Nhân sâm (Panax ginseng) là một loại thảo mộc có giá trị cao ở nhiều vùng khác nhau của Trung Quốc, Hàn Quốc, Bắc Mỹ và các nước khác. Trong các nghiên cứu gần đây, nhân sâm đã được chứng minh là có nhiều tính chất sinh học và dược lý khác nhau, như thuốc chống ung thư, điều chỉnh miễn dịch, kháng sinh, chống viêm, chống oxy hóa, chống nôn mửa cũng như các lợi ích sức khoẻ khác Liên quan đến sự có mặt của các hợp chất như saponin, alkaloid, polysaccharide, polyacetylene, amino acid tự do, hợp chất phenol và những hợp chất dễ bay hơi. Được sử dụng như là một thuốc bổ chung trong y học cổ truyền phương Đông Nhân sâm (Panax ginseng) là một loại thảo mộc có giá trị cao ở nhiều vùng khác nhau của Trung Quốc, Hàn Quốc, Bắc Mỹ và các nước khác. Trong các nghiên cứu gần đây, nhân sâm đã được chứng minh là có nhiều tính chất sinh học và dược lý khác nhau, như thuốc chống ung thư, điều chỉnh miễn dịch, kháng sinh, chống viêm, chống oxy hóa, chống nôn mửa cũng như các lợi ích sức khoẻ khác Liên quan đến sự có mặt của các hợp chất như saponin, alkaloid, polysaccharide, polyacetylene, amino acid tự do, hợp chất phenol và những hợp chất dễ bay hơi. Được sử dụng như là một thuốc bổ chung trong y học cổ truyền phương Đông Nhân sâm (Panax ginseng) là một loại thảo mộc có giá trị cao ở nhiều vùng khác nhau của Trung Quốc, Hàn Quốc, Bắc Mỹ và các nước khác. Trong các nghiên cứu gần đây, nhân sâm đã được chứng minh là có nhiều tính chất sinh học và dược lý khác nhau, như thuốc chống ung thư, điều chỉnh miễn dịch, kháng sinh, chống viêm, chống oxy hóa, chống nôn mửa cũng như các lợi ích sức khoẻ khác Liên quan đến sự có mặt của các hợp chất như saponin, alkaloid, polysaccharide, polyacetylene, amino acid tự do, hợp chất phenol và những hợp chất dễ bay hơi. Được sử dụng như là một thuốc bổ chung trong y học cổ truyền phương Đông
Đại học Quốc gia Thành phố Hồ Chí Minh Đại học Bách Khoa Khoa Kỹ thuật Hóa học BÁO CÁO TIỂU LUẬN MÔN: VI SINH VẬT ĐỀ TÀI: HỢP CHẤT KHÁNG NẤM TỪ STREPTOMYCES SP.3265 - KHÁNG NẤM GÂY BỆNH CHO THỰC VẬT GVHD: Cơ Phan Thị Huyền Nhóm 8: Võ Phi Long 1511828 Nguyễn Thị Lẹ 1511712 Nguyễn Thị Hương Huệ 1511202 Ngô An Mai Phương Nội dung báo cáo Đặt vấn đề Các phương pháp sử dụng Nuôi cấy Thu nhận hợp chất chống nấm Xác định cấu trúc hợp chất chống nấm Hoạt tính kháng nấm Kết luận Đặt vấn đề Nhân Sâm Đặt vấn đề Nhân sâm (Panax ginseng) loại thảo mộc có giá trị cao nhiều vùng khác Trung Quốc, Hàn Quốc, Bắc Mỹ nước khác Trong nghiên cứu gần đây, nhân sâm chứng minh có nhiều tính chất sinh học dược lý khác nhau, thuốc chống ung thư, điều chỉnh miễn dịch, kháng sinh, chống viêm, chống oxy hóa, chống nơn mửa lợi ích sức khoẻ khác Liên quan đến có mặt hợp chất saponin, alkaloid, polysaccharide, polyacetylene, amino acid tự do, hợp chất phenol hợp chất dễ bay Được sử dụng thuốc bổ chung y học cổ truyền phương Đông Đặt vấn đề Sản lượng nhân sâm bị hạn chế nhiều yếu tố, có bệnh thối rễ bệnh úng nước q trình trồng tích trữ trước tiêu thụ Một số tác nhân gây bệnh là: Rhizoctonia solani, Botrytis cinerea Colletotrichum gloeosporioides Rhizoctonia solani: Gây bệnh úng nước Điều hòa hợp chất kháng nấm iprodione, benomyl, fentin hydroxide, benodianil, difenoconazole pencycuron Botrytis cinerea: Gây bệnh thối rễ nguyên nhân đa số tổn thất sau thu hoạch nhân sâm Việc kiểm soát B cinerea thường thực cách sử dụng thuốc trừ nấm Tuy nhiên sử