enzym xylanase trong công nghệ thực phẩm

enzym xylanase trong công nghệ thực phẩm

Enzyme trong công nghệ thực phẩm

Nhóm 1 – 49k hoá thực phẩm gồm các thành viên :

1 Hoàng Thị Phương Anh 0852049105

2 Nguyễn Thị Bảy 0852040449

3 Đinh Thị Quỳnh Bé 0852045283

4 Nguyễn Thị Chung 0852045298

5 Lê Thị Dung 0852040456

6 Nguyễn Thị Dung 0852040434

7 Nguyễn Cảnh Dũng 0852049081

8 Trần Anh Dũng 0852040452

9 Lê Thị Duyên 0852040429

Phần lớn enzyme được sản xuất ở quy mô công nghiệp đều thuộc loại enzyme đơncấu tử, xúc tác cho phản ứng phân hủy.Khoảng 75% chế phẩm là enzyme thủy phânđược sử dụng cho việc thủy phân cơ chất tự nhiên.

Enzyme pectinase là enzyme xúc tác sự thủy phân pectin Nó được sản xuất chủ yếu

bởi nấm mốc Aspergillus sp., Botrytis cinerea, Fusarium moniliforme,

Rhizopus stolonifer, Trichoderma sp., Neurospora crassa…

Enzyme pectinase thường được dùng trong công nghiệp thực phẩm và dược phẩm đặc biệt được sử dụng nhiều nhất trong sản xuất nước quả , sản xuất rượu vang, trích

ly đông dược ( sắc thuốc ), và trong chăn nuôi

Chương 1 : Tổng quan về enzyme pectinase 1.1 Giới thiệu chung về enzyme pectinase

Enzyme pectinase là enzyme xúc tác thủy phân liên kết ester hoặc liên kết glucoside

có trong mạch polyme của pectin

+ Pectin là tên chung được gọi cho những hỗn hợp chứa các thành phần rất khácnhau, trong đó pectinic acid là thành phần chủ yếu Các pectin tự nhiên định vị trongthành tế bào có thể liên kết với các cấu trúc polysaccaride và protein để tạo thành cácproto pectin không hòa tan Có thể phân hủy để làm cho pectin tan trong nước bằngcách đun nóng pectin trong môi trường acid Vì thế, các pectin tan thu nhận được làkết quả của sự phân hủy phân tử pectin không tan và chúng không đồng dạng vớinhau

+ Trong thực vật, pectin tồn tại dưới 3 dạng: pectin hòa tan, pectinic acid vàprotopectin

- Pectin hòa tan là ester methylic của acid polygalacturonic pectin, trong tự nhiên cókhoảng 2/3 số nhóm carboxyl của polygalacturonic acid được ester hóa bằngmethanol Pectin được ester hóa cao sẽ tạo gel đặc trong dung dịch acid và trongdung dịch đường có nồng độ 65% Enzyme pectinase tác động lên pectin có khốilượng phân tử khác nhau và cấu trúc hóa học không đồng dạng Cấu trúc hóa học cơ

bản của pectin là -D-galacturonan hay -D-galacturonoglycan, mạch thẳng có cấutạo từ các đơn vị D-galactopyranosyluronic acid (liên kết theo kiểu -1,4) Mặt khác,mức độ oxy hóa trong các phân tử polymer này cũng khác nhau, trong đó một số nhấtđịnh các nhóm carboxyl bị ester hóa bởi các nhóm methoxyl Trong một số trườnghợp, chẳng hạn trong pectin củ cải đường, có sự ester hóa giữa các nhóm carboxyl vàcác nhóm acetyl.

- Pectinic acid là polygalacturonic acid có một phần nhỏ các nhóm carboxyl đượcester hóa bằng methanol Pectinate là muối của pectinic acid Pectic acid làpolygalacturonic đã hoàn toàn giải phóng khỏi nhóm methoxy, tức là trong đó cóchứa một nhóm carboxyl tự do trên một đơn vị polygalacturonic acid Pectate là muốicủa pectic acid

- Protopectin tạo độ cứng cho quả xanh, không tan trong nước và có cấu tạo hóa họcphức tạp Trong thành phần pectin có các phân tử pectin, các phân tử cellulose và cácion Ca2+, Mg2+, các gốc phosphoric acid, acetic acid và đường Protopectin khi bị thủyphân bằng acid thì giải phóng pectin hòa tan

Protopectin (Insoluble ) + H2O  Pectin (Soluble )

1.1.2 Enzyme pectinase:

Hình 2 : cấu trúc phân tử pectinase

Enzyme pectinase là enzyme xúc tác sự phân hủy các polymer pectin Sự phân hủypectin trong tự nhiên thường xảy ra khi trái cây chín Những enzyme này vì vậy cómột vai trò hết sức quan trọng trong quá trình bảo quản trái cây và rau quả

1.2 Phân loại enzyme pectinase

Hiện nay hệ thống enzyme pectinase được chia làm 2 nhóm chính : hydrolase,transeliminase với đặc điểm chung nhất là làm giảm độ nhớt của dung dịch pectin vàlàm giảm phân tử lượng của các sản phẩm tạo thành

1.2.1 Enzyme hydrolase

Thuộc nhóm này có 2 enzyme chủ yếu là : pectinesterase và polygalacturonase

- Pectinesterase - gọi tắt là PE : enzyme xúc tác thủy phân liên kết este trong phân tửpectin hóa axit pectinic để giải phóng sản phẩm là methanol và axit polygalacturonic

PE chỉ phân cắt các nhóm metoxyl đứng cạnh nhóm –COOH tự do Pectinesterasethu được từ các nguồn khác nhau có giá trị pH tối ưu khác nhau Nếu thu từ nguồnVSV thì pH tối ưu từ 4.5-5.5, còn nếu từ nguồn thực vật thì có pH tối ưu từ 5.0-8.5

Pectinesterase từ nấm mốc có nhiệt độ tối ưu là 30-450C và bị vô hoạt ở 55-620C.Pectinesterase thường được hoạt hóa bởi các ion Ca2+ và Mg2+.

