNO mức sau: 0.05%, 0.1%, 0.15%, 0.2% kết cho thấy khác nồng độ axit dẫn đến khác độ hấp thụ quang Tuy khơng nhiều nhóm nghiên cứu nhận thấy với nồng độ HNO3 = 0.1% cho cường độ vạch phổ độ ổn định tốt 3.1.2.2 Khảo sát chất cải biến hóa học 3.1.2.2.1 Khảo sát ảnh hưởng nồng độ X-100 X -100 chất thêm vào mẫu phân tích tạo thành chất dễ bay hơi, cho phép loại thành phần khỏi mẫu trước nguyên tử hóa chất phân tích Theo nghiên cứu Nunes [5] Ivanenko [4] chất cải biến sử dụng với nồng độ sau: 2.5% NH4H2PO4 0.15% Mg(NO3)2 0.1% Triton X-100 Theo hướng nghiên cứu khảo sát ảnh hưởng nồng X-100 đến phép đo phổ nguyên tố Cd mức nồng độ: 0; 0.05; 0.1; 0.15; 0.2 (%) Kết thu sau Bảng 3: Khảo sát nồng độ X-100 đến phép đo phổ Cd Kết Mẫu máu Abs RSD (%) 0.2178 0.86 Nồng độ X-100(%) 0.05 0.1 0.2332 0.2241 0.96 1.2 (Lặp lại lần) 0.15 0.2204 0.36 0.2 0.2199 0.78 Kết khảo sát cho thấy mẫu máu khơng có X-100 độ hấp thụ quang thấp Abs = 0.2178 Khi có X-100 độ hấp thụ quang tăng Tuy nhiên, độ hấp thụ quang cao nồng độ 0.05% Tiếp tục tăng nồng độ X-100 lên 0.1%, 0.15%, 0.2% độ hấp thụ quang khơng tăng Thậm chí giảm nồng độ cao 0.2% (Abs=0.2199) Kết có đơi chút khác so với nồng độ X-100 Nunes Ivanenko Các tác giả dùng X – 100 nồng độ 0.1% Tuy nhiên phân tích Cd mẫu máu cho thây cần dùng X – 100 nồng độ 0.05% cho kết tốt Từ tiết kiệm hóa chất trình phân tích mẫu hàng loạt 3.1.2.2.2 Khảo sát ảnh hưởng nồng độ NH4H2PO4 Nhóm nghiên cứu khảo sát ảnh hưởng NH4H2PO4 nồng độ sau 1.5%; 2%; 2.5%; %; 3.5% Với hợp với điều kiện tối ưu khảo sát kết thu sau: Bảng 4: Khảo sát nồng độ NH4H2PO4 đến phép đo phổ Cd Kết Mẫu máu Abs RSD (%) 1.5 0.2218 0.86 Nồng độ NH4H2PO4 (%) 2.5 0.2231 0.2399 0.2201 1.96 1.12 4.36 (Lặp lại lần) 3.5 0.1998 5.78 Từ kết cho thấy nồng độ NH 4H2PO4 ảnh hưởng đến kết phép đo rõ dệt Nồng độ phù hợp 2.5%, nồng độ thấp 1.5% 2% phép đo ổn định độ hấp thụ quang Khi tăng nồng độ lên 3% 3.5% độ hấp thụ quang giảm kèm theo độ ổn định giảm dần Căn vào kết khảo sát nhóm nghiên cứu chọn nồng độ thích hợp cho NH4H2PO4 làm chất cải biến hóa học 2.5% Kết giống kết số tác giả nghiên cứu trước Nunes[5] Ivanenko[4] Tuy nhiên, phương pháp NIOSH (8005) phân tích Cd mẫu máu khơng sử dụng chất Có thể lý khiến phương pháp 8005 NIOSH cần hàng để phá mẫu 3.1.2.2.3 Khảo sát ảnh hưởng nồng độ Mg(NO3)2 Cũng giống ảnh hưởng NH4H2PO4 Mg(NO3)2 chất thêm vào mẫu phân tích tạo thành hợp chất bền nhiệt, khó bay hơi, cho phép tăng nhiệt độ tro hóa, nguyên tử hóa, giữ lại chất phân tích đồng thời loại thành phần nhiệt độ cao Bảng 5: Khảo sát nồng độ Mg(NO3)2 đến phép đo phổ Cd Kết Mẫu máu Abs RSD (%) Nồng độ Mg(NO3)2 (%) 0.05 0.1 0.15 0.2 0.2165 0.2259 0.2361 0.2319 1.19 1.98 0.37 4.23 (Lặp lại lần) 0.25 0.2138 5.38 Từ bảng cho thấy có mặt Mg(NO3)2 ảnh hưởng đến độ hấp thụ quang phép đo Nhưng nồng độ 0.15% nồng độ cho kết tốt thể độ ổn định cao giá trị Abs = 0.2361 (mẫu máu) Ở nồng độ thấp 0.05% 0.1% tính ổn định cao giá trị Abs lại thấp Ở nồng độ cao 0.2% 0.25% độ hấp thụ quang khơng cao đồng thời tính ổn định giảm chí nồng độ 0.25% RSD = 5.38% Căn vào kết khảo sát nhóm nghiên cứu chọn nồng độ thích hợp cho Mg(NO3)2 làm chất cải biến hóa học 0.15% 3.1.2.2.4 Khảo sát ảnh hưởng nồng độ Pd(NO3)2 Theo GS.TSKH Phạm Luận nhiều tác giả khác Pd(NO3)2 ngun tố có vài trò quan trọng cải biến chất phân tích Theo P Olmedo [6] Pd(NO 3)2 sử dụng nồng độ 0.033% Trên sở nghiên cứu P Olmedo nhóm nghiên cứu khảo sát ảnh hưởng Pd(NO3)2 trình phân tích Cd mẫu máu mẫu nước tiểu mức nồng độ: 0; 0.01; 0.02; 0.03; 0.04; 0.05 Kết hợp với điều kiện tối ưu tìm Bảng 6: Khảo sát nồng độ Pd(NO3)2 đến phép đo phổ Cd Nồng độ Pd(NO3)2 (%) 0.01 0.02 0.03 0.04 0.05 Mẫu Abs 0.2371 0.2475 0.2691 0.2519 0.2238 0.2081 RSD (%) 0.47 1.39 0.37 3.21 4.31 5.13 máu Từ kết nhóm nghiên cứu chọn 0.02% Pd(NO 3)2 làm chất cải biến cho phép phân Kết tích Cd mẫu máu Việc sử dụng thêm Pd(NO 3)2 chất cải biến nên để tăng độ hấp thụ quang phép phân tích khác biệt q trình thực nhóm nghiên cứu so với Nunes[5] Ivanenko[4] Nồng độ khác so với nghiên cứu tác giả P.Olmedo (2010) - 0.033% Đây hóa chất đắt tiền, nồng độ giảm tiết kiệm hóa chất q trình phân tích, tiết kiệm kinh phí 3.1.3 Khảo sát ảnh hưởng thể tích chất bổ trợ - cải biến nền(modifier) Khảo sát ảnh hưởng thể tích chất bổ trợ - modifier nhóm nghiên cứu tiến hành khảo sát mẫu với thể tích chất bổ trợ khác 0, 1, 2, 3, (µl) thu kết sau: Bảng 7: Khảo sát ảnh hưởng thể tích chất bổ trợ Kết Mẫu máu Abs RSD (%) 0.201 2.15 Thể tích chất bổ trợ µl 0.2855 0.2930 0.2691 0.5 1.06 0.79 (-): Không phát hiện(Lặp lại lần) - Từ kết khảo sát cho thấy thể tích chất bổ trợ µl cho độ hấp thụ quang tốt Thể tích chất bổ trợ tăng độ hấp thụ giảm, chí tăng thể tích chất bổ trợ lên V=4 µl khơng phát ngun tố phân tích Điều cho thấy chất bổ trợ có vai trò quan trong việc cải biến tăng độ hấp thụ quang nguyên tố Tuy nhiên, nồng độ định dùng với nồng độ cao gây tác dụng ngược lại Đối với thể tích mẫu phân tích nhóm nghiên cứu chọn theo kết nghiên cứu Nunes [5] Ivanenko [14] Thể tích mẫu máu = 8µl 3.2 Chọn điều kiện lấy mẫu, xử lý mẫu để có dung dịch đo 3.2.1 Lấy mẫu Lấy 2ml