dụng thuốc kháng nấm dấy lên lo ngại người tiêu dùng, xuất hiện tượng kháng thuốc đòi hỏi cần có phương pháp để kiểm soát bệnh ◦ ◦ Khống chế sinh học cách hiệu thân thiện với môi trường để tránh tình trạng bệnh thối rễ úng nước nhân sâm 1 Đặt vấn đề Xác định Streptomyces sp.A3265 thể hoạt tính kháng nấm mạnh nhiều loại nấm gây bệnh thực vật Hai hợp chất chống nấm Các hợp chất biểu hoạt tính kháng nấm Phân lập mạnh nhiều loại nấm gây bệnh thực vật chống lại vi khuẩn Guanidylfungin A Methyl Guanidylfungin A Các phương pháp sử dụng Sắc ký cột Diaion HP-20 Sephadex LH-20 Sắc ký lỏng trung áp (MPLC) sắc ký lỏng hiệu cao (HPLC) Phương pháp phân tích quang phổ ◦ Phương pháp khổi phổ (Mass spectrometry – MS) ◦ Phương pháp phổ cộng hưởng từ hạt nhân (Nuclear magnetic resonance – NMR) Phương pháp khối phổ (Mass Spectrometry-MS) phương pháp nghiên cứu chất cách đo, phân tích xác khối lượng phân tử chất dựa chuyển động ion nguyên tử hay ion phân tử điện trường từ trường định Tỉ số khối lượng điện tích (m/z) có ảnh hưởng lớn chuyển động ion Nếu biết điện tích ion ta dễ dàng xác định khối lượng ion Như vậy, nghiên cứu khối phổ chất nào, trước tiên phải chuyển sang trạng thái bay hơi, sau ion hố phương pháp thích hợp 3 Cultivation Streptomyces sp A3265 nuôi đĩa môi trường thạch Bennett’s biến đổi vòng ngày Nhân giống cấp 1: Lấy chủng mơi trường thạch cấy vào hai bình erlen L chứa 200 mL môi trường nhân giống Thành phần mơi trường: 20g glucose, 10g tinh bột hòa tan, 1g dịch chiết thịt bò, 4g dịch chiết nấm men, 2g NaCl, 0.05g KH2PO4 25g bột đậu nành 1L nước cất (pH=7.0) Nuôi 27°C ngày máy lắc vòng tốc độ 120rpm/min Nhân giống cấp 2: Chuẩn bị 15 bình erlen chứa 200mL mơi trường nhân giống, hút vào bình 2mL mơi trường nhân giống cấp ° Lên men 27 C ngày máy lắc vòng tốc độ 120rpm/min Tách hợp chất chống nấm Dịch nuôi cấy Streptomyces sp.A3265 Ly tâm 6000 vòng 20 phút phần tủa phần dịch Chiết với acetone Sắc ký cột Diaion HP-20 Cơ đặc chân khơng Sắc kí cột sephadex LH-20 rửa giải với methanol 70% phần tủa Sắc kí lỏng trung áp (MPLC) Rửa giải với methanol 40-100% Đem tủa thu acetonitrile 30% phần dịch Tách hợp chất chống nấm Phần Phần dịch dịch Sắc Sắc ký ký điều điều chế chế lỏng lỏng hiệu hiệu năng cao cao với với cột cột C18 C18 Rửa giải với acetonitrile 33% Sắc Sắc ký ký điều điều chế chế lỏng lỏng hiệu hiệu năng Rửa giải với 58% cao cao với với cột cột C18 C18 methanol+0,04%TFA Hợp Hợp chất chất A3265-2 A3265-2 Xác định cấu trúc chất chống nấm Phân tích khối phổ (ESI-MS) quét điện tích dương để xác định trọng lượng phân tử: thu peak m / z 1130.4[M + H] + 1152.3 + [M + Na] hợp chất A3265-1 Trọng lượng phân tử A3265-1 1129 Tương tự, thu phổ khối lượng hợp chất A3265+ hình 2.2 với peak m/z 1144.4[M + H] 1166.3 [M + Na] + Trọng lượng phân tử A3265-2 1143 Hình 2.2: Electrospray ionisation mass spectra of compounds A3265-2 in positive mode Hình 2.1: Electrospray ionisation mass spectra of compounds A3265-1 in positive mode 5 Xác định cấu trúc hợp chất • Sử dụng phương pháp phổ cộng hưởng từ hạt nhân • Phổ cộng hưởng từ hạt nhân proton (¹H-NMR) hợp chất A3265-1 thể tín hiệu cho nhóm chức sau : 4 nhóm olefinic methine δ 5,55, 5,44, 5,33 5,32 Nhiều nhóm oxygenated methine δ 3.5-4.2 Một nhóm N-methyl δ 2.82 Chín nhóm methyl δ 0.5-1,5 Trong đó: δ độ chuyển dịch hóa học Hình 3: H-NMR spectra of compounds A3265-1 • Phổ carbon 13-NMR cung cấp