NGHIÊN CỨU SÀNG LỌC MỘT SỐ THỰC VẬT CÓ KHẢ NĂNG LÀM TRẮNG DA

quả được coi là nguồn nguyên liệu tự nhiên quý trong việc làm đẹp da, loại bỏ vết thâm nám, tàn nhang trên da. Chính vì vậy, việc ứng dụng các hoạt chất từ thiên nhiên vào sản phẩm mỹ phẩm đang là xu hướng được ưa chuộng và ngày càng phát triển. Tuy đó chỉ là kinh nghiệm của y học dân gian nhưng cũng cần có những nghiên cứu cụ thể để làm sáng tỏ, kiểm chứng các tác dụng, góp phần tạo sự tiến bộ trong y học. Để góp phần cung cấp những cơ sở tiền đề cho việc ứng dụng nguyên liệu tự nhiên vào các mỹ phẩm chăm sóc sắc đẹp, đề tài lựa chọn 8 loại thảo mộc phổ biến trong dân gian để khảo sát hoạt tính ức chế enzyme tyrosinase bao gồm: quả dâu tằm, củ đậu, rễ cam thảo, hoa kim ngân, hoa hòe, hoa cúc, khổ qua rừng và đu đủ. Các loại thảo mộc này thường được dân gian sử dụng để chăm sóc da như: xay nhuyễn làm mặt nạ, nấu nước tắm hoặc xông hơi, uống trà. Một vài thảo mộc trong số những loại này đã được nghiên cứu và công nhận về hoạt tính ức chế enzyme tyrosinase ở ngoài nước cũng như trong nước, tuy nhiên vẫn còn một sốquả được coi là nguồn nguyên liệu tự nhiên quý trong việc làm đẹp da, loại bỏ vết thâm nám, tàn nhang trên da. Chính vì vậy, việc ứng dụng các hoạt chất từ thiên nhiên vào sản phẩm mỹ phẩm đang là xu hướng được ưa chuộng và ngày càng phát triển. Tuy đó chỉ là kinh nghiệm của y học dân gian nhưng cũng cần có những nghiên cứu cụ thể để làm sáng tỏ, kiểm chứng các tác dụng, góp phần tạo sự tiến bộ trong y học. Để góp phần cung cấp những cơ sở tiền đề cho việc ứng dụng nguyên liệu tự nhiên vào các mỹ phẩm chăm sóc sắc đẹp, đề tài lựa chọn 8 loại thảo mộc phổ biến trong dân gian để khảo sát hoạt tính ức chế enzyme tyrosinase bao gồm: quả dâu tằm, củ đậu, rễ cam thảo, hoa kim ngân, hoa hòe, hoa cúc, khổ qua rừng và đu đủ. Các loại thảo mộc này thường được dân gian sử dụng để chăm sóc da như: xay nhuyễn làm mặt nạ, nấu nước tắm hoặc xông hơi, uống trà. Một vài thảo mộc trong số những loại này đã được nghiên cứu và công nhận về hoạt tính ức chế enzyme tyrosinase ở ngoài nước cũng như trong nước, tuy nhiên vẫn còn một sốquả được coi là nguồn nguyên liệu tự nhiên quý trong việc làm đẹp da, loại bỏ vết thâm nám, tàn nhang trên da. Chính vì vậy, việc ứng dụng các hoạt chất từ thiên nhiên vào sản phẩm mỹ phẩm đang là xu hướng được ưa chuộng và ngày càng phát triển. Tuy đó chỉ là kinh nghiệm của y học dân gian nhưng cũng cần có những nghiên cứu cụ thể để làm sáng tỏ, kiểm chứng các tác dụng, góp phần tạo sự tiến bộ trong y học. Để góp phần cung cấp những cơ sở tiền đề cho việc ứng dụng nguyên liệu tự nhiên vào các mỹ phẩm chăm sóc sắc đẹp, đề tài lựa chọn 8 loại thảo mộc phổ biến trong dân gian để khảo sát hoạt tính ức chế enzyme tyrosinase bao gồm: quả dâu tằm, củ đậu, rễ cam thảo, hoa kim ngân, hoa hòe, hoa cúc, khổ qua rừng và đu đủ. Các loại thảo mộc này thường được dân gian sử dụng để chăm sóc da như: xay nhuyễn làm mặt nạ, nấu nước tắm hoặc xông hơi, uống trà. Một vài thảo mộc trong số những loại này đã được nghiên cứu và công nhận về hoạt tính ức chế enzyme tyrosinase ở ngoài nước cũng như trong nước, tuy nhiên vẫn còn một sốquả được coi là nguồn nguyên liệu tự nhiên quý trong việc làm đẹp da, loại bỏ vết thâm nám, tàn nhang trên da. Chính vì vậy, việc ứng dụng các hoạt chất từ thiên nhiên vào sản phẩm mỹ phẩm đang là xu hướng được ưa chuộng và ngày càng phát triển. Tuy đó chỉ là kinh nghiệm của y học dân gian nhưng cũng cần có những nghiên cứu cụ thể để làm sáng tỏ, kiểm chứng các tác dụng, góp phần tạo sự tiến bộ trong y học. Để góp phần cung cấp những cơ sở tiền đề cho việc ứng dụng nguyên liệu tự nhiên vào các mỹ phẩm chăm sóc sắc đẹp, đề tài lựa chọn 8 loại thảo mộc phổ biến trong dân gian để khảo sát hoạt tính ức chế enzyme tyrosinase bao gồm: quả dâu tằm, củ đậu, rễ cam thảo, hoa kim ngân, hoa hòe, hoa cúc, khổ qua rừng và đu đủ. Các loại thảo mộc này thường được dân gian sử dụng để chăm sóc da như: xay nhuyễn làm mặt nạ, nấu nước tắm hoặc xông hơi, uống trà. Một vài thảo mộc trong số những loại này đã được nghiên cứu và công nhận về hoạt tính ức chế enzyme tyrosinase ở ngoài nước cũng như trong nước, tuy nhiên vẫn còn một số