máu cho vào ống có chứa chất chống đông - Heparin, bảo quản lạnh trước mang phòng thí nghiệm Ở điều kiện âm sâu -200 đến -800C mẫu bảo quản - tháng 3.2.2 Xử lý mẫu Trên sở nghiên cứu trước nhóm nghiên cứu tiến hành xử lý mẫu để có dung dịch phân tích cách dùng dung dịch modifier khảo sát Tức trộn dung dịch modifier với mẫu phân tích Tuy nhiên, để có tỷ lệ hợp lý dung dịch phân tích cho kết tốt chúng tơi tiến hành khảo sát tỷ lệ trộn modifier mẫu sau: 9:1; 8:2; 7:3; 6:4; 5:5; Tổng thể tích mẫu modifier ≥1ml Vì thể tích dung dịch đựng cóng đo máy 1ml Sử dụng điều kiện tối ưu khảo sát chúng tơi phân tích dung dịch chuẩn bị kết khảo sát thu bảng sau: Bảng 8: kết khảo sát điều kiện xử lý mẫu Kết 9,5:0.5 9:1 Tỷ lệ modifier:mẫu 8:2 7:3 6:4 5:5 Mẫu Abs RSD (%) máu 0.2301 1.25 0.2430 0.76 0.2315 0.2281 1.12 0.89 (Lặp lại lần) 0.2215 2.31 0.201 1.34 Từ kết khảo sát nhóm nghiên cứu nhận thấy xử lý mẫu dung dịch modifier với tỷ lệ 9:1 hợp lý Vì tỷ lệ cho độ hấp thụ quang tốt Khi thể tích mẫu tăng tỷ lệ độ hấp thụ quang lại giảm Điều cho thấy modifier có ảnh hưởng lớn đến kết phân tích phép đo Nếu tăng nồng độ cao độ hấp thụ quang giảm, ngược lại giảm độ hấp thụ quang giảm Chính đòi hỏi nhà phân tích phải khảo sát kỹ nồng độ tỷ lệ chất sử dụng đưa phương pháp phấp tích đạt hiệu cao 3.3 Đánh giá điều kiện quy trình 3.3.1 Khảo sát khoảng tuyến tính xây dựng đường chuẩn phép đo GF-AAS Cd 3.3.1.1 Khảo sát khoảng tuyến tính Nhóm nghiên cứu tiến hành khảo sát khoảng tuyến tính Cd cách: pha dãy chuẩn Cd HNO3 nồng độ 0.1% 1, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50(ppb) Với thành phần mẫu máu 0.05%Triton X-100, 2.5%NH4H2PO4, 0.15%Mg(NO3)2, 0.02%Pd(NO3)2, mẫu nước tiểu 0.1%Triton X-100, 2.5%NH4H2PO4, 0.15%Mg(NO3)2, 0.02%Pd(NO3)2 thu kết sau : Bảng 9: Kết khảo sát khoảng tuyến tính Nồng độ ppb 10 15 20 25 30 35 40 nguyên tố Cd Mẫu máu Abs RSD(%) 0.0301 6.94 0.1595 1.26 0.2991 0.54 0.4612 1.61 0.5998 1.55 0.6209 2.3 0.5983 3.51 0.582 2.5 0.5721 3.67 0.7 0.6 0.5 0.4 0.3 0.2 0.1 0 10 15 20 25 30 35 40 45 Hình 1: Khảo sát khoảng tuyến tính nguyên tố Cd máu Từ kết thực nghiệm nhóm nghiên cứu nhận thấy khoảng tuyến tính Cd từ LOQ20ppb Vì phân tích mẫu hàm lượng ngun tố cần phân tích nằm ngồi khoảng tuyến phải làm giàu mẫu pha lỗng mẫu để phân tích đảm bảo độ xác phép đo 3.3.1.2 Xây dựng đường chuẩn 3.3.1.2.1 Đường chuẩn Từ kết khảo sát khoảng tuyến tính nhóm nghiên cứu sử dụng phần mềm minitab 16.0 để xây dựng đường chuẩn Phương trình đường chuẩn Cd máu nước tiểu đây: Fitted Line Plot y = 0.003867 + 0.03001 x S R-Sq