Nghiên cứu này cung cấp dẫn liệu khoa học về xác định lớp chất kháng nấm và khảo sát hiệu lực phòng trừ bệnh héo vàng cà chua (Fusarium oxysporum) của chế phẩm VH- Biochem 01.
Kết nghiên cứu khoa học BVTV – Số 2/2018 gia tăng tỷ lệ chết độc tố Bt chuyển gen sâu non tuổi nhỏ sâu xanh Cùng dinh dưỡng chuyển gen Bt (CS95), nguồn sâu xanh vùng chưa trồng giống bơng chuyển gen Bt (Bình Thuận) có tỷ lệ chết cao so với tỷ lệ chết nguồn sâu xanh vùng trồng giống chuyển gