ẢNH HƯỞNG ĐỐI KHÁNG VÀ ỨC CHẾ CỦA B.SUBTILIS ĐỐI VỚI NẤM GÂY BỆNH TRÊN THỰC VẬT

Bài thuyết trình Mơn: Kỹ thuật gen Khoa Cơng nghệ Sinh học Viện Đại học Mở Hà Nội GVHD: TS.Nguyễn Huy Hồng Nhóm Lớp 10.01 Nguyễn Thị Lương Trần Thị Hạnh Trần Thủy Tiên Trịnh Công Sơn Nguyễn Anh Tiến Nguyễn Hà Nhung Trần Thị Hằng Mục lục A Khái quát vi khuẩn B.subtilis B CẤU TẠO VI KHUẨN C TÍNH ĐỐIKHÁNG CỦA CHÚNG D NGUYÊN LiỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP E KẾT QuẢ F THẢO LUẬN • • • : 1872 Bacillus subtilis Ferdinand Cohn- cộng Robert Koch mô tả đặt tên 1949 – 1957: Henrry, Albot cộng tách chủng khiết Bacillus subtilis 1959 : Công nh nghiên u a Work cho thấy B subtilis ng men tương i n nh có khả y phân glucid, lipid, protid : + Phần lớn chúng tồn đất, thảm mùn thực vật Thông thường đất trồng trọt chứa khoảng 10 - 100 triệu CFU/g + Tồn dày, ruột, chúng chịu pH thấp B subtilis thuộc : Ngành (phylum): Firmicutes Lớp (class): Bacilli Bộ (order) Eubacteriales Họ family) Bacillaceae Giống (genus): Bacillus Lồi Bacillus subtilis H Vk bắt màu Gram+ (tím) 1.Vi khuẩn gram (+), khơng sinh bệnh Hình que vi khuẩn sinh nội bào tử hiếu khí VK có khả di động Kích thước 0,5 - 0,8 µm x 1,5 - µm pH = 7,0 - 7,4 Nhiệt độ tối ưu 37 o C H VK B.subtilis bào tử Là đối tượng nghiên cứu nhiều hình thái khuẩn lạc VK Gram (+) Trên môi trường thạch đĩa khuẩn lạc phát triển theo dạng tròn, vết nhăn màu nâu rìa cưa khơng đều, có tâm sẫm màu, màu vàng xám, đường kính – mm Sau - ngày bề mặt nhăn nheo, màu nâu Khuẩn lạc B.subtilis điã thạch Kl sau 48h Kl sau 96h  • • • •  Loại vi khuẩn kháng lại nấm sinh bệnh cách nh tranh Thay i ch ch Trung a m gây nh (nơi ở, dinh dưỡng) n a, tiết enzyme thủy phân ngoại bào n ch a thê t chu c tô nấm i Đặc điểm kháng sinh : – B.subtilis sản sinh kháng sinh có chất lipopeptide – Khối lượng phân tử nhỏ 2000 Dalton – Tổng hợp khơng ribosome.( non-ribosome) Kháng sinh Tính chất Tác động nhóm chất có hoạt tính sinh học, chất lipopeptid -Kết hợp với iturin trở thành hợp chất diệt nấm - Làm thủng vách tế bào tác nhân gây bệnh bào tử chúng - Bản chất lipopeptit dk chiết từ môi trường nuôi cấy B.subtillis - Tác động lên màng tb chất, làm tan màng tạo lỗ thủng để làm tính thẩm thấu chọn lọc màng Bản chất lipopeptide - Có khả diệt nấm surfactin iturin - Chịu nhiệt cao, không hoạt tính hấp autoclave pH -cách gắn với màng nguyên sinh chất làm ảnh hưởng đến hệ thống vận chuyển chất có trọng lượng phân tử nhỏ hệ thống trao đổi proton - bacteriocin bền, - Đối kháng mạnh với vi khuẩn gram dương kể tế bào sinh dưỡng lẫn bào tử • • • • • • B.subtilis RB14 kháng nấm Rihzotomia, tác nhân gây úng thối cà chua Phần trăm bị bệnh thiếu B.subtilis RB14 85.2% Khi có RB14 tỉ lệ bệnh giảm 16.7%, 27.8%, 11.1% Trên canh trường NB TSB, B.subtilis cho thấy ảnh hưởng kháng lại với Peronophythora litchi B.subtilis YM 10-20 ngăn ngừa nảy mầm bào tử Penicillin roqueforti Hiệu suất nảy mầm Penicillin roqueforti sau 8h ủ khơng có mặt B.subtilis YM10-20 84% Ở tỷ lệ dịch 10, 25, 50% YM10-20, làm giảm tỷ lệ từ 7%, 1% 0% B.subtilis 6051 bảo vệ rễ Arabidopsis khỏi nhiễm vi khuẩn Pseudomonas syringae tomato DC 