MỤC LỤC DANH MỤC HÌNH DANH MỤC BẢNG MỞ ĐẦU Chương 1: TỔNG QUAN Hoạt chất trắng da .2 Sắc tố melanin Các chế làm trắng da Một số chất có khả ức chế enzyme tyrosinase phổ biến 1.1.3.1 Các chất có nguồn gốc tự nhiên 1.1.3.2 Các chất có nguồn gốc tổng hợp 1.2 Khảo sát số lồi thực vật có khả ức chế enzyme tyrosinase 10 1.2.1 Tổng quan khả ức chế enzyme tyrosinase thực vật 10 1.2.2 Khảo sát mẫu thực vật .12 1.2.2.1 Quả dâu tằm .12 1.2.2.2 Củ đậu .15 1.2.2.3 Rễ cam thảo .16 1.2.2.4 Hoa kim ngân 18 1.2.2.5 Hoa hòe 19 1.2.2.6 Hoa cúc 21 1.2.2.7 Khổ qua rừng 24 1.2.2.8 Đu đủ .25 1.1 1.1.1 1.1.2 1.1.3 Chương 2: ĐỀ CƯƠNG LUẬN VĂN .26 2.1 2.2 2.3 Mục tiêu nghiên cứu đối tượng nghiên cứu 26 Nội dung nghiên cứu .26 Phương pháp nghiên cứu 27 2.3.1 Xử lí nguyên liệu 27 2.3.2 Phương pháp đo độ ẩm 27 2.3.3 Khảo sát sơ thực vật 28 2.3.4 Phương pháp thử nghiệm hoạt tính sinh học 29 Phương pháp định lượng hàm lượng polyphenol tổng Chương 3: KẾT QUẢ SƠ BỘ 35 3.1 3.2 Kết sàng lọc 35 Kết luận 36 TÀI LIỆU THAM KHẢO .37 DANH MỤC HÌNH Hình 1.1: Quy trình sinh tổng hợp melanin [6] Hình 1.2: Cơ chế phản ứng chất ức chế thuận nghịch [12] Hình 1.3: Một số chất có khả làm trắng da Hình 1.4: Quả dâu tằm .12 Hình 1.5: Củ đậu 14 Hình 1.6: Rễ cam thảo .16 Hình 1.7: Hoa kim ngân .18 Hình 1.8: Nụ hoa hòe 19 Hình 1.9: Một số hợp chất phân lập từ hoa hòe 21 Hình 1.10: Hoa cúc 21 Hình 1.11: Khổ qua rừng 24 Hình 1.12: Quả đu đủ 25 Hình 2.1: Tóm tắt nội dung nghiên cứu .27 Hình 2.2: Quy trình đo enzyme tyrosinase 30 Hình 2.3: Phản ứng gốc tự DPPH chất chống oxy hóa 32 Hình 2.4: Quy trình đánh giá khả kháng oxy hóa DPPH 32 Hình 2.5: Xác định đường kính kháng khuẩn khuếch tán thạch 33 Hình 2.6: Quy trình đo hàm lượng phenol tổng 34 DANH MỤC BẢNG Bảng 1.1: Khả ức chế enzyme tyrosinase số thực vật [30] 10 Bảng 1.2: Khả ức chế enzyme tyrosinase kháng oxi hóa số thực vật [31] 11 Bảng 1.3: Một số thành phần dâu tằm [37] 14 Bảng 1.4: Hàm lượng phenolic hoa, cành kim ngân [47] 19 Bảng 1.5: Một số thành phần hoa cúc [53] .22 Bảng 1.6: Hàm lượng phenolic, flavonoid khả kháng oxi hóa phận đu đủ [59] 25 Bảng 2.1: Các thông số đo enzyme tyrosinase 31 Bảng 3.1: Kết khảo sát khả ức chế enzyme tyrosinase cao chiết EtOH tuyệt đối số loại thảo mộc nồng độ 1000 µg/ml .35 Bảng 3.2: Khảo sát khả ức chế enzyme tyrosinase cao chiết EtOH tuyệt đối độ chín khác dâu tằm 1000 µg/ml 36 MỞ ĐẦU Từ xa xưa, người biết sử dụng phận loại thảo mộc để làm thuốc chữa bệnh hay thay cho mỹ phẩm làm đẹp Ngày nay, xã hội ngày phát triển đại, nhu cầu làm đẹp người tăng lên, đồng thời người ngày có xu hướng tìm với tự nhiên để tìm kiếm giải pháp làm đẹp an tồn, hiệu tiện lợi Bởi họ tin thân cây, hoạt tính sinh học dân gian truyền lại từ xa xưa, chất hỗ trợ việc chữa bệnh làm giảm tối đa tác dụng phụ có Các phận lá, hoa, coi nguồn nguyên liệu tự nhiên quý việc làm đẹp da, loại bỏ vết thâm nám, tàn nhang da Chính vậy, việc ứng dụng hoạt chất từ thiên nhiên vào sản phẩm mỹ phẩm xu hướng ưa chuộng ngày phát triển Tuy kinh nghiệm y học dân gian cần có nghiên cứu cụ thể để làm sáng tỏ, kiểm chứng tác dụng, góp phần tạo tiến y học Để góp phần cung cấp sở tiền đề cho việc ứng dụng nguyên liệu tự nhiên vào mỹ phẩm chăm sóc sắc đẹp, đề tài lựa chọn loại thảo mộc phổ biến dân gian để khảo sát hoạt tính ức chế enzyme tyrosinase bao gồm: dâu tằm, củ đậu, rễ cam thảo, hoa kim ngân, hoa hòe, hoa cúc, khổ qua rừng đu đủ Các loại thảo mộc thường dân gian sử dụng để chăm sóc da như: xay nhuyễn làm mặt nạ, nấu nước tắm xông hơi, uống trà Một vài thảo mộc số loại nghiên cứu công nhận hoạt tính ức chế enzyme tyrosinase ngồi nước nước, nhiên số loài chưa nghiên cứu Chương TỔNG QUAN 1.1 Hoạt chất trắng da 1.1.1 Sắc tố melanin Sắc tố melanin (hắc tố) tạo nhóm tế bào chuyên biệt gọi tế bào biểu bì tạo hắc tố, chủ yếu nằm da, lông mắt [1] Ước tính mm bề mặt da có khoảng 1100 - 1500 tế bào biểu bì tạo hắc tố Các tế bào có chứa melanosome nơi sinh tổng hợp melanin Có ba loại melanin là: eumelanin, pheomelanin neuromelanin, eumelanin sắc tố tạo nên màu da Các sắc tố đóng vai trò quan trọng việc hấp thu gốc tự ngăn cản ảnh hưởng xạ UV [2] Trong da, hình thành hắc tố xảy sau tiếp xúc với xạ tia cực tím khiến da chuyển màu rám nắng mặt trời rõ ràng Melanin chất hấp thụ ánh sáng hiệu quả, làm tiêu tan 99,9% tia UV hấp thụ [3] Bởi đặc tính này, melanin cho bảo vệ tế bào da khỏi tác hại xạ UV, giảm nguy ung thư da Tuy nhiên, việc tích tụ lượng melanin bất thường da gây vấn đề da nám, tàn nhang, đồi mồi, lão hóa da… Ở nước phương Tây, chất làm sáng da ứng dụng để phòng ngừa điều trị việc tăng sắc tố không [4] Quá trình hình thành melanin dạng thể sống khác nghiên cứu lần Raper năm 1928, sau nghiên cứu Mason vào năm 1948 Lerner cộng năm 1949 (hình 1.1) [5] Hình 1.1: Quy trình sinh tổng hợp melanin [6] Enzyme quan trọng liên quan đến tổng hợp tất loại melanin từ tiền chất ban đầu (tyrosine) enzyme tyrosinase (EC 1.14.18.1), ức chế enzym làm giảm hình thành sắc tố da [7] Enzyme tyrosinase tìm thấy nhiều chủng loài bao gồm động vật hữu nhũ, động vật bậc thấp, thực vật kể nấm Thực quan sát sớm chức xúc tác enzyme tyrosinase từ chiết xuất nấm [8], nấm sử dụng rộng rãi ngày nguồn cung cấp dồi loại enzyme Theo quy trình hình 1.1, để tổng hợp nên melanin, đầu tiên, sắc tố eumelanin pheomelanin có chất amino acid tyrosine oxy hóa enzyme tyrosinase tạo thành 3,4-dihydroxyphenyl alanine (Dopa) Dopa bị oxy hóa thành dopaquinone q trình xảy nhanh có mặt enzyme tyrosinase [9] Dopaquinone chất có khả phản ứng cao tự oxy hóa thành dopachrome, sau chuyển thành dihydroxyindole (DHI) dihydroxyindole-2carboxylic acid (DHICA) để cuối tạo thành eumelanin, sắc tố nâu - đen Nếu có mặt cysteine glutathione, dopaquinone chuyển thành cysteinyl dopa glutathione dopa tạo thành pheomelanin, sắc tố vàng - đỏ [10] 1.1.2 Các chế làm trắng da Mục đích chất làm trắng da giảm có mặt melanin da [11] Các hoạt chất ức chế enzyme tyrosinase chia thành nhóm chính: Chất ức chế kiểu cạnh tranh: Các hợp chất ức chế cạnh tranh liên kết với loại enzyme tự có vai trò cản trở việc liên kết với chất Ở đây, chất ức chế chất loại trừ lẫn nhau, thường chúng cạnh tranh cho vị trí Các chất ức chế cạnh tranh dùng làm đẹp da thường hợp chất hữu có liên kết Cu dẫn xuất từ chất [12] Chất ức chế không cạnh tranh: Chất ức chế bám vào phức hợp enzyme – chất, sản phẩm P không tạo thành (hình 1.2) [12] Chất ức chế hỗn hợp: Chất ức chế vừa liên kết với enzyme tự vừa liên kết với phức hợp enzyme - chất Phần lớn loại hỗn hợp này, liên kết cân chúng cho loại enzyme khác hoạt động độc lập [12] Chất ức chế cân bằng: Là trường hợp đặc biệt chất ức chế hỗn hợp liên kết chúng với enzyme tự enzyme chất liên kết cân giống [12] Hình 1.2: Cơ chế phản ứng chất ức chế thuận nghịch [12] Trong đó: E, S, I, P enzyme, chất, chất ức chế, sản phẩm tương ứng; ES phức hợp enzyme - chất, EI ESI phức hợp enzyme - chất ức chế enzyme - chất - chất ức chế 1.1.3 Một số chất có khả ức chế tyrosinase phổ biến 1.1.3.1 Các chất có nguồn gốc tự nhiên a Hydroquinone (1) Hydroquinone (HQ) tác nhân làm sáng da hiệu quả, có tác dụng điều trị triệu chứng nám da, tàn nhang hay rối loạn sắc tố da khác Nó ức chế chuyển hóa từ tyrosine thành melanin [13] Sự giống cấu trúc HQ tiền chất trình tổng hợp melanin cho phép HQ tương tác với tyrosinase Sự tương tác xảy HQ kết hợp với histidine đồng vị trí hoạt động enzyme Thêm vào đó, HQ gây hình thành loại oxy hoạt tính quinones dẫn tới oxy hoá lipid màng protein tyrosinase Hydroquinone ức chế sắc tố cách làm suy giảm glutathione, làm thay đổi hình thành melanosome làm giảm tổng hợp DNA RNA với thoái biến melanosome phá huỷ tế bào melanocyte [14, 15] Do rủi ro mà tác dụng phụ gây ochronosis ngoại sinh sắc tố vĩnh viễn sử dụng thời gian dài, hydroquinone bị cấm Liên minh Châu Âu (24th Dir 2000/6/EC) Những sản phẩm có chứa thành phần hydroquinone theo quy định cấp theo toa [14, 15] b Arbutin (2) Arbutin (hydroquinone-β-D-glucopyranoside) dẫn xuất arbutin hoạt chất trắng da chứa gốc đường tìm thấy nhiều lồi thực vật bậc cao Arctostaphylos uvaursi (L) Spreng (quả bearberry), Vaccinium vitisidea L (quả lingonberry), Pyrus communis L (cây lê), …Ngồi arbutin tìm thấy số lồi thảo mộc [16] Arbutin có tác dụng ức chế hoạt động enzyme tyrosinase quy trình sinh tổng hợp tế bào sắc tố melanin Hai dạng arbutin α-arbutin β-arbutin Một nghiên cứu Funayama cộng (năm 1995) chế hai dạng arbutin này, β-arbutin có khả ức chế hoạt tính tyrosinase từ nấm từ tế bào melanin chuột theo chế khơng cạnh tranh, α-arbutin có khả kháng tyrosinase từ tế bào melanin chuột theo chế hỗn hợp [17] Arbutin nồng độ 10 -3 M không gây độc tế bào có khả làm sáng da rõ rệt, hiệu kojic acid có nồng độ [18] c Kojic acid (3) Kojic acid (5-hydoxy-4-pyran-4-one-2-methyl) chất ức chế tyrosinase có nguồn gốc từ loại nấm đặc biệt Aspergillus Penicillium [19] Kojic acid thuộc loại chất ức chế tyrosinase hỗn hợp với giá trị IC 50 = 0,054 mM [20], chất ức chế tyrosinase tốt nên thường sử dụng chất đối chiếu quy trình thử hoạt tính kháng tyrosinase Tuy nhiên, sử dụng làm hoạt chất trắng da sản phẩm