- Polygalacturonase - gọi tắt là PG : ( poly  1-4 - galacturonit glucanhydronase ) xúctác sự phân cắt các mối liên kết -1,4-glycosid Các exo-PG (exo-poly (1,4--D-galacturonide) galacturonohydrolase, EC 3.2.1.67), phân cắt từ các đầu không khử,

và endo-PG (endo-poly (1,4--D-galacturonide) glycanohydrolase, EC 3.2.1.15) tấncông ngẫu nhiên vào giữa mạch cơ chất

Enzyme này ít gặp trong thực vật, chủ yếu gặp trong vi khuẩn và nấm mốc Đây làmột phức hệ enzyme và thường có tính đặc hiệu cao đối với cơ chất Dựa vào đóngười ta chia ra 4 kiểu sau :

+ Polymetyl – galacturonase ( PMG – Poly -  1-4 – galacturozit – metyl esteglucanhydrolase ) PMG được phân thành 2 nhóm nhỏ phụ thuộc vào vị trí phân cắtliên kết  1,4 ở trong hay ở cuối và đầu mạch

 Endo glucozidase polymetyl galactunase kiểu I ( endo- PMG – I ) Đây là enzyme

có tính chất dịch hóa , pectin có mức độ metyl hóa càng cao ( nhiều gốc metoxy –OCH3) thì bị thủy phân càng nhanh và triệt để Trong môi trường khi có mặtpectinesterase ( PE ) thì enzyme này càng bị giảm hoạt lực

Endo – PMG – I rất phổ biến trong các nấm mốc : Asp , Niger , Asp.Awamori,

Botrytis cinezea , Neurispora crassa

Cơ chế tác dụng như hình vẽ :

 Enxo – glucozidase polygalacturonase kiểu IV ( exo- PG- IV )

Thủy phân các liên kết gắn với nhóm –COOH tự do ở đầu hay mối mạch

1.2.2 Transeliminase ( TE )

Đây là nhóm enzyme được tìm ra cách đây chưa lâu lắm ( khoảng năm 1960-1961)bao gồm protopectinase xúc tác sự phân cắt araban , galactan khỏi protopectin để tạothành pectin hòa tan và enzyme transeliminase phân cắt phi thủy phân ( không có sựtham gia của phân tử nước ) pectin để tạo ra các gốc galacturonic có nối kép giữa C4,

và C5 Phản ứng xảy ra dễ dàng ở môi trường trung tính hay kiềm yếu

1.3 Các nguồn thu nhận enzyme pectinase

1.3.1 Sơ lược chung

Có hai loại enzyme là: nội bào và ngoại bào, mỗi enzyme đòi hỏi phải có phươngpháp tách và thu nhận riêng:

Enzyme ngoại bào: (gồm pectinase) do vi sinh vật tiết ra trong môi trường

nuôi cấy ngoài tế bào, thường hòa tan trong nước do đó dễ trích ly và tinhsạch

Enzyme nội bào: là enzyme được sản xuất ra bên trong tế bào vi sinh vật và

không được tiết ra môi trường bên ngoài Những tế bào vi sinh vật sau khiđược nuôi cấy sẽ được tách ra và phá vỡ tế bào Mục đích của việc này là giảiphóng toàn bộ các chất có trong tế bào gồm cả enzyme nội bào Hỗn hợp thuđược sẽ đem ly tâm tách tạp chất và những chất có phân tử lượng lớn; cònenzyme sẽ được kết tủa bằng cồn hay muối Enzyme sau đó sẽ được đem tinhsạch

B

:

So sánh enzyme nội bào và enzyme ngoại bào

Enzyme nội bào Enzyme ngoại bào

Phải phá vỡ thành tế bào Không cần phá vỡ thành tế bào

Thường lẫn chung với các chất khác

của tế bào sau khi bị phá vỡ (acid

nucleic, chất nguyên sinh, lipid….)

Không lẫn chung với các thành phầnnội bào, nếu có chỉ là một vàienzyme ngoại bào khác

Chỉ bền vững ở trong môi trường nội

1.3.2 Thu nhận enzyme pectinase

Hiện nay người ta thu nhận pectinase chủ yếu từ VSV Có 2 phương pháp sản xuất pectinase :

+ Thu nhận chế phẩm enzyme pectinase theo phương pháp bề mặt

+ Thu nhận chế phẩm enzyme pectinase theo phương pháp bề sâu

1.3.2.1 Thu nhận chế phẩm enzyme pectinase theo phương pháp bề mặt

Môi trường sử dụng để nuôi cấy VSV để thu nhận pectinase thường là cám gạo hay cám mì, bã củ cải hay thóc mầm Nguồn dinh dưỡng bổ sung thường là amonium, photphoric Độ ẩm môi trường phải nằm trong khoảng 60%

Nấm mốc A.awamori thường được nuôi cấy ở 300C trong thời gian 40giờ, sau đó giảm xuống 240C và nuôi cấy trong thời gian 48-52 giờ Sản phẩm lên men được sấy khô thành chế phẩm enzyme thô và đem tinh chế

Để thu được chế phẩm pectinase tinh khiết thì chế phẩm enzyme thô phải được trích

ly bằng phương pháp kết tủa nhờ dung môi hữu cơ hay muối amoni sunfat Dung môihữu cơ dùng để kết tủa enzyme pectinase có thể là rượu etanol ( 72.5-75% ) hoặc isopropanol ( 55-57%) Muối amonium sunfat sử dụng có độ bão hòa 0.79 Khi kết tủa bằng rượu ethanol chế phẩm enzyme thu được có độ tinh khiết 90%, còn nếu bằng muối thì có độ tinh khiết 75% Nhiệt độ kết tủa tối ưu với rượu là 2-50C, thời gian tiếp xúc với rượu càng ngắn càng tốt Sau đó ly tâm để tách kết tủa khỏi dung dịch, sấy kết tủa trong thiết bị sấy chân không hay sấy thăng hoa rồi nghiền nhỏ và đem bảo quản