3000 điều kiện ống nghiệm đất màu Đáng ý Bacillus spp.3 B.subtilis CEI sản sinh dịch ngoại bào có hoạt tính kháng nấm cao nhất, 78 60% B.subtilis CEI cho thấy khả ngăn cản phát F.verticillioides sản phẩm fumonisin điều kiện in vitro Bacillus dòng PY-1 đc phát tính chất hóa sinh, t/c vật lý nhờ phân tích trình tự 16S rDNA biểu khả kháng nhiều loại nấm bệnh thông thường đk invitro 1/ Antagonistic effect of B.subtilis isolates (invitro) (Phương pháp)  Cấy bình rung: - Môi trường nước thịt : ( peptone 5g/L, nước chiết thịt bò,3gL-1) - Bình Erlenmeyer 500ml, chứa 10g peptone; 10g glucose; 1g KH2PO4,, 0,5g MgSO4.7H2O nước cất - pH : 6.8 - Thời gian (16h) - Nhiệt độ : 30 C - Lắc: 200 vòng/phút - Thu sinh khối sau 24h, ly tâm 5590xg 30’ - Lọc TB tự (đường kính lỗ 0,22 m) - Hai giếng (đường kính 5mm) tạo đĩa (PDA) - Các giếng đổ 200 l dịch ngoại bào Các nấm thí nghiệm đặt vị trí trung tâm đĩa Các đĩa ni vòng 3-7 ngày 30 C Đo vùng ức chế - Lấy kết : đo mật độ quang học 550nm, thu số lượng, khối lượng chất kháng nấm Phân tích số liệu dựa hệ thống SAS 2/ Antagonistic effect of B.subtilis isolate B7 (in vivo) Nấm chuẩn bị F.oxysporum R.solani Bình ni để khơng rung Bóng tối 30 C tuần.Thể sợi nấm bề mặt tách khoảng 894g vòng 2’ Cấy nấm vào đất theo tỉ lệ lọ nấm tinh ~20ml, ngày trướckhi trồng cà chua B.subtilis B7 nuôi môi trường nước thịt nuôi quađêm 30 C, lắc liên tục 200rpm 1ml môi trường chuyển sang 500 ml bình Erlenmeyer, để qua đêm 30 C lắc liên tục 200rpm Dịch lỏng đem ly tâm 894g 10’ C , viên tế bào rửa dung dịch muối (0,85%NaCl, pH 7), sau đem ly tâm lần điều kiện Thực đo khối lượng tươi khối lượng khô mầm rễ thời gian Dữ liệu thu đem phân tích theo hệ thống SAS 3/ Phương pháp phân tích HPLC (Phân tách hợp chất kháng nấm từ B.subtilis) • Khuẩn lạc B.subtilis nuôi môi trường dinh dưỡng, để qua đêm • Nhiệt độ 30oC Lắc 200rpm • Sau 24h sinh khối đem ly tâm 894g/15min 20oC • Dịch ngoại bào lọc vô trùng (0.22μm) • Điều chỉnh pH=HCl Phần kết tủa thu lại, đem hòa tan hỗn hợp methanol: nước(50:50v/v) pH 8, lọc qua màng (0.22μm) Giữ -20oC đến phân tích xong Phương pháp phân tích HPLC • Tiêm 50μl dịch ngoại bào B.subtilis vào zorbax eclipse cột XDB- C18, 4,6x150mm,5μm( Agilent technologies,USA) đo 214nm • Tốc độ rửa trơi 0,9cm³/min • Hỗn hợp methanol: nước(50:50 v/v) thời gian từ 0-20 phút, (80:20 v/v) từ 20-60 phút, (100:0 v/v) từ 60-65 phút lặp lại(50:50 v/v) 65-75 H Phân tích HPLC vs B.subtilis B7 phát Iturin phút ( xhien peaks ) E/ Kết  Antagonistic effect (ảnh hưởng đối kháng) Chủng B1 có ảnh hưởng lớn tới R.solani dâu tây (R2), khoai tây(R3) Helminthosporum , tác động đến F.oxysporum  Chủng B8, B7,B11 có tác dụng đối kháng khơng khác biệt, chủng ảnh hưởng nhiều nhất, B1 B4 ức chế nấm F.oxysporum phát triển  • Khi ni bình lắc có chứa mơi trường với chủng khiết B subtilis phân lập, bình ủ 30 độ celcius 16h • Đường cong tăng trưởng điển hình theo dõi bình lắc cách đo mật độ quang học hàm thời gian Tất đường cong bắt đầu với pha kéo dài khoảng Pha theo sau pha theo cấp số nhân, mật độ quang học tăng lên đặn theo thời gian thể tốc độ tăng trưởng liên tục • Pha cần bắt đầu vào cuối