mỹ phẩm thường kết hợp kojic acid với thành phần khác để làm giảm kích ứng khơng mong muốn d Vitamin C (4) Vitamin C ngăn chặn sắc tố cách liên kết với ion đồng vị trí hoạt động tyrosinase làm giảm hình thành dopaquinone Vitamin C từ trái rau củ khơng bền, sử dụng mỹ phẩm Magnesium L-ascorbic acid-2phosphate (MAP), dẫn xuất bền vitamin C, xem tác nhân làm trắng hiệu [13] e Polyphenol Một số polyphenol xem chất enzyme tyrosinase, diện vị trí nhóm đóng vai trò định đến khả ức chế enzyme tyrosinase Polyphenol thực vật nhóm hợp chất có nhiều nhóm chức phenol, tiêu biểu flavonoid Hơn 4000 flavonoid phân bố lá, hạt, vỏ hoa xác định Ở thực vật hợp chất bảo vệ thực vật cách chống lại tia cực tím tác nhân gây bệnh [21] Các isoflavone, bao gồm glycitein (5), daidzein (6), genistein (7) thể khả kháng tyrosinase thấp, 6,7,4′-trihydroxyisoflavone (8) có khả ức chế tyrosinase mạnh kojic acid Các flavanone naringenin (9), eriodictyol (10) hesperidin (11) có tác dụng tương tự hydroquinone [22] Một số flavonoid kaempferol (12), quercetin (13) morin (14) (hình 1.3) thể tác dụng ức chế tyrosinase, chất khác, ví dụ catechin rhamnetin, đóng vai trò chất tyrosinase Một số nghiên cứu cho thấy flavonoid có chứa nhóm α-keto có tác dụng ức chế tyrosinase mạnh [23] Ngồi dịch chiết Citrus, chiết xuất loài thuộc chi Morus , biết đến loài giàu polyphenol, việc sử dụng tác nhân điều trị tự nhiên khơng gây hại đóng vai trò tác nhân làm trắng da hiệu Mulberroside F (moracin M-6,3′-di-O-β-glucopyranoside) (15) tách từ dâu tằm có tác dụng ức chế enzyme tyrosinase cao nấm gấp 4,5 lần kojic acid thể khả ức chế ảnh hưởng việc hình thành melanin tế bào melanoma [24] 1.1.3.2 Các chất có nguồn gốc tổng hợp 10 Xử lý nguyên liệu Chiết cao tổng ethanol tuyệt đối cao tổng nước Khảo sát hoạt tính ức chế enzyme tyrosinase Tối ưu điều kiện chiết mẫu tiềm Khảo sát hoạt tính kháng enzyme tyrosinase, kháng oxi hóa, kháng khuẩn, định lượng polyphenol cao mẫu tiềm Hình 2.1: Tóm tắt nội dung nghiên cứu 2.3 Phương pháp nghiên cứu 2.3.1 Xử lý nguyên liệu Nguyên liệu tươi phơi khô sấy nhiệt độ 50 ⁰C đạt độ ẩm 12% Nguyên liệu khô xay nhỏ để tiến thành chiết dung môi 2.3.2 Phương pháp đo độ ẩm Độ ẩm xác định máy đo độ ẩm Satorius MA 35 Cách tiến hành: Cân khoảng 0,2 g nguyên liệu khô xay nhỏ trải đĩa nhôm cho vào máy đo độ ẩm Nguyên liệu sấy 105 ⁰C đến khối lượng không đổi Kết thúc đo hình máy chữ END vả đọc độ ẩm máy Độ ẩm xác định công thức: W (%) = x 100% 31 Phép đo thực lần lấy kết trung bình Từ độ ẩm W, khối lượng nguyên liệu khơ tính theo cơng thức: mnlk = 2.3.3 Khảo sát sơ thực vật Phương pháp định tính hợp chất có dấu hiệu nhận biết kết dương tính sau: 2.3.3.1 Alkaloid Dùng thuốc thử đặc trưng để định tính alkaloid Dragendorff Bouchardat sau: • Nhỏ đến hai giọt thuốc thử Dragendorff vào 3ml dịch chiết thảo mộc: Xuất tủa vàng cam đến đỏ • Nhỏ đến hai giọt thuốc thử Bouchardat vào 3ml dịch chiết thảo mộc: Xuất tủa nâu 2.3.3.2 Flavonoid • Phản ứng cyanidin: thêm vào dịch chiết thảo mộc bột Mg nhỏ từ từ HCl đậm đặc Sau đến hai phút có màu đỏ cam, đỏ thẫm, đỏ tươi • Tác dụng chì acetate trung tính kiềm: Thêm vào ml dịch chiết thảo mộc ml dung dịch chì acetate 10% Phản ứng tạo tủa • Phản ứng với H2SO4 đậm đặc: Flavone, flavonol: Màu vàng đậm Chalcon, auron: Màu đỏ, đỏ thắm Flavanone: Từ đỏ cam chuyển sang đỏ thắm 2.3.3.3 Polyphenol 32 Phản ứng tạo phức với FeCl3: Khuấy ml dịch chiết với ml nước cất, sau thêm vài giọt dung dịch FeCl3 Tùy vào số lượng vị trí nhóm OH phân tử mà cho màu lục, xanh, nâu đỏ 2.3.3.4 Saponin Phản ứng Liebermann-Burchard: lấy 5ml dịch chiết đun cách thủy ống nghiệm cho nóng cho vào ml acetic anhydride , cho thêm giọt H 2SO4 đậm đặc Nếu dẫn xuất steroid có màu lơ - xanh lá, dẫn xuất triterpenoid có màu hồng đến tía 2.3.3.5 Coumarin Nhỏ vài giọt dịch chiết lên giấy thấm, nhỏ tiếp lên vài giọt NaOH 5%, sấy nhẹ Che ½ vết với đồng xu chiếu tia tử ngoại vài phút sau cất đồng xu đi, thấy nửa khơng che sáng nửa bị che Nếu tiếp tục chiếu độ sáng nửa bị che sáng dần lên 2.3.4 Phương pháp thử nghiệm hoạt tính sinh học 2.3.4.1 Hoạt tính ức chế enzyme tyrosinase Nguyên tắc: Khi có mặt enzyme tyrosinase, L-dopa bị oxy hóa thành dopachrome có màu, bước sóng hấp thu cực đại 475 nm Khi có mặt chất ức chế tyrosinase, lượng dopachrome sinh giảm xuống Do màu giảm xuống phụ thuộc vào nồng độ thử mẫu Tiến hành đo độ hấp thu bước sóng 475 nm để xác định % ức chế enzyme