1.3.2.2 Thu nhận chế phẩm enzyme pectinase theo phương pháp bề sâu

trường nuôi cấy của các A.niger và A.awamori 16 có thể dịch về 3.5-3.8 và 2.9-3.2

theo thứ tự

Vật liệu gieo cấy có thể là sợi nấm 24, 32, và 48 giờ tuổi và với hàm lượng từ

2-10% Đối với A.niger và A.awamori, vật liệu gieo là sợi nấm được ủ sơ bộ trong môi

trường dinh dưỡng cho đến khi bắt đầu sinh bào tử Thời gian ủ sơ bộ thường là

38-42 giờ Lượng sợi nấm đem gieo cấy thường là 2% Trong quá trình nuôi cấy, hàm lượng chất hòa tan trong môi trường thường giảm từ 6% xuống còn 1.5-1.8%

Để thu chế phẩm khô, cần tách sợi nấm ra khỏi canh trưòng lỏng Cô đặc chân khôngcanh trường lỏng đến khi hàm lượng chất khô đạt từ 5-8% rồi sấy khô trên thiết bị sấyphun , điều kiện sấy phun là nhiệt độ chất tải nhiệt đi vào phải đạt từ 165-1800C và đi

ra đạt 60-700C Thời gian lưu của chế phẩm enzyme trong thiết bị sấy phun không quá 7 giây và nhiệt độ chế phẩm sau khi sấy không quá 400C Chế phẩm thu được cầnphải được đóng gói kín để tránh hút ẩm Có thể thu được chế phẩm enzyme pectinase tinh khiết bằng cách kết tủa enzyme trong dịch lọc canh trường với ethanol theo tỉ lệ

4:1, với axeton theo tỉ lệ 2:1, với isopropan theo tỉ lệ 1.3:1, hoặc với muối amoni sunfat ( 50-80% ) trong muối kết Nếu kết tủa bằng ethanol, hoạt độ pectin trong kết tủa sẽ vào khoảng 88-90% so với hoạt độ của dịch canh trường ban đầu Nếu kết tủa bằng muối amoni sunfat Cần tách muối ra khỏi enzyme bằng phương pháp thẩm tích (với nước hoặc dung dịch đệm ), sau đó sấy khô Khi độ bão hòa của (NH4)2SO4=0.5 thì sẽ kết tủa được đoạn có hoạt độ pectinase thấp( đoạn này chiếm 0.25% trọng lượng khô ) Nhưng nếu kết tủa bằng (NH4)2SO4 có độ bão hòa 1.0 thì sẽ kết tủa được đoạn chỉ chiếm 0.11% nhưng lại có hoạt độ pectinase cao.

+ Nước chiết ngô 0.5%

Clostridium pectinopermentants 15 có khả năng tổng hợp pectinnase một cách mạnh

mẽ ở pha tăng trưởng của quá trình sinh trưởng và tăng đồng thời với sự tích lũy enzyme sẽ tối đa tương ứng với pha ổn định của sự sinh trưởng qua 55-60 giờ pH ban đầu của môi trường dung dịch là 6.5-7.0 Vật liệu gieo cấy ban đầu được chuẩn bị

ở dạng canh trường chứa bào tử và được cấy với lượng 4% theo thể tích Quá trình nuôi cấy được tiến hành ở nhiệt độ 350C

Cl Felsineum cũng có thể được nuôi cấy yếm khí để thu pectinase

Thành phần môi trường gồm có : (NH4)2HPO4 0.4% , KH2PO4 0.3%, K2HPO4 0.7%, NaCl 0.1% , MgSO4 0.025% , FeSO4 dạng vết, CaCO3 0.5%, dịch nấm men tự phân 0.05%, ascorbic axit 0.5%

Có thể tiến hành thu phế phẩm từ dịch lọc canh trường bằng cách kết tủa enzyme với dung môi hữu cơ hoặc với muối amoni sunfat Nếu kết tủa bằng dung môi hữu cơ, pHcủa dung dịch đã xử lý là 6.5-6.8 Nếu kết tủa bằng 2-2.5 thể tích axeton thì hoạt độ của enzyme trong kết tủa đạt 93-95% so với hoạt độ ban ban đầu

Khi kết tủa bằng amoni sunfat có độ bão hòa bằng 0.2 thì sẽ thu được chế phẩm chỉ chứa pectinesterase và pectintranseliminase và exopolygalacturonase

Phương pháp hiện đại trong chuẩn bị chế phẩm enzyme pectinase thường theo các bước cơ bản sau đây :

 Khử muối bằng phương pháp lọc gel ( Biogel P100)

 Tách protein bằng phương pháp trao đổi ion ( DEAE Biogel A ) hay trao đổi cation

( CM Biogel A)

 Tách enzyme pectinase bằng alginate liên kết ngang

Đặc điểm của pectinesterase thực vật :

Bên cạnh pectinesterase ( PE ) vi sinh vật, hầu hết các loại cây cho trái đều chứa enzyme PE Enzyme này thường tồn tại dưới nhiều hình thức khác nhau, nằm trong phần vỏ tế bào PE ở thực vật nói chung có hoạt độ tối ưu trong khoảng pH hơi kiềm Các cation kim loại ở nồng độ thấp như Ca2+ có khuynh hướng làm tăng nồng độ hoạtđộng của enzyme

- Cà chua chứa ít nhất hai loại PE Cả PE1 và PE2 đều tăng trong giai đoạn đầu của quá trình chín Khi bước vào giai đoạn chín, nồng độ enzyme PE1 giảm xuống,

nhưng PE2 tích lũy dần cho trái cây có màu đặc trưng của trái chín PE2 có khối lượng phân tử 23kD, pH tối ưu 7.6 Enzyme này bị bất hoạt 50% sau 5 phút đun ở