R-Sq(adj) 0.6 0.0068049 99.9% 99.9% 0.5 y 0.4 0.3 0.2 0.1 0.0 10 x 15 20 Hình 2: Đường chuẩn quy trình phân Hình 3: Píc Đường chuẩn quy trình tích Cd máu phân tích Cd máu Phương trình hồi quy đầy đủ đường chuẩn cho phân tích Cd máu xác định có dạng: y = (0.003867± 0.534305) + (0.03001 ± 0.000165) x Đánh giá phương trình hồi quy đường chuẩn Trong phương trình y = a + bx Kiểm tra a với giá trị theo tiêu chuẩn thống kê Fisher (chuẩn F) [2,3] Nếu xem a ≈ phương trình y = a + bx viết thành phương trình y = b’x giá trị b’ phương trình hồi quy đường chuẩn cho phân tích Cd máu Kết cho thấy Ftính = S’2/S2= 1.55041 ; Fchuẩn = F(0.95; 2; 3) = 9.5521 tức Ftính < Fchuẩn phương trình đường chuẩn phân tích Cd máu Có nghĩa sai khác giá trị a khơng có ý nghĩa thống kê Vì phương pháp phân tích khơng mắc sai số hệ thống 3.3.2 Giới hạn phát (LOD), giới hạn định lượng (LOQ) Để tính Sb nhóm nghiên cứu tiến hành đo mẫu trắng 10 lần Kết thu sau: Bảng 10: Kết xác định LOD, LOQ quy trình phân tích Cd máu Quy trình Lần đo(10) TB S LOD LOQ Mẫu blank nước cất Abs 0.00097 0.000149 0.0149 0.0497 Căn vào kết thu nhóm nghiên cứu nhận thấy giới hạn phát 0.01ppb giới hạn định lượng 0.0149ppb Từ bảng cho thấy giới hạn phát Cd máu 0.0149ppb Giới hạn định lượng Cd máu 0.0497ppb Như khoảng tuyến tính Cd quy trình phân tích Cd máu (LODmáu – 20)µg/L tương đương (0.0497 -20) µg/L 3.3.3 Đánh giá độ xác phương pháp 3.3.3.1 Kiểm tra độ chụm Độ chụm thay đổi theo nồng độ chất phân tích Nồng độ chất phân tích thấp kết dao động nhiều (khơng chụm) nghĩa RSD% hay CV% lớn Bảng 11: Kết khảo sát độ lặp lại độ thu hồi mẫu máu Cm Cc Giá trị µg/L Cm+c 0.16 µg/L 10 µg/L Cm+c 19µg/L Cm+c 1,167 0,065 5,612 10,227 0,264 2,588 20,122 1,155 5,74 Mẫu Rtb SD CV% Kết khảo sát cho thấy CV% biến động tuân theo định luật phân bố Gauuss: Ở điểm đầu (nồng độ thấp) điểm cuối (nồng độ cao) khoảng tuyến tính có hệ số biến thiên lớn điểm (nồng độ trung bình) khoảng tuyến tính sai số nhỏ Với mẫu máu điểm đầu sai số 5,612%, điểm cuối sai số 5.74%, điểm sai số nhỏ 2.588% Theo tiêu chuẩn đánh giá AOAC nồng độ chất phân tích từ 10-100ppb CV% cho phép < 15% [3] Nên sai số điểm đầu, điểm cuối hay điểm sai số nhỏ chấp nhận Điều chứng tỏ độ chụm phương pháp đạt yêu cầu 10 3.3.3.2 Kiểm tra độ Có nhiều cách để đánh giá độ phương pháp Nhóm nghiên cứu chọn cách mà sử dụng phổ biến giới dùng vật liệu chuẩn (còn gọi mẫu chuẩn) Kết phân tích mẫu CRM thể qua bảng sau: Bảng 12: Kết phân tích mẫu CRM Các mức nồng độ Kết thực nghiệm mẫu CRM Nồng độ thấp (µg/L) 1.217 Nồng độ trung bình Nồng