tyrosinase mẫu theo nồng độ Kojic acid dùng làm chất đối chứng So sánh giá trị IC50 mẫu tiềm kojic acid để đánh giá khả ức chế enzyme tyrosinase Hóa chất: • Đệm Sodium Phosphat 0,1 M ( pH = 6,8 ) • Enzyme tyrosinase 200 đơn vị/ ml • L-DOPA 0,8 mM 33 Quy trình: • Chuẩn bị: enzyme tyrosinase 200 U/mL chất L-dopa 0,8 mM hòa tan đệm phosphate 0,1 M (pH 6,8) Mẫu đo chất chuẩn hòa tan DMSO 5% thành nồng độ khác • Đo mẫu: 40 µL tyrosinase, 240 µL mẫu tạo thành hỗn hợp dung dịch mẫu có enzyme Dung dịch mẫu khơng có enzyme 40 µL tyrosinase thay 40 µL đệm phosphate Thực tương tự với dung dịch mẫu trắng có khơng có enzyme, mẫu trắng 240 µL mẫu thay 240 µL DMSO 5% Để hỗn hợp phản ứng 10 phút, sau thêm vào 40 µL dung dịch L-dopa, ủ 25 ⁰C 10 phút Sự giảm màu dopachrome đo bước sóng 475 nm • Đo chất chuẩn Acid Kojic: thực quy trình nồng độ 3, 5, 7, 10, 20, 30, 40, 50, 60 µg/mL 40 µL enzyme 200 U/mL 240 µL mẫu Phản ứng 10 phút Ủ 10 phút, 25 ⁰C 40 µL L-dopa 0,8 mM Đo mật độ quang λ= 475 nm Hình 2.2: Quy trình đo enzyme tyrosinase Phản ứng A Dung dịch đệm (µL) Enzyme tyrosinase (µL) 40 L-DOPA (µL) 40 34 DMSO 5% (µL) 240 Dung dịch mẫu (µL) B 40 40 240 C 40 40 240 D 40 40 240 Bảng 2.1: Các thông số đo enzyme tyrosinase Kết % ức chế tính theo cơng thức: % = x 100% Trong đó: A: Độ hấp thu mẫu trắng có mặt enzyme B: Độ hấp thu mẫu trắng khơng có mặt enzyme C: Độ hấp thu mẫu có mặt enzyme D: Độ hấp thu mẫu khơng có mặt enzyme Thực mẫu chứng dương kojic acid mẫu phân tích nồng độ khác So sánh IC50 đánh giá hoạt tính ức chế enzyme tyrosinase 2.3.4.2 Hoạt tính kháng oxy hóa Ngun tắc: 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl (DPPH) hợp chất có màu tím phát bước sóng 517 nm Khi điện tử lẻ gốc tự DPPH kết hợp với hydro từ chất chống oxy hóa hình thành nên DPPH–H lúc màu sắc chuyển từ màu tím sang màu vàng Sự biến đổi màu tương ứng với lượng electron kết hợp với DPPH Do đó, khả làm gốc tự chất cao hấp thu quang phổ đo 517 nm phản ứng DPPH có giá trị giảm ngược lại Thông qua việc so sánh độ hấp thu mẫu cao với mẫu trắng, xác định lượng gốc tự DPPH bị bắt 35 Hình 2.3: Phản ứng gốc tự DPPH chất chống oxy hóa Cách tiến hành: • Chuẩn bị dung dịch DPPH 30 μg/mL methanol 80% cho OD = 0.7 ± 0.2 • Chuẩn bị dung dịch cao chiết (cao tổng ethanol, cao tổng nước cao thành phần) nồng độ từ – 5000 μg/mL • Mẫu chứng dương vitamin C chuẩn bị nồng độ – 10 μg/mL methanol 80% • Cách tiến hành: cho 120 μL dung dịch cao chiết vào 180 μL dung dịch DPPH, lắc ủ 30 phút tối nhiệt độ phòng Đo mật độ quang bước sóng 517 nm • Mẫu trắng thực với 120 μL methanol 80% 180 μL dung dịch DPPH • Chứng dương thực với 120 μL vitamin C 180 μL dung dịch DPPH • Mẫu đo màu cao chiết thực với 120 μL dung dịch cao chiết 180 μL 240 µL mẫu 180 µL dung dịch DPPH Lắc Ủ tối 30 phút, 30 ⁰C Đo mật độ quang λ= 517 nm Hình 2.4: Quy trình đánh giá khả kháng oxy hóa DPPH Tỷ lệ bắt gốc tự DPPH tính theo cơng thức: Tỷ lệ bắt gốc DPPH (%) = x100% 36 Trong đó: Ac: mật độ quang mẫu trắng As: mật độ quang mẫu Ab: mật độ quang màu cao 2.3.4.3 Hoạt tính kháng khuẩn Phương pháp thử sơ khuếch tán thạch: Nhỏ cao chiết DMSO 100% vào lỗ thạch với lượng định Cao chiết khuếch tán vào thạch, ức chế sinh trưởng vi sinh vật tạo thành vòng tròn ức chế xung quanh lổ thạch Đường kính vòng ức chế bao gồm đường kính lỗ Kích thước đường kính vòng tròn cho biết khả kháng vi sinh vật cao chiết Đường kính vòng lớn khả kháng vi sinh vật mạnh Hình 2.5: Xác định đường kính kháng khuẩn khuếch tán thạch Vi khuẩn sử dụng là: • Enterococcus faecalis gram dương ATCC 29212 (vi khuẩn liên cầu gây bệnh hơ hấp) • Staphylococcus aureus gram dương ATCC 29213 (vi khuẩn gây viêm da, viêm phổi) • Escherichia coli gram âm ATCC 25922 (vi khuẩn phổ biến gây bệnh tiêu chảy) • Pseudomonas aeruginosa gram âm ATCC 27853 (vi khuẩn gây viêm phổi, viêm gan phổ biến cho người) • MRSA (Methicillin-resistant S aureus) gram dương ATCC 43300 (vi khuẩn kháng trụ sinh gây viêm da, viêm phổi) • Salmonella enterica serovar Typhimurium (vi khuẩn gây bệnh thương hàn) 37 Chất đối chiếu: kháng sinh phổ rộng Gentamicin (5 mg/mL) 2.3.5 Phương pháp định lượng hàm lượng phenol tổng Tổng hàm lượng phenol có dịch chiết xác định theo phương pháp FolinCiocalteu mô tả Singlenton Rossi năm 1999 Nguyên tắc: phương pháp Folin-Ciocalteu dựa vào việc chuyển electron từ hợp chất phenol sang phức phosphomolybdic/phosphotungstic acid môi trường kiềm để tạo thành hỗn hợp phức