670C Các ion Ca2+ và Na+ làm tăng hoạt độ của enzyme lên tối đa ở các nồng độ 0.005M và 0.05M theo thứ tự PE của đậu nành là protein có khối lượng phân tử 33kD, hoạt động tối ưu tại pH gần bằng 8 Polygacturonic acid, sản phẩm hình thành

do quá trình đề methyl hóa, là một chất ức chế cạnh tranh

- Trong thịt quả chuối có 2 isoenzyme PE Cả hai có cùng khối lượng phân tử là30kD, nhưng có điểm đẳng điện khác nhau : 8.8 và 9.3 Các enzyme này hoạt động ở

pH tối ưu là 7.5 Hoạt độ enzyme tăng lên khi thêm vào dung dịch NaCl ở nồng độ0.2M và đưa pH của dung dịch về 6.0 Các enzyme này bị ức chế bởi nhiều loạipolyol có khối lượng phân tử thấp như glycerol, sucrose, glucose, maltose vàgalactose

PE trong quả cam có hai loại : Đó là 2 enzyme PE1 và PE2 có khối lượng phân tử36kD, nhưng có điểm đẳng điện khác nhau là 10.05 và 11.0 theo thứ tự pH tối ưucủa PE1 là 7.6 , còn của PE2 là 8.0

- Thịt quả cũng chứa 2 isoenzyme, một trong hai enzyme này có tính bền nhiệt hơn,còn enzyme kia thì ít mẫn cảm hơn khi tác động của protease Độ ổn định củaenzyme có thể liên quan đến mức độ của glucosyl hóa của các phân tử enzyme.Enzyme bền nhiệt hơn và enzyme kia có khối lượng là 51kD và 36kD theo thứ tự.

- Cả táo và kiwi cũng chứa 2 isoenzyme Các isoenzyme của kiwi có cùng khốilượng phân tử là 57kD và cùng điểm đẳng điện là 7.3 Tuy nhiên chúng khác nhau vềmức độ bền nhệt Một điểm đáng lưu ý là tất cả enzyme vi sinh vật đều không phải làprotein kiềm PE của Trichoderma reerei có điểm đẳng điện nằm trong khoảng 8.3-

9.5 và pH tối ưu là 7.6 Tuy nhiên PE của Aspergillus có điểm đẳng điện và pH tối ưu trong khoảng acid Hoạt động của enzyme sinh ra bởi A.niger đạt tối đa ở pH 4.5 ở

400C Các PE acid và kiềm có thể đề methyl hóa cơ chất pectin theo cùng một kiểu

PE kiềm làm hình thành các pectin được đề ester hóa và pectin này có thể tạo gel yếuvới ion Ca2+ , PE acid tạo ra pectin bị đề ester hóa có khả năng tạo gel mạnh với ion

Ca2+

+ Trình tự aminoacid : Cấu trúc bậc một của PE cà chua chứa 305 amino acid với

khối lượng phân tử 33239 Enzim này có chứa 2 cầu nối disulfide (Cys98-Cys125 và

Cys166-Cys200) Cys 166 có mặt trong tất cả các enzyme pectinesterase.Trình tự

amino acid suy luận trên cơ sở các nucleotit cho thấy sự không nhất quán, 18 trong

27 vị trí khác nhau, có thể làm thay đổi điện tích của protein Mặt khác chỉ có khoảng94% trình tự amino acid trong một phần chuỗi amino acid có tính đồng dạng với toàn

bộ trình tự của nucleotit Sự thống nhất quán này có thể phản ánh sự tồn tại củaisoenzyme, mặc dù chỉ có 2 isoenzyme trong cà chua được biết đến Một số gen mãhóa cho các enzyme PE đã được tách dòng và nghiên cứu đặc điểm Gen tách dòng từ

Pseudomonas mã hóa cho PE có chứa 396 amino acid với khối lượng phân tử là

41004

+ Cơ chế methyl hóa : PE loại bỏ các nhóm methoxyl trong phân tử pectin bằng

tương tác ái nhân của enzyme lên ester, làm hình thành hợp chất trung gian enzyme và cacboxylic acid

acyl-Các PE có nguồn gốc thực vật phản ứng theo kiểu làm hình thành các khối pectin

có chứa các nhóm cacboxylate dọc theo mạch pectin Enzyme của Trichoderma

reesei là một protein cơ bản cho kiểu phản ứng tương tự Enzyme của các loài Asperillus với pH tối đa trong vùng acid, xúc tác phản ứng từ bên trong.

Ảnh hưởng của các ion kim loại khi kích hoạt enzyme pectinesterase có thể liênquan đến tương tác của nó với cơ chất Polygalacturonic acid là một chất ức chế cạnhtranh trong phản ứng thủy phân nhờ xúc tác của PE Pectin chứa các nhómcacboxylate được sắp xếp như hình khối có thể tác dụng theo cách tương tự Sự liênkết của các ion kim loại vào các nhóm cacboxylate trong trường hợp này có khuynhhướng trung hòa ảnh hưởng ức chế của cơ chất pectin lên enzyme Tuy nhiên, lượng

dư của các ion này trên thực tế gây ra sự bất hoạt của PE vì các ion kim loại bị vâyquanh bởi các nhóm cacboxylate nằm kế cận với các liên kết ester cần thiết cho phảnứng thủy phân xảy ra

2.1.2 Vi sinh vật

Nhiều vi sinh vật sống trong đất, trong nước có khả năng phân giải pectin Chúng có

ý nghĩa quan trọng không những đối với vòng tuần hoàn 2 cacbon trong tự nhiên màcòn đối với một số ngành sản xuất trong công nghiệp

Những vi sinh vật có khả năng phân giải pectin mạnh mẽ nhất :

+ Nấm mốc : Asp ficuum, Asp.niger, Asp.oryzae, Asp.awamori, Asp.terrus,

Asp.saitoi, Pen.glaucum, Pen.chrlichii, Mucor mucedo, Rhizopus tritici,…

Trong số các biến chứng của nấm mốc đáng chú ý là Asp.niger và Asp.awamori.

+ Nấm men: Sac.fragilis, Sac.ellipsoideus, Sac.ludwigii,…

+ Vi khuẩn : Bac.polymyxa, felseneus, Clostridium roserum, Pseudomonas

flurescens

Tất cả các vi sinh vật dùng để thu enzyme pectinase đều là vi sinh vật hiếu khí

Đặc điểm phân bố enzyme pectinase ở vi sinh vật :

Sự phân bố các kiểu enzyme pectinase ở vi sinh vật không giống nhau : có cơ thể chỉtạo được một enzyme song đa số cơ thể khác lại tạo ra được một phức hệ enzymepectinase khác nhau mà tùy theo loài

- Sac.fragilis : chế tạo ra duy nhất 1 loài enzyme phân giải pectin dải nhất là

endo-polygalacturonase

- Các nấm mốc Asp.niger, Asp.awamori, Asp.foelidus, Asp.saitoi… thường tạo ra

được một phức hệ enzyme pectinase khác nhau

- Enzyme pectinesterase: chủ yếu được tạo ra từ Asp.niger Ngược lại ở

Pencitrimim.Ag.campestris lại không tạo được enzyme này.

- Các enzyme pectin-hydrolase (pectinesterase và polygalacturonase): chủ yếu được

tạo ra từ vi khuẩn Erwinia caralovora, Bac.polymxa, Klebsiella acrogens, Flavobact

Các enzyme pectinase ở vi sinh vật có thể là enzyme cảm ứng, hoặc chỉ là enzyme

bản thể Theo F.Moran và M.P.Starr, các VSV Erwinia eurolovora và Erwinia

aroideae chỉ tạo ra enzyme polygalacturonat-transeliminase bản thể song sẽ tạo ra

enzyme này cảm ứng khi có mặt acid Polygalacturonic hoặc các sản phẩm phân giảicủa nó Ngược lại D.Knosel thì cho rằng các acticomyces chỉ có khả năng sinh tổng

hợp ra enzyme polygalacturonat-transeliminase cảm ứng.

Một điểm khác cũng đáng lưu ý là các enzyme pectinase ở các vi sinh vật khôngnhững khác nhau về đặc điểm phân bố mà còn khác nhau về tính chất

Điều kiện hình thành enzyme pectinase bởi các vi sinh vật

Sự sinh trưởng tốt của vi sinh vật trên môi trường này hay môi trường khác chưa thểcoi là chỉ tiêu của sự tân tạo tối đa của 1 enzyme cần thiết nào đó Môi trường màtrước hết là nguồn C, N, P được chọn một cách đặc hiệu sẽ đảm bảo được sự địnhhướng tổng hợp các enzyme, không những vậy môi trường dinh dưỡng sẽ còn tácđộng đến các enzyme trong chế phẩm thu được Theo P Kontio, với enzyme

pectinase, chế phẩm enzyme thu được khi nuôi cấy Aspergillus niger trên môi trường

dinh dưỡng khác nhau sẽ khác nhau về vị trí số pH tối ưu trên cơ chất

2.1.2.1 Ảnh hưởng của chất cảm ứng và nguồn cac bon

- Chất cảm ứng pectin bắt buộc

- Nguồn các bon : polysaccharide, disaccharide, monosaccharide

Nếu sử dụng hỗn hợp gluxit trong đó có pectin để nuôi cấy vi sinh vật thì hoạt lực củapectinase ngoại bào có thể tăng 4 – 6 lần so với khi nuôi cấy không có pectin

Giống Asp.Niger được nuôi cấy trên môi trường có nhiều nguồn các bon như pectin ,

tinh bột, isulin, lactose, saccarose, mantose, galactose nồng độ 2, 4, 6 % sẽ cho

pectinase có hiệu suất cao Tuy nhiên nên nuôi cấy trên môi trường chỉ có

monosaccarit và glyxerin thì hoàn toàn không thể sinh tổng hợp này Đường glucose

có tác dụng kìm hãm sinh tổng hợp enzyme pectinase trên môi trường nuôi cấy là

pectin và lactose đối với loài Asp.Niger , Asp.Awamori

Trên 100g sợi nấm khô Pectin 2%

0,320 0,510 0,020 0,020 0,300 0,500 1,120 1,125

385,9 640,2 00 00 65 20 1894,2 864,3

1206 1250 00 00 21 40 1600 690

Bảng 2 : Ảnh hưởng của nguồn cacbon

2.1.2.2 Ảnh hưởng của nguồn nitơ

Nếu dùng kết hợp nitơ hữu cơ và vô cơ sẽ có tác động tốt đến quá trình sinh tổng hợppectinase Tuy nhiên, muối nitrat kim loại kiềm lại kìm hãm enzyme này.

Ví dụ:

- Đối với Asp.niger thì sử dụng muối photphat diamon ( NH4H2PO4 ) để sinh tổng hợp enzyme pectinase tốt nhất

- Đối với Asp.awamori thì nguồn nitơ thuận lợi nhất là amoni sunphat (NH4)2SO4

- Đối với nấm mốc Asp.Foetidus thì (NH4)2SO4 , nước chiết nấm men có tác dụng nâng cao hoạt lực polygalacturonase

- Khi sử dụng các nguồn nitơ tối ưu này ta nhận thấy dịch canh trường bị acid hoá đến pH = 2,5-3,0 và có sự tích luỹ enzyme pectinase tốt hơn

Nói chung, tỉ lệ thích hợp nhất đối với C/N khi tổng hợp pectinase trong khoảng 7/1 – 13/1