độ cao RSD% Nồng độ CRM 4.15 Trung bình (µg/L) 1.19 Khoảng giá trị cho phép(µg/L) 0.948-1.42 2.889 0.84 2.93 2.35-3.52 6.495 2.14 6.4 5.12-7.68 (Lặp lại lần) Từ bảng nhóm nghiên cứu nhận thấy kết phân tích mẫu CRM cho giá trị nằm khoảng giá trị cho sát với giá trị trung bình mẫu CRM Ở mức nồng độ thấp mẫu máu giá trị thu 1.217µg/L xấp xỉ giá trị trung bình mẫu CRM (1.19µg/L) thuộc khoảng giá trị cho (0.948 – 1.42) µg/L Điều chứng tỏ phương pháp phân tích đảm bảo độ 3.4 Nêu quy trình xây dựng ứng dụng 3.4.1 Tổng hợp kết điều kiện đo Cd GF-AAS Qua kết thực nghiệm nhóm nghiên cứu chọn điều kiện tối ưu để đo Cd máy quang phổ hấp thụ nguyên tử GF-AAS hãng Perkin Elmer 900 đây: 3.4.1.1 Các điều kiện đo phổ (Thông số điều kiện) - Thông số máy: vạch phổ 228.8nm; khe đo 0.7nm cường độ đèn 83.33% (200mA) - Axit HNO3 - 0.1%; - Chất cải biến nền: 0.05%Triton X-100; 2.5%NH4H2PO4; 0.15%Mg(NO3)2; 0.02%Pd(NO3)2 - Thể tích mẫu: 8µl; Thể tích modifier: 2µl 3.4.1.2 Tổng hợp điều kiện nguyển tử hóa mẫu Bảng 13: Tổng kết điều kiện ngun tử hóa quy trình phân tích Cd mẫu máu mẫu nước tiểu GF – AAS TT Giai đoạn sấy mẫu Mẫu máu Nhiệt độ C Thời gian tăng nhiệt (s) 90 400 10 550 10 1900 2000 (Lặp lại lần) Giai đoạn tro hóa Giai đoạn nguyên tử hóa Giai đoạn làm cuvet 11 Thời gian giữ nhiệt (s) 20 10 3 3.4.2 Nêu quy trình Trên sở khảo sát tất yếu tố cần thiết để đảm bảo cho quy trình phân tích nhóm nghiên cứu tóm tắt quy trình phân tích Cd máu 3.4.2.1 Quy trình phân tích Cd mẫu máu * Chuẩn bị dụng cụ hóa chất Được chuẩn bị cụ thể phần thiết bị, dụng cụ, hóa chất * Chuẩn bị dung dịch để phân tích mẫu - Dung dịch modiffier: 0.05%Triton X-100, 2.5%NH4H2PO4 , 0.15%Mg(NO3)2, 0.02%Pd(NO3)2 - Dung dịch rửa 0.1% Triton X-100, 0.1%HNO3 - Pha dung dịch chuẩn: Chuẩn pha HNO3 0.1% nồng độ Cd 20µg/L - Xử lý mẫu: Mẫu máu lấy từ tủ âm sâu giã đông cách để ngăn mát tủ lạnh thường sau giã đông đưa ngồi để để phân tích Trước phân tích phải lắc 0.9 ml modifier + 0.1 ml mẫu lắc đưa vào máy phân tích - Điều kiện để phân tích ▪ Kỹ thuật lò graphit Ngun tố: Cd; Bước sóng: 228.8nm; Khe đo: 0.7nm; Tín hiệu: AA-BG; Cường độ đèn: 200mA; Thể tích mẫu: 8µl; Thể tích modifier: 2µl  Thơng tin đường chuẩn: + điểm với mức nồng độ: 1ppb; 5ppb; 10 ppb; 15 ppb; 20 ppb Chương trình ngun tử hóa mẫu Bảng 14: Bảng chương trình nhiệt độ ngun tử hóa Thứ tự giai đoạn Giai đoạn sấy mẫu Giai đoạn tro hóa Giai đoạn nguyên tử hóa Giai đoạn làm cuvet Nhiệt độ 0C Thời gian tăng nhiệt (s) Thời gian giữ nhiệt (s) 90 400 10 20 10 550 1900 2000 10 1 3 Từ quy trình nhóm nghiên cứu có