màu xanh có bước sóng hấp thu cực đại 760 nm 3167 µL nước + 600 µL dung dịch Na2CO3 20% 40 µL mẫu + 200 µL thuốc thử Folin Lắc phút Siêu âm 37 ⁰C, 30 phút  = 760 nm Đo mật quang Hình 2.6: Quy trình đo độ hàm lượng phenol tổng Đo mẫu: cao chiết hòa tan dung mơi DMSO pha lỗng thành nồng độ thích hợp Lấy 40 µL dịch chiết pha lỗng, thêm vào 200 µL dung dịch thuốc thử Folin-Ciocalteu, lắc Sau phút, thêm vào hỗn hợp với 3160 µL nước 600 µL dung dịch Na2CO3 20%, lắc đem siêu âm 30 phút Độ hấp thu dung dịch sau phản ứng đo bước sóng 760 nm Lập đường chuẩn gallic acid: thực quy trình với dãy nồng độ gallic acid: 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000 µg/mL Gallic acid dùng làm chất chuẩn Hàm lượng phenol tổng biểu diễn theo miligam đương lượng gallic acid 1g nguyên liệu chiết – mg GAE/1g nguyên liệu (mg gallic acid equivalent/1g nguyên liệu) Kết đo độ hấp thu mẫu gallic acid nồng độ xây dựng thành đường chuẩn theo phương trình đường thẳng y = ax + b 38 Chương 3: KẾT QUẢ SƠ BỘ 3.1 Kết sàng lọc Thực chiết mẫu dung môi EtOH tuyệt đối, nhiệt độ chiết 50 ⁰C, thời gian chiết 30 phút × lần Tỉ lệ mẫu : dung môi lần chiết 1:10 (g/ml) Khối lượng mẫu lần chiết 10g Bảng 3.1: Kết khảo sát khả ức chế enzyme tyrosinase cao chiết EtOH tuyệt đối số loại thảo mộc nồng độ 1000 µg/ml Hoa kim ngân Lá khổ qua Hoa hòe Rễ cam thảo I%1 12,91% 48,47% 81,03% 83,17% I%2 12,11% 41,78% 73,02% 86,38% I%3 11,58% 28,69% 80,77% 77,29% I%TB 12,20% 39,65% 78,27% 82,28% Bảng 3.2: Khảo sát khả ức chế enzyme tyrosinase cao chiết EtOH tuyệt đối độ chín khác dâu tằm 1000 µg/ml 3.2 Độ chín Độ chín Độ chín Độ chín I%1 16,43% 22,56% 32,56% 40,32% I%2 17,27% 25,07% 40,75% 42,87% I%3 23,12% 24,79% 35,24% 40,25% I%TB 18,94% 24,14% 36,18% 41,15% Kết luận Từ kết thí nghiệm cho thấy tiềm ức chế enzyme tyrosinase cao chiết ethanol loại thảo mộc khảo sát cao Đặc biệt cao chiết ethanol hoa 39 hòe cam thảo thể khả ức chế enzyme tyrosinase 78,27% 82,28% nồng độ 1000 µg/ml Tiến hành khảo sát thêm khả ức chế enzyme tyrosinase cao chiết ethanol loại thảo mộc lại cao chiết nước loại thảo mộc để đánh giá lồi có tiềm tốt để tối ưu quy trình chiết nhằm nâng cao khả ức chế enzyme tyrosinase TÀI LIỆU THAM KHẢO Ahmed Hassan H Arbab (M.Pharm) & Mahmoud Mudawi Eltahir (PhD), "Review on skin whitening agents," Khartoum Pharmacy Journal, vol.13(1), 2010 Shampa Mallick, S.K.M., Ranjan Bhadra, "Human placental lipid induces mitogenesis and melanogenesis in B16F10 melanoma cells," Journal of Biosciences, vol 27(3), pp 243-249, 2002 Meredith, P and J Riesz, "Radiative relaxation quantum yields for synthetic eumelanin," Photochemistry and photobiology, vol 79(2), pp 211-216, 2004 F Solano, B.S., M Picardo and G Ghanem, "Hypopigmenting Agents: An Updated Review on Biological," Chemical and Clinical Aspects, vol 19, pp 550-571, 2006 Seo, S.-Y., V.K Sharma, and N Sharma, "Mushroom tyrosinase: recent prospects," Journal of agricultural and food chemistry, vol 51(10): pp 2837- 2853, 2003 Parvez, S., et al., "Survey and mechanism of skin depigmenting and lightening agents," Phytotherapy Research, vol 20(11), pp 921-934, 2006 40 Maeda K., Fukuda M (1991), "In vitro effectiveness of several whitening cosmetic components in human melanocytes," J Soc Cosmet Chem, vol 42, pp 361-368 Bourquelot E, B.A., "Le bleuisse- ment et le noircissement des champignons," Comp Rend Soc Biol, vol 2, p 582-4, 1895 Piyaporn Donsing and Jarupa Viyoch, "Thai Breadfruit's heartwood extract: A 10 new approach to skin whitening," SWU Sci J., vol 24(1), 2008 Shoukat Parvez, Moo-Chang Hong, and Min-Kyu Shin, "Survey and mechanism of skin depigmenting and lightening agents," Phytother, Res., vol 11 20, pp 921-934, 2006 Ebanks, J.P., R.R Wickett, and R.E Boissy, "Mechanisms regulating skin pigmentation: the rise and fall of complexion coloration," International Journal 12 of Molecular Sciences, vol 10(9), pp 4066-4087, 2009 Chang, T.-S., "An updated review of tyrosinase inhibitors," International 13 journal of molecular sciences, vol 10(6), pp 2440-2475, 2009 Rendon, M.I and J.I Gaviria, "Review of Skin‐Lightening Agents," 14 Dermatologic surgery, vol 31(s1), pp 886-890, 2005 Briganti, S., E Camera, and M Picardo, "Chemical and instrumental approaches to treat hyperpigmentation," Pigment Cell & Melanoma Research, 15 vol 16(2), pp 101-110, 2003 Solano, F., et al., "Hypopigmenting agents: an updated review on biological, chemical and clinical aspects," Pigment Cell & Melanoma Research, vol 19(6), 16 pp 550-571, 2006 Carmen Pop, L.V., Mircea Tamas, "Natural Resources Containing Arbutin Determination of Arbutin in the Leaves of Bergenia crassifolia (L.)," Fritsch 17 acclimated in Romania, vol 37(1), pp 129-132, 2009 Funyama, M.A., H.; Yamamoto, R.; Nishino, T.; Shin, T.; Murao, S Biosci., "Effects of R and arbutin on the activity of tyrosinase from mushroom and 18 mouse melanoma,", Biotechnol., Biochem, vol 59, pp 143-144, 1995 Maeda, K and M Fukuda, "Arbutin: mechanism of its depigmenting action in human melanocyte culture," Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics, vol 276(2), pp 765-769, 1996 41 19 Piamphongsant, T., "Treatment of melasma: a review with personal experience," International journal of dermatology, vol 37(12), pp 897- 903, 20 1998 Burdock GA, S.M., Carabin IG, "Evaluation of health aspects of kojic acid in 21 food," Regulatory Toxicol Pharmacol, vol 33, pp 80–101, 2001 Chen, J.S., Wei, C., Rolle, R S., Otwell, W S., Balaban, M O., and Marshall, M R., "Inhibitory effect of kojic acid on some plant and crustacean polyphenol 22 oxidases," J Agric Food Chem, vol 39, pp 1396–1401, 1991 Hammerstone J F., Lazarus S A., Schmitz H H., "Procyanidin content and variation in some commonly consumed foods," The Journal of Nutrition, vol 23 130(8), pp 2086-2092, 2000 Tiedtke, J., J Morel, and O Marks, "Depigmentation factor bioflavonoids - safe and effective skin lightener based on encapsulated citrus bioflavonoids," 24 Cosmetochem, vol 2, pp 12-17, 2004 Badria F A., Gayyar M A., "A new type of tyrosinase inhibitors from natural products as potential treatments for hyperpigmentation," Boll Chim Farm, vol 25 140(4), pp 267-271, 2001 Huang X.-H., Chen Q.-X., Wang Q., Song K.-K., Wang J., Sha L., Guan X., "Inhibition of the activity of mushroom tyrosinase by alkylbenzoic acids," Food 26 Chem, vol 94, pp 1-6, 2006 Criton M., Le Mellay-Hamon V., "Analogues of N-hydroxy-N'-phenylthiourea and N-hydroxy-N'-phenylurea as inhibitors of tyrosinase and melanin formation," Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters, vol 18(12), pp 3607- 27 3610, 2008 Kahn V., Andrawis A., "Inhibition of mushroom tyrosinase by tropolone," 28 Phytochemistry, vol 24, pp 905-908, 2015 J.-H H B M Lee, "Inhibitory Effects of Plant Extracts on Tyrosinase, l-DOPA Oxidation, and Melanin Synthesis," Journal of Toxicology and Environmental 29 Health, vol 70, pp 393-407, 2007 K Y A Setyawati, and T Mitsunaga, "Potential of Medicinal Plants Extractives as Anti-Melanogenesis Ingredients," Reviews in Agricultural Science, vol 6, pp 46-60, 2018 42 30 J.-H H B M Lee, "Inhibitory Effects of Plant Extracts on Tyrosinase, l-DOPA Oxidation, and Melanin Synthesis," Journal of Toxicology and Environmental 31 Health, vol 70, pp 393-407, 2007 G T Wang Ya, Zhu Yi-Lin and Zhao Ping, "Preliminary screening of 44 plant extracts for anti-tyrosinase and antioxidant activities," Pak J Pharm Sci, vol 28, 32 pp 1737-1744, 2015 Chi, V.V., "Từ điển thực vật thông dụng tập 2," NXB Khoa học Kĩ thuật, 33 2004 Z F M Hongxia Zhang, Xiaoqin Luo and Xinli Li, "Effects of Mulberry Fruit (Morus alba L.) Consumption on Health Outcomes: A Mini-Review," 34 Antioxidants (Basel), vol 7(5), p 69, 2018 E O Sezai Ercisli "Chemical composition of white (Morus alba), red (Morus rubra) and black (Morus nigra) mulberry fruits," Food Chemistry, vol 103, pp 35 1380–1384, 2007 N B Pornanong Aramwit, Teerapol Srichana, "The properties and stability of anthocyanins in mulberry fruits," Food Research International, vol 43, pp 36 1093–1097, 2010 A K Halil Koyu, Serdar Demir, Mehmet Zeki Haznedaroglu, Ozlem and YesilCeliktas, "Optimization of microwave assisted extraction of Morus nigra L fruits maximizing tyrosinase inhibitory activity with isolation of bioactive 37 constituents," Food Chemistry, vol 248 pp 183-191, 2018 P.-Y L Eric Wei-Chiang CHAN, Siu-Kuin WONG, "Phytochemistry, pharmacology, and clinical trials of Morus alba," Chinese Journal of Natural 38 Medicines, vol 14, pp 17-30, 2016 U H Endang Lukitaningsih, "Bioactive compounds in bengkoang (Pachyrhizus erosus) as antioxidant and tyrosinase inhibiting agents," 39 Indonesian J Pharm, vol 25 (2), pp 68-75, 2014 E Lukitaningsih, "The exploration of whitening and sun screening compounds 40 in bengkoang roots (Pachyrhizus erosus)." 2009 E Lukitaningsih, Mustikawaty, A.A., Sulistyo, B and Sudarmanto, A., " Homology modeling and molecula docking of active compounds from bengkoang (Pachyrrhizus erosus) as tyrosinase inhibitor in Homo sapiens," Jurnal Ilmu Farmasi Indonesia, vol 12, pp 132-137, 2013 43 41 K H Wang, Lin, R.D, Hsu, F.L., Huang, Y.H., Chang, H.C., Huang, C.Y and Lee, M.H., "Cosmetic applications of selected traditional Chinese herbal 42 medicines," Journal of Ethnopharmacology, vol 106, pp 353-359, 2006 J A Sandler, "The Phytochemical extraction and analysis of new flavonoids and saponins from the genus Silphium," Dissertation, The University of Texas at Austin., 2005 43 44 S S Liangliang Liu, Xiaoqing Chen a, Mijun Peng, "Analysis of tyrosinase binders from Glycyrrhiza uralensis root: Evaluation and comparison of tyrosinase immobilized magnetic fishing-HPLC and reverse ultrafiltrationHPLC," Journal of Chromatography B, vol 932, pp 29-25, 2013 45 46 H P Xiaofei Shang, Maoxing Li, Xiaolou Miao, Hong Ding, "Lonicera japonica Thunb.: Ethnopharmacology, phytochemistry and pharmacology of an important traditional Chinese medicine," Journal of Ethnopharmacology, vol 47 138, pp 1-21, 2011 V K B N.T Dung, A Rahman, J.I Yoon1 And S.C Kang, "Phenolic contents, antioxidant and tyrosinase inhibitory activities of Lonicera japonica Thumb," 48 Journal of Food Biochemistry, vol 35, pp 148–160, 2009 H.-C L Yuh-Shuen Chen, and Chin-Feng Chan, "Tyrosinase Inhibitory Effect and Antioxidative Activities of Fermented and Ethanol Extracts of Rhodiola 49 rosea and Lonicera japonica," The Scientifc World Journal, pp 1-5, 2013 A.M.Sandigawad, "Analysis of phytochemicals and antibacterial potential of Lonicera japonica Thunb.," International Journal of Pharma and Bio Sciences, 50 vol 6(2), pp 571 - 583, 2015 Z Z Yajun Bai , Xiaoxiao Wang, Jiacheng Fang, Linhong Huang "Local and traditional uses, phytochemistry, and pharmacology of Sophora japonica L.: A 51 review," Journal of Ethnopharmacology, vol 187, pp 160-182, 2016 R.-D L Yuan-Hsin Lo, Yi-Pei Lin, Yan-Ling Liu, Mei-Hsien Lee, "Active constituents from Sophora japonica exhibiting cellular tyrosinase inhibition in human epidermal melanocytes," Journal of Ethnopharmacology, vol 124, pp 52 625–629, 2009 B H T Bui Thi Thuy Luyen, Nguyen Phuong Thao, Ji Yun Cha, Hoon Yeon Lee , and Y H K Young Mi Lee, "Anti-inflammatory components of 44 Chrysanthemum indicum flowers," Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters, 53 vol 25, pp 266-269, 2015 J H K Keun Taek Choi, Hyung Taek Cho, Soon Sung Lim, Sun Soon Kwak, "Dermatologic evaluation of cosmetic formulations containing Chrysanthemum 54 indicum extract," Journal of Cosmetic Dermatology, vol 15, pp 162-168, 2016 O A Khan MR, "Momordica charantia and Allium sativum: Broad spectrum 55 antibacterial activity," Korean J Pharmacogn, vol 29, pp 155-158, 1998 S S Kubola J, " Phenolic contents and antioxidant activities of bitter gourd (Momordica charantia L.) leaf, stem and fruit fraction extracts in vitro," Food 56 Chemistry, vol 110, pp 881-890, 2008 C.-J H Tsung-Hsien Tsai, Wen-Huey Wu, Wen-Cheng Huang, Jong-Ho Chyuan and Po-Jung Tsai, "Antioxidant, cell-protective, and anti-melanogenic activities of leaf extracts from wild bitter melon (Momordica charantia Linn 57 var abbreviata Ser.) cultivars," Botanical Studies, vol 55, 2014 N M a C T Narisa Kamkaen, "Screening of Some Tropical Vegetables for Anti-tyrosinase Activity," Thai Pharm Health Sci, vol 2(1), pp 15-19, 2007 58 59 N A Maisarah A.M., Asmah, R and Fauziah, O., "Antioxidant analysis of different parts of Carica papaya," International Food Research Journal, vol 60 20(3), pp 1043-1048 2013 D B Aravind G, Duraivel S, Harish G, "Traditional and Medicinal Uses of Carica papaya," Journal of Medicinal Plants Studies, vol 1, pp 7-15, 2013 45 ... 20 19 12 Hình 1.3: Một số chất có khả làm trắng da 1.2 Khảo sát số loài thực vật có khả ức chế enzyme tyrosinase 1.2.1 Tổng quan khả ức chế enzyme tyrosinase thực vật Sạm da vấn đề thẩm mỹ người... đặc biệt có nhiều nụ (hơn 20%) nghiên cứu ứng dụng rộng rãi nhiều sản phẩm làm trắng da 23 Năm 2009, Yuan-Hsin Lo cộng nghiên cứu thành phần có hoạt tính làm trắng da hoa hòe Theo nghiên cứu, hoa... 2.1 Mục tiêu nghiên cứu đối tượng nghiên cứu Mục tiêu nghiên cứu sàng lọc đánh giá hoạt tính ức chế enzyme tyrosinase 10 lồi thực vật Chọn mẫu có khả ức chế enzyme cao tiến hành khảo sát điều