Hđ P đvị/10ml

Hđ PE Hđ PMG Hđ PG

Đơn vị/g (NH4)2HPO4

NaNO3 NH4NO3

Pepton Dịch thuỷ phân

casein

(NH4)2HPO4

NaNO3 NH4NO3

Pepton Dịch thuỷ phân

casein

1,200 0,890 0,850 1,500 1,550

1820,7 880,6 810,9 1620,0 1350,0

0,491 0,197 0,163 0,418 0,340

0,560 0,310 0,278 0,410 0,450

0,885 0,560 9,560 0,750 0,800 Saccharose 2% + pectin 2%

1,150 0,920 0,890 1,300 1,450

820,2 590,4 94,8 750,7 7,003

0,163 0,083 Vết 0,160 0,120

0,420 0,280 0,060 0,340 0,370

0,580 0,520 0,320 0,500 0,530

Bảng 3 : Ảnh hưởng của nguồn nitơ

2.1.2.3 Ảnh hưởng của các yếu tố khác

Ngoài nguồn C, N, các nguyên tố vô cơ cũng có ảnh hưởng quan trọng đến sự tạo thành phức hệ enzyme này Trong số đó P là cấu tử vô cơ cần thiết của môi trường Hàm lượng P trong môi trường phải là 8-10% Khi sử dụng nguồn N của phốtphát diamon thì nhu cầu về P của nấm mốc hoàn toàn được thỏa mãn Các yếu tố khác như

pH của môi trường dinh dưỡng, phương pháp nuôi cấy và điều kiện nuôi cấy đều ảnh hưởng đến sự tạo ra enzyme pectinase

2.1.3 Môi trường lên men giống

• Nấm mốc Asp.niger được giữ giống trên môi trường Czapek

• Chuẩn bị bột cà rốt: cà rốt xay nhuyễn, sấy ở nhiệt độ 60oC cho đến khi độ ẩm

Thuyết minh quy trình :

+ Nguyên liệu được trộn với nhau

+ Làm ẩm : có ý nghĩa quan trọng trong điều kiện sản xuất lớn, hàm ẩm tối ưu của môi trường cám là 58-60% Khi nuôi cấy trong điều kiện tiệt trùng nghiêm ngặt thì đạt hoạt độ enzyme cao nhất khi làm ẩm 65-68% Tuy nhiên nếu môi trường quá ẩm thì sẽ bị dính bết ( khi hấp thanh trùng, làm tơi, khi nuôi cấy ), dễ bị nhiễm vi sinh vậttạp ( bị lên men rượu, lên men giấm…) Để làm ẩm có thể dùng nước trộn với nguyên liệu rồi thanh trùng hoặc làm ẩm sơ bộ rồi thanh trùng sau đó dùng nước vô trùng ( nước ngưng tụ, nước đun sôi để nguội ) để điều chỉnh lại độ ẩm của khối nguyên liệu Cách sau có thể rút ngắn thời gian làm nguội, khống chế được độ ẩm chính xác hơn nhưng đòi hỏi phải thanh trùng ở nhiệt độ và áp suất cao hơn.

+ Thanh trùng bằng hơi nhiệt :

Làm cho môi trường được tinh khiết hơn về phương diện vi sinh vật và làm cho chín ( biến hình ) môi trường ( tinh bột, protein ) Thông thường người ta thanh trùng bằnghơi nước trực tiếp ở nhiệt độ 120-1300C trong 2-3 giờ

+ Làm nguội và làm tơi môi trường để gieo giống :

Khối môi trường vừa hấp xong còn nóng và dính bết Vì vậy phải làm nguội và làm tơi để thuận tiện cho việc gieo giống và phân phối vào các dụng cụ nuôi cấy Yêu cầuthời gian này phải ngắn để hạn chế nhiễm khuẩn từ bên ngoài Nhiệt độ yêu cầu đạt được để gieo giống là 35-390C

+ Nuôi cấy nấm mốc :

Nhằm đủ lượng bào tử giống cho toàn bộ môi trường nuôi cấy Quy trình công nghệ thực hiện tương tự như trong sản xuất lớn nhưng phải thực hiện các điều kiện kỹ thuật đặc biệt và khắt khe hơn như : nguyên liệu phải tốt, giàu chất dinh dưỡng hơn, điều kiện nuôi cấy khống chế nghiêm ngặt hơn, thời gian nuôi cấy dài hơn ( gần gấp đôi ) để nấm mốc hình thành nhiều bào tử và đều

+ Tiến hành quá trình nuôi cấy

Sau khi gieo giống và phân phối vào các dụng cụ nuôi ( mành hay khay đục lỗ ) rồi chuyển vào phòng nuôi có điều chỉnh nhiệt độ và độ ẩm tương đối của không khí ()cũng như mức độ thông khí Quá trình nuôi cấy nấm mốc kéo dài 33-48 giờ/mẻ được trải qua 3 giai đoạn :

- Giai đoạn 1 : Từ khi nôi cấy nấm mốc giống đến giờ nuôi cấy thứ 10-12 Xảy ra sự trương nở bào tử và xuất hiện cuống nấm Để đảm bảo sự nảy mầm nhanh và hạn chếnhiễm tạp, cần giữ độ ẩm nguyên liệu 55-60%,  = 96-100%, T= 30-320C

- Giai đoạn 2 : Kéo dài trong 10-18 giờ Nấm mốc phát triển mạnh, lan khắp bề mặt

và trong toàn khối môi trường ( khuẩn ti ăn sâu vào cơ chất) dẫn đến hiện tượng kết bánh Quá trình hô hấp và tỏa nhiệt mạnh làm môi trường bị khô xốp, tăng hàm lượng

CO2, nhiệt độ phòng nuôi tăng lên

38-400C Để khống chế nhiệt độ thích hợp 28-300C cần thông gió ( quạt ) và bão hòa

ẩm không khí phòng nuôi

- Giai đoạn 3 : Kéo dài trong 10-20 giờ và đặc trưng nhất vì tạo ra enzyme nhiều nhất Cường độ trao đổi chất giảm đi chút ít, nhiệt tỏa ra ít hơn nên tốc độ bốc hơi nước của môi trường nuôi cấy cũng giảm theo Quá trình nuôi cấy được chấm dứt khimấm mốc đạt độ già chín sinh lý và bắt đầu tạo thành bào tử

+ Thu nhận chế phẩm enzyme thô

Kết thúc quá trình nuôi cấy ta thu nhận được chế phẩm enzyme pectinase, chế phẩm này được gọi là enzyme thô ( vì ngoài thành phần enzyme ra còn chứa sinh khối vi sinh vật, thành phần môi trường và nước trong môi trường).