thông tin trực tiếp sườn carbon phân tử • Trong phổ cộng hưởng từ hạt nhân cacbon ( 13 C-NMR) A3265-1 có tổng cộng 58 carbon, bao gồm : ba carbonyl carbon δ 177,0, 170,5, 169,1; carbon guanidyltại δ 158,3 sáu olefinic carbon δ 120-140 hemiketal carbon δ 102,9 carbon oxy hoá 60-85; methylene methine carbons at δ 20-60 chín methyl carbon δ 10-18 Hình 4:13C-NMR spectra of compounds A3265-1 and A3265-2 in CD3OD Những Những dữ liệu liệu quang quang phổ phổ này tương tương đồng đồng với với dữ liệu liệu của guanidylfungin guanidylfungin A A guanidylfungin guanidylfungin A A hợp hợp chất chất A3265-1 A3265-1 là • • • • • • Phổ 1H-NMR hợp chất A3265-2 tương tự hợp chất A3265-1, Ngoại trừ có mặt nhóm methoxyl δ 3,98 dễ dàng trao đổi dung mơi -OCD Trong phổ 13C-NMR hợp chất A3265-2, 59 cacbon quan sát Phổ 13C-NMR A3265-2 giống với hợp chất A3265-1 Ngoại trừ, có mặt methoxyl carbon δ 54,9 dễ dàng trao đổi dung môi -OCD hợp chất A3265-2 methyl guanidylfungin A Cấu trúc hóa học hai hợp chất đềiu xác định nhờ 2D NMR Hoạt động kháng nấm Hợp chất A3265-1 thể hoạt động kháng nấm mạnh với: F oxysporum R solani, với nồng độ ức chế tối thiểu (MICs) 5,0 -10 μg Hợp chất A3265-2 cho thấy hoạt động kháng nấm đáng kể đối với: F oxysporum A panax, với giá trị MICs 2,5 μg Các hợp chất có hoạt tính khánh vi khuẩn Gram dương: Bacillus subtilis, Escherichia coli, and Staphylococcus aureus với MICs khoảng ~ 20 μg Chủng Chủng Streptomyces Streptomyces A3265 A3265 sản sản xuất xuất hai hai kháng kháng sinh sinh phổ phổ rộng rộng vừa vừa kháng kháng nấm nấm và kháng kháng khuẩn khuẩn Hợp Hợp chất chất A3265-2 A3265-2 có có tính tính kháng kháng nấm nấm cao cao hoạt hoạt động động hơn so so với với hợp hợp chất chất A3265-1 A3265-1 7 Kết luận ◦ Chủng Chủng vi vi khuẩn khuẩn Streptomyces Streptomyces sp.A3265 sp.A3265 được phát phát hiện là có có hoạt hoạt tính tính kháng kháng nấm nấm chống chống lại lại nhiều nhiều loại loại nấm nấm gây gây bệnh bệnh cho cho thực thực vật vật như Rhizoctonia Rhizoctonia solani, solani, Botrytis Botrytis cinerea cinerea và Colletotrichum Colletotrichum gloeosporioides gloeosporioides Nghiên Nghiên cứu cứu tiến tiến hành hành nuôi nuôi giống giống Streptomyces Streptomyces sp.A3265 sp.A3265 và thu thu nhận nhận những hợp hợp chất chất kháng kháng nấm nấm bằng các phương phương pháp pháp sắc sắc ký ký khác khác nhau Những Những hợp hợp chất chất này sau sau khi được phân phân tích tích cấu cấu trúc trúc bằng các phương phương pháp pháp quang quang phổ phổ (MS (MS và NMR) NMR) thì được xác xác định định là guanidylfungin guanidylfungin A A và methyl methyl guanidylfungin guanidylfungin A A Chúng Chúng vừa vừa thể thể hiện hoạt hoạt tính tính kháng kháng nấm nấm vừa vừa có có hoạt hoạt tính tính kháng kháng khuẩn khuẩn cao cao ... sp.A3265 thể hoạt tính kháng nấm mạnh nhiều loại nấm gây bệnh thực vật Hai hợp chất chống nấm Các hợp chất biểu hoạt tính kháng nấm Phân lập mạnh nhiều loại nấm gây bệnh thực vật chống lại vi khuẩn... phát phát hiện là có có hoạt hoạt tính tính kháng kháng nấm nấm chống chống lại lại nhiều nhiều loại loại nấm nấm gây gây bệnh bệnh cho cho thực thực vật vật như Rhizoctonia Rhizoctonia solani, solani,... Chủng Chủng Streptomyces Streptomyces A3265 A3265 sản sản xuất xuất hai hai kháng kháng sinh sinh phổ phổ rộng rộng vừa vừa kháng kháng nấm nấm và kháng kháng khuẩn khuẩn Hợp Hợp chất chất A3265-2