số nhận xét sau: Quy trình có giới hạn phát giới hạn định lượng tương đương chí thấp số quy trình phân tích số tác giả khác Như nghiên cứu Đặng Minh Ngọc cộng giới hạn phát 0.082µg/L, P Olmedol [6] (2010)(LOD/LOQ 0.03/0.09; nhóm nghiên cứu 0.0149/0.00497 quy trình phân tích mẫu máu 0.0194/0.0648 quy trình phân tích Cd mẫu nước tiểu So sánh quy trình phân tích Cd máu nước tiểu với phương pháp NIOSH (Mỹ) 8005, 8310 nhóm nghiên cứu nhận thấy quy trình phân tích rút ngắn nhiều Nếu 12 phương pháp 8005, 8310 NIOSH phá mẫu nhiều (lắc mẫu 12h), thể tích mẫu lớn (50ml nước tiểu), tốn nhiều hóa chất (mỗi mẫu máu cho 10ml HNO 3) Quy trình nhóm nghiên cứu khắc phục nhược điểm Hiện nay, Việt Nam quy trình phân tích kim loại mơi trường, thực phẩm phổ biến Tuy nhiên, quy trình phân tích kim loại dịch sinh học nhiều hạn chế Có thể thiết bị máy móc cũ – phương pháp cực phổ xung vi phân Đặng Minh Ngọc Cũng có trường hợp sử dụng thiết bị đại xong quy trình xử lý mẫu phức tạp – theo kiểu truyền thống – vơ hóa hoàn toàn axit bếp ủ, nhiều thời gian, sai số lớn Quy trình mà nhóm nghiên cứu đưa khắc phục hạn chế Giới hạn phát hiện, giới hạn định lượng tương đương với số phương pháp giới dùng Quy trình thực đơn giản, sai số ít, đặc biệt xử lý mẫu khơng nhiều thời gian trước Quy trình nhóm nghiên cứu xây dựng ứng dựng máy hệ tương đương hệ hãng Đối với hãng khác cần máy có điều kiện tính kỹ thuật tương tự (ứng dụng) đại tốt dùng 3.4.3 Ứng dụng quy trình Kết phân tích Cd máu nước tiểu người lao động (NLĐ) Nhóm nghiên cứu lấy ngẫu nhiên 35 mẫu máu 35 NLĐ làm việc Tổng Liên Đoàn Lao động Việt Nam áp dụng quy trình xây dựng phân tích cho kết sau: Bảng 15: Kết phân tích Cd mẫu máu TT Nồng độ Cd máu số lượng Nồng độ Cd (n) µg/L 35 3.599±0.975 TCYTTG < 5µg/L TCYT Việt Số mẫu vượt Nam TCCP - Áp dụng quy trình xây dựng phân tích mẫu máu 35 cán nhân viên làm việc Tổng Liên đoàn Lao động Việt Nam Kết cho thấy nồng độ Cd trung bình mẫu máu 35 đối tượng 3.599±0.975 µg/L Nồng độ trung bình 35 đối tương nằm giới hạn cho phép < µg/L (Tiêu chuẩn y tế giới) Xét riêng đối tượng khơng có đối tượng có nồng độ vượt ngưỡng cho phép Hồn thiện quy trình Sau sử dụng quy trình xây dựng để phân tích mẫu thực, nhóm nghiên cứu nhận thấy quy trình ổn định, đảm bảo kết xác Vì trước chạy mẫu thực nhóm nghiên cứu 13 chạy mẫu chuẩn kiểm tra độ tin cậy quy trình Chính quy trình dự thảo ban đầu khơng cần thay đổi sau nhóm nghiên cứu áp dụng thực tế KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 4.1 Kết luận Qua thời gian nghiên cứu nhóm thực đạt kết cụ thể thể sau: - Khoảng tuyến tính: (0.0497 -20) µg/L - Giới hạn phát hiện: 0.0149 µg/L - Giới hạn định lượng: 0.0497 µg/L - Quy trình đảm bảo tính ổn định, độ xác 85% Đánh giá: LOD, LOQ thấp số tác giả khác nghiên cứu, thời gian phân tích 63s, độ bền cuvet nhờ quy trình nhiệt độ nguyên tử hóa mẫu giảm * Áp dụng quy trình xây dựng được: phân tích 35 mẫu máu 35 đối tượng cán nhân viên làm việc Tổng Liên Đoàn Việt Nam cho thấy nồng Cd máu đối tượng nghiên cứu không vượt giới hạn cho phép 4.2 Kiến nghị Tiếp tục nghiên cứu, hoàn thiện áp dụng rộng rãi nghiên cứu làm đối tượng người lao động có tiếp xúc với Cd TÀI LIỆU THAM KHẢO Phạm Luận (2006), Phương pháp phân tích phổ nguyên tử, NXB Đại học quốc gia Hà Nội Tạ Thị Thảo (2010), Thống kê hóa phân tích, Giáo trình mơn học, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên Đại học Quốc Gia Hà Nôi Viện kiểm nghiện an toàn vệ sinh Thực phẩm Quốc Gia (2010), Thẩm định phương pháp phân tích hóa học vi sinh vật học, NXB Khoa học Kỹ Thuật Ivanenko N B (2012), Application of Zeeman graphite furnace atomic absorption spectrometry with high-frequency modulation polarization for the direct determination of aluminum, beryllium, cadmium, chromium, mercury, manganese, nickel, lead, and thallium in human blood Arch Environ Contam Toxicol, 63(3), 299-308 Nunes JA, Batista BL, Rodrigues JL, Caldas NM, Neto JA, Barbosa F Jr A simple method based on ICP-MS for estimation of background levels of arsenic, cadmium, copper, manganese, nickel, lead, and selenium in blood of the Brazilian population J Toxicol Environ Health A 2010;73(13-14):878-87 14 Olmedo P, Pla A, Hernández AF, López-Guarnido O, Rodrigo L, Gil F (2010), Validation of a method to quantify chromium, cadmium, manganese, nickel and lead in human whole blood, urine, saliva and hair samples by electrother mal atomic absorption spectrometry, Anal Chim Acta 659,7- 60 www.ncbi.nlm.nih.gov › NCBI › Literature › Bookshel 15 ... 3.4.2 Nêu quy trình Trên sở khảo sát tất yếu tố cần thiết để đảm bảo cho quy trình phân tích nhóm nghiên cứu tóm tắt quy trình phân tích Cd máu 3.4.2.1 Quy trình phân tích Cd mẫu máu * Chuẩn bị... 0.0149/0.00497 quy trình phân tích mẫu máu 0.0194/0.0648 quy trình phân tích Cd mẫu nước tiểu So sánh quy trình phân tích Cd máu nước tiểu với phương pháp NIOSH (Mỹ) 8005, 8310 nhóm nghiên cứu nhận thấy quy. .. 20 Hình 2: Đường chuẩn quy trình phân Hình 3: Píc Đường chuẩn quy trình tích Cd máu phân tích Cd máu Phương trình hồi quy đầy đủ đường chuẩn cho phân tích Cd máu xác định có dạng: y = (0.003867±