Để đảm bảo chế phẩm enzyme pectinase không bị mất hoạt tính nhanh người ta thường sấy khô chế phẩm enzyme đến một độ ẩm thấp

Tùy theo mục đích sử dụng ta có thể dùng chế phẩm thô không cần phải quá trìnhtinh sạch Trong những trường hợp cần thiết khác, ta cần phải tiến hành làm sạchenzyme Để sản xuất enzyme tinh khiết người ta phải tiến hành như sau:

- Toàn bộ khối lượng enzyme thô pectinase được đem đi nghiền nhỏ Mục đích củaquá trình nghiền là vừa phá vỡ thành tế bào vừa làm nhỏ các thành phần của chếphẩm thô Khi thành tế bào được phá vỡ, các enzyme nội bào chưa thoát ra khỏi tếbào sẽ dễ dàng thoát ra khỏi tế bào Phần lớn enzyme pectinase ngoại bào khi đượctổng hợp và thoát ra khỏi tế bào ngay lập tức thấm vào thành phần môi trường Khi tanghiền nhỏ, enzyme thoát ra khỏi thành phần này dễ dàng hơn

- Trong khi nghiền người ta thường sử dụng những chất trợ nghiền trong trường hợpnày được dùng là cát thạch anh và bột thủy tinh Các chất này là những chất vô cơkhông tham gia vào phản ứng và khả năng tăng mức độ ma sát trước khi sử dụng cátthạch anh và bột thuỷ tinh phải được rửa sạch, sấy khô ở nhiệt độ lớn hơn 100oC đểloại bỏ nước và tiêu diệt vi sinh vật

- Trích ly:

Sau khi nghiền mịn người ta cho nước vào để trích ly enzyme pectinase

Các loại enzyme thủy phân có khả năng tan trong nước nên người ta thường dùngnước như một dung môi hòa tan.Cứ một phần chế phẩm enzyme thô, người ta cho 4-5phần nước, khuấy nhẹ và sau đó lọc lấy dịch, phần bã thu riêng dùng làm thực phẩmgia súc(chú ý cần loại bỏ các thạch anh và bột thủy tinh ra khỏi hỗn hợp bã rồi mớicho gia súc ăn )

Dịch thu nhận được vẫn ở dạng chế phẩm enzyme thô vì trong đó chứa nước và cácchất hòa tan khác từ khối lượng môi trường nuôi cấy Việc tiếp theo là làm sao táchenzyme ra khỏi vật chất này

- Quá trình kết tủa enzyme pectinase :

* Để làm việc trên người ta tiến hành kết tủa enzyme nhờ những tác nhân gây kết tủa.Trong công nghệ tinh chế enzyme, người ta thường dùng cồn và sunfat amon Hai tácnhân kết tủa này dễ tìm kiếm và giá rẻ so với những tác nhân gây kết tủa khác.

* Trong khi tiến hành kết tủa, người ta phải làm lạnh cả dung dịch enzyme thô và cảnhững tác nhân kết tủa để tránh làm mất hoạt tính enzyme Khi đổ chất làm kết tủaenzyme vào dung dịch enzyme thô phải hết sức từ từ để tránh hiện tượng biến tính

* Trong quá trình kết tủa người ta dùng cồn hoặc sunfat amon với liều lượng nhưsau:

Cứ một phần dung dịch enzyme thô người ta cho 2 đến 2.5 lần cồn hoặc sulfatamon

Khi cho chất kết tủa vào dung dịch enzyme thô, người ta tiến hành khuấy nhẹ sau đó

để yên trong điều kiện nhiệt độ lạnh (thường là 4-7oC) theo thời gian các enzyme sẽđược tạo kết tủa và lắng xuống đáy, người ta tiến hành gạn và lọc thu nhận kết tủadạng paste ( độ ẩm lớn hơn 70%W), ở trạng thái này enzyme rất dễ bị biến tính vì cònnhiều nước để dễ bảo quản người ta sấy kết tủa enzyme pectinase cho đến khi độ ẩmcuối cùng đạt W = 5-8%

Trong nhiều trường hợp chế phẩm enzyme pectinase ở dạng kết tủa vẫn hoàn toàn chưa sạch về mặt hóa học vì trong đó còn chứa 1 số enzyme ta quan tâm

2.3 Quy trình tách chiết và làm sạch

2.3.1 Giới thiệu chung :

Các dạng chế phẩm enzyme:

+ Chế phẩm thô

- Chế phẩm thô từ canh trường lỏng

- Chế phẩm thô từ canh trường bề mặt

+ Chế phẩm kỹ thuật

Là chế phẩm được tinh chế sơ bộ, trong đó một số protein và enzyme tạp đã đượctách ra Trong chế phẩm kỹ thuật thường chứa một vài enzyme chủ yếu

+ Chế phẩm tinh khiết

Là chế phẩm trong đó chỉ chứa một loại enzyme nhất định với hàm lượng cao

Thường tinh sạch enzyme từ các chế phẩm enzyme thô Chế phẩm thô thường chứa những thành phần cơ bản sau:

 Nước chiếm khối lượng lớn nhất

 Protein không có hoạt tính sinh học

 Các tạp chất từ tế bào ( nếu là nguồn động vật, thực vật ), từ môi trường nuôi cấy(nếu là nguồn VSV)

 Enzyme (hay protein có hoạt tính sinh học cao)

Quá trình tinh sạch enzyme là quá trình loại bỏ ba phần đầu, chỉ nhận sản phẩm cuối

là enzyme mong muốn (trong đó phần lớn enzyme tạp đã được loại bỏ) Việc loại bathành phần đầu không thể cùng thực hiện trong một giai đoạn mà phải thực hiện quanhiều giai đoạn khác nhau, ở mỗi giai đoạn, ta sẽ loại bỏ được một phần không phải

là enzyme mong muốn ra khỏi hỗn hợp, khối lượng chế phẩm sẽ giảm theo

 Ý nghĩa của kỹ thuật tinh sạch trong công nghệ enzyme

Các kỹ thuật tinh sạch thường đưa lại những kết quả quan trọng sau:

+ Khối lượng chế phẩm enzyme được giảm dần qua từng bước tinh sạch

+ Tăng hoạt tính enzyme có ý nghĩa quan trọng trong quá trình sử dụng sau này.+ Tăng giá trị kinh tế thông qua giá thành sản phẩm

+ Tạo những chế phẩm tinh khiết nhằm mục đích nghiên cứu hoặc ứng dụng trong yhọc…

Tóm tắt các giai đoạn tinh sạch :

Phá vỡ tế bào Cơ học, vật lý, hóa học, sinh học

Chiết tách enzyme Nước, acid, kiềm loãng, dung dịch

đệm, dung mô hữu cơTách các phần tử không hòa tan Ly tâm, lọc

Loại các thành phần không phải

Tách phân đọan protein và enzyme:

Sử dụng acid, kiềm, nhiệt độ

Hấp thụ, trao đổi ion, ái lực, lọc gel

Trong gradient nồng độ gel polyacrylamide

Trên cột hoặc gel bản mỏng

Bằng muối hoặc bằng dung môi hữu

cơ

-Siêu lọc

-Kết tủa đẳng điện

Hình3: Các kỹ thuật tách và tinh chế enzyme theo các đặc tính của chúng

2.3.2 Phưong pháp kết tủa:

2.3.2.1 Giới thiệu chung về phương pháp:

Phương pháp kết tủa chỉ hiệu quả khi hàm lượng protein trong dung dịch lớnhơn 100mg/mL Thông thường đây chỉ là giai đoạn đầu của quá trình tinh sạch:

a) Kết tủa đẳng điện

Một protein hay một protein enzyme thường hòa tan ít nhất ở điểm đẳng điện(pI) vì ở pI các phân tử protein enzyme có tổng điện tích bằng 0, tức là không có lựcđẩy tỉnh điện, nên các phân tử protein enzyme sẽ kết hợp với nhau tạo ra kết tủa Vì

vậy ta có thể kết tủa đẳng điện enzyme quan tâm cũng như các enzyme, protein tạpkhác Sau đó lọc hay ly tâm để thu hoặc loại bỏ kết tủa.

b) Kết tủa phân đoạn bằng muối trung tính (phương pháp diêm tích).

Muối nồng độ cao có tác dụng với phân tử nước bao quanh protein enzyme vàlàm chuyển hóa điện tích, làm thay đổi tính hòa tan của enzyme

Trong công nghiệp enzyme, người ta thường sử dụng muối amonium sulfate.Các thiết bị dùng trong quá trình kết tủa bằng muối này thường được chế tạo bằngthép không rỉ Tuy nhiên, thép không rỉ cũng có nhiều loại, nhiều trường hợp thiết bịchế tạo từ thép không rỉ cũng bị ăn mòn bởi amonium sulfate Vì vậy sau này thayamonium sulfate bằng sodium sulfate, muối này tuy không gây hư hỏng thiết bị, songchúng lại không có tính hòa tan tốt Nhiệt độ tiến hành kết tủa có thể ở 35 – 400C,nhưng để tránh khả năng làm mất hoạt tính enzyme, người ta thường phải làm lạnhdung dịch muối và dung dịch enzyme trước khi trộn hai dung dịch lại với nhau

Nồng độ tối ưu của muối dùng trong kết tủa enzyme sẽ được xác định trongnhững thí nghiệm cụ thể Khoảng tối ưu của nồng độ muối dùng trong kết tủa enzymerất rộng, khoảng 20 – 80% Mỗi loại protein enzyme sẽ có một khoảng nồng độ muối

mà protein enzyme đó kết tủa hoàn toàn, gọi là nồng độ muối tích Khoảng nồng độmuối tích của các protein enzyme thường không giống nhau

Chúng ta có thể tinh chế enzyme nhờ kết tủa phân đoạn muối trung tính

c) Kết tủa enzyme bằng dung môi hữu cơ.

Dung môi hữu cơ có ảnh hưởng rất lớn đến khả năng hòa tan của enzyme, ảnhhưởng solvat hóa của phân tử nước xung quanh phân tử enzyme bị thay đổi, tươngtác giữa các phân tử enzyme sẽ tăng lên Khi tiến hành kết tủa enzyme bằng nhữngdung môi hữu cơ cần hết sức lưu ý tới nhiệt độ nên bắt buộc ta khi tiến hành phải làmlạnh dung môi hữu cơ và dung dịch enzyme, mức độ nhạy cảm nhiệt độ của enzymekhi có mặt các dung môi hữu cơ thường mạnh hơn mức độ nhạy cảm của enzyme vớinhiệt độ khi có mặt của muối vô cơ, thường tiến hành ở nhiệt độ từ 3 – 100C Tỉ lệ vànồng độ các dung môi hữu cơ dùng để kết tủa enzyme được xác đình bằng thựcnghiệm cho từng loại enzyme và từng nồng độ enzyme có trong dung dịch

Dung môi hữu cơ được dùng để kết tủa enzyme bao gồm: ethanol, isopropanol,aceton Các loại dung môi này làm giảm hằng số điện môi của môi trường Khi đó lựchút và lực đẩy tỷ lệ nghịch với hằng số điện môi Do đó trong dung dịch toàn bộ cácprotein enzyme và toàn bộ các protein khác cũng như các tạp chất phân tử lớn khácđều bị kết tủa Do sự giảm hằng số điện môi nên các phân tử tương tác với nhau tạothành một tập hợp và sẽ lắng xuống

Các yếu tố ảnh hưởng đến hiện tượng này bao gồm: nồng độ dung môi, nhiệt

độ, phản ứng môi trường, lực ion của dung dịch và tính chất của enzyme

d) Thay đổi thành phần hóa học của môi trường để làm sạch enzyme.

Khi thêm vào môi trường các chất đặc hiệu, người ta thu được kết tủa của một

số phân tử