pha sinh trưởng , sau mơi trường bước vào giai đoạn suy vong  Inhibitory effect -Chủng B8, B10, B14, B7, B4, B1, B11 B13 có hiệu lực đối kháng R.solani tách từ dâu tây(R2) B8, B7, B10, B14, B11, B4, B13 B1 ức chế theo thứ tự giảm dần phát triển nấm R.solanni thu từ khoai tây(R3) -Dịch thu từ B7, B14, B10, B4, B3 cho nhiều ảnh hưởng ức chế hơ Helminthosporium spp so với B1, B5, B8, B13 -Dịch thu từ B7, B14, B10, B4, B3 cho nhiều hiệu Helminthosporium spp so với B1, B5, B8, B13 - Dịch ngoại bào chủng B7, B10, B4, B14 không khác biệt chúng chủng hiệu lực sau đến B1,B3,B8,B13 ảnh hưởng ức chế Alternaria spp cà chua +Chủng B.subtilis B7 có hiệu làm giảm tỷ lệ nguy mắc bệnh nghiêm trọng nhiễm nấm Fusarium R.solani, kích thích phát triển cà chua +Khối lượng tươi thân cà chua lơ thí nghiệm cao so với đối chứng Chiều cao cây, số lượng lá/cây lơ xử lí với dịch ngoại bào cao so với đối chứng Fig Cà chua nhiễm Fusarium Fig Cà chua nhiễm R.solani Thảo luận • Các nghiên cứu B.subtilis đem đến nhiều ý tưởng ứng dụng vk đời sống  Sử dụng chế phẩm có nguồn gốc từ vi khuẩn đối kháng để diệt nấm gây hại trồng VD1996, Asaka Shoda cho B.subtilis RB14 có tác dụngức chế chống lại chết rạp cà chua R.solani  Sư ng ngành công nghê sinh c n t axit amin quan ng như: lysine, valine, tyrozine, proline, threonine, isoleusine, aspastic…  1999, Marten cho B.subtilis B2 ngăn chặn tác nhân gây bệnh truyền qua rễ thực vật B B2 subtilis sử dụng để sản xuất loại thực phẩm có nguồn gốc từ DNJ thực phẩm chức cho bệnh nhân tiểu đường Các nghiên cứu ứng dụng liên quan vi khuẩn B.subtilis  B.subtilis B2: - Ức chế mạnh mẽ tới α-glucosidase Bản chất kháng sinh 1-deoxynojirimycin (DNJ) đường imino với trọng lượng phân tử 163 Dalton  Phương pháp: - HPLC (TSKgel amit-80, CH3CN: H2O) phân tích hợp chất B2 Bacillus subtilis Thẩm tách màng, than hoạt tính, sắc ký CM-Sepharose, n sắc ký lớp mỏng (TLC), khối phổ (MS), cộng hưởng từ hạt nhân (NMR) B.Subtilis RB14 • RB14 Bacillus subtilis, cho thấy hoạt động kháng sinh chống lại phytopathogens cách sản xuất kháng sinh iturin A surfactin Iturin A, lipopeptide,có đặc tính kháng nấm mạnh mẽ độc tính với động vật có vú thấp • Bacillus subtilis RB14-C chống lại Rhizoctonia solani lây nhiễm cà chua cách phủ quanh rễ sản xuất iturin Sự tích hợp RB14-C flutolanil giảm số lượng flutolanil, với hiệu làm giảm xuất bệnh • Ngiên cứu chế phẩm sinh học từ vi khuẩn có tác dụng diệt nấm • Tế bào chủng vi khuẩn đối kháng Burkholderia, Pseudomonas Bacillus tác dụng tích cực đến sinh trưởng rau diếp cà chua Ko ảnh hưởng tốc độ nảy mầm phát triển rễ, ( ni nhà lưới) • Trong điều kiện in vitro môi trường thạch, dịch ngoại bào chủng vi khuẩn đối kháng diệt 70-90% nấm F oxysporum, diệt 75-81% nấm R solani A R.solani hại rau diếp B Rau diếp nhiễm nấm R solani xử với dịch ngoại bòa chủng vi khuẩn đối kháng chọn lọc C Rau diếp nhiễm nấm R.solani xử với tế bào chủng vi khuẩn đối kháng chọn lọc Tài liệu tham khảo: • Asian Network for scientific Information • http//:TextbookofBaterial.com/Genus Bacillus • The Korean Society of Biology • Việncôngnghệsinhhọc/tài liệu tham khảo Thanks for your listening