TỔNG SỐ BÀO TỬ NẤM MEN - NẤM MỐC

TỔNG SỐ BÀO TỬ NẤM MEN - NẤM MỐC NGUYÊN LÝ PHƯƠNG PHÁP Sử dụng kỹ thuật đổ đĩa đếm khóm nấm trên môi trường thạch, sau khi ủ hiếu khí ở nhiệt độ 28 ±1 o C trong thời gian từ 5 - 7 ngày. Số lượng bào tử nấm men, nấm mốc trong 1g(ml) mẫu sản phẩm thực phẩm kiểm nghiệm được tính theo số khóm nấm đếm được từ các đĩa nuôi cấy theo các đậm độ pha loãng PHẠM VI ÁP DỤNG: Thực phẩm và thức ăn chăn nuôi THIẾT BỊ - DỤNG CỤ • Đĩa petri thuỷ tinh đường kính 90 -100 mm • Pipet có chia độ loại 1ml, 5ml, 10 ml đã tiệt khuẩn. • Nồi cách thuỷ điều chỉnh nhiệt độ 45 ±1 o C. • Tủ ấm điều chỉnh nhiệt độ 30 ±1 o C. • Tủ sấy khô. • Nồi hấp áp lực . • Bình thuỷ tinh dung tích 250- 500ml. • Ống nghiệm loại 16-160 mm và lớn hơn . • pH met hoặc giấy đo pH. HÓA CHẤT – MÔI TRƯỜNG • Thạch dùng cho Vi sinh vật • Pepton dùng cho Vi sinh vật • Muối tinh khiết (NaCl) • Glucoza tinh khiết • Natri hydrophotphat tinh khiết (Na 2 HPO 4 ) • Kalidihydrophotphat tinh khiết (KH 2 PO 4 ) • Axit lactic dung dịch 20% hoặc 40% • Axit xitric dung dịch 20% • Dung dịch NaOH 0,1N CHUẨN BỊ MÔI TRƯỜNG VÀ MẪU THỬ • Chuẩn bị môi trường - Môi trường nuôi cấy, nước pha loãng và dung dịch cần thiết được điều chế theo công thức. Các môi trường được đóng sẵn vào bình nón, ống nghiệm và được hấp tiệt trùng (110 o C/30 phút hoặc 121 o C/15 phút). • Chuẩn bị mẫu và dung dịch mẫu thử - Chuẩn bị mẫu Mẫu thực phẩm được cắt nhỏ hoặc xay nhuyễn bằng máy trong điều kiện vô trùng cho tới khi được thể đồng nhất. • Chuẩn bị dung dịch mẫu thử - Cân chính xác 10g thực phẩm đã được chuẩn bị (hoặc hút 10ml thực phẩm lỏng) cho vào bình nón có chứa 90 ml nước pepton, lắc đều 2-3 phút thu được dung dịch mẫu thử 10-1. CÁC BƯỚC TIẾN HÀNH • Pha loãng mẫu - Chọn môi trường pha loãng: Sử dụng nước pepton hoặc nước đệm pepton nếu chỉ cần tính tổng số bào tử nấm men. - Sử dụng nước thạch hoặc nước pepton có thạch, nếu cần tính tổng số cả nấm men và nấm mốc hoặc chỉ có nấm mốc - Hút chính xác 1ml dung dịch mẫu thử 10-1 cho sang ống nghiệm có chứa sẵn 9 ml nước pepton, đều 2-3 phút thu được dung dịch mẫu thử 10- 2. Tiếp tục làm tương tự để có dung dịch pha loãng tiếp theo. Pha loãng mẫu cho đến khi có đậm độ pha loãng cần thiết đếm được số khóm nấm trên đĩa theo dự tính. • Đổ đĩa: - Đối với một mẫu kiểm nghiệm phải nuôi cấy ít nhất 3 đậm độ, mỗi đậm độ dùng 2 đĩa petri và một pipet đã tiệt khuẩn riêng. - Lấy 1ml sản phẩm lỏng hoặc dung dịch pha loãng ở những đậm độ khác nhau cho vào giữa từng đĩa petri - Thạch đã đun nóng chảy, để nguội đến 45 ±1 o C trong điều kiện vô khuẩn, điều chỉnh pH môi trường đến 4,5 - 5,5 bằng dung dịch axit lactic 20%, 40% hoặc dung dịch axit xitric 20% - Rót vào từng đĩa 12-15 ml môi trường thạch, trộn đều dung dịch mẫu với môi ttrường bằng cách lắc nhẹ sang phải và sang trái mỗi chiều 3 lần - Để các đĩa thạch đông tự nhiên trên mặt phẳng ngang - Thời gian bắt đầu pha loãng đến khi rót môi trường vào đĩa không được quá 30 phút • Ủ ấm: - Khi thạch đã đông, để các đĩa nuôi cấy vào tủ ấm ở nhiệt độ 28±1 o C hoặc khi nhiệt độ phòng tương ứng trong 5 -7 ngày. Không lật ngược đĩa - Sau 3 ngày, đếm kết quả sơ bộ, đếm tổng số các khóm nấm men và nấm mốc mọc trên các đĩa (chú ý nhẹ tay, không di chuyển mạnh hay lật ngược đĩa). - Sau 5-7 ngày đếm toàn bộ số nấm đã mọc và ghi nhận kết quả chính thức. • Đọc kết quả - Chọn tất cả các đĩa có số khóm nấm men từ 15 - 150, số khóm nấm mốc từ 5-50 của 2 đậm độ pha loãng liên tiếp để tính kết quả. - Sự phân bố các khóm nấm trên các đĩa petri phải hợp lý. Độ pha loãng càng cao thì số khóm nấm càng ít. Nếu kết quả không hợp lý phải tiến hành lại các bước nuôi cấy. TÍNH KẾT QUẢ a. Nếu chênh lệch giá trị ở 2 đậm độ nhỏ hơn hoặc bằng 2 lần, tính số (N) bào tử cho 1g(ml) sản phẩm bằng cách tính tổng số có khóm nấm đếm dược trên các đĩa theo công thức sau: ΣC N = ------------------- (n 1 + 0,1.n 2 ) d - C: Số khóm nấm men hoặc nấm mốc đếm được trên các đĩa đã chọn - n 1 ,n 2 : Số đĩa ở 2 đậm độ pha loãng liên tiếp đẫ chọn thứ 1 thứ 2 - d: Hệ số pha loãng của đậm độ pha loãng đã chọn thứ 1 (Làm tròn số kết quả có được, chỉ giữ lại 2 số có nghĩa) b. Nếu chênh lệch các giá trị ở 2 đậm độ pha loãng lớn hơn 2 lần, lấy giá trị pha loãng thấp hơn để tính kết quả theo trung bình cộng c. Nếu 2 đĩa của sản phẩm lỏng nguyên chất hoặc đậm độ pha lãng ban đầu (10-1) có ít hơn 15 khóm nấm men hoặc ít hơn 5 khóm nấm mốc, tính kết quả theo trung bình cộng . d. Nếu tất cả các đĩa không có khóm nấm nào mọc, đánh giá kết quả như sau: - Ít hơn 1 bào tử nấm men, nấm mốc trong 1ml sản phẩm loãng - Ít hơn 1x1/d bào tử nấm men, nấm mốc trong 1g sản phẩm khác. d: hệ số pha loãng của đậm độ pha loãng ban đầu 10 -1 BÁO CÁO KẾT QUẢ - Trong báo cáo kết quả kiểm nghiệm phải nêu phương pháp và kết quả tính được tổng số BT nấm men–nấm mốc có trong 1g hoặc 1ml sản phẩm kiểm tra - Sai lệch của phương pháp :Trong 95% trường hợp, sai lệch của phương pháp từ 12 đến 37% . . lần, tính số (N) bào tử cho 1g(ml) sản phẩm bằng cách tính tổng số có khóm nấm đếm dược trên các đĩa theo công thức sau: ΣC N = -- -- - -- - -- - -- - -- - -- (n 1 +. quả như sau: - Ít hơn 1 bào tử nấm men, nấm mốc trong 1ml sản phẩm loãng - Ít hơn 1x1/d bào tử nấm men, nấm mốc trong 1g sản phẩm khác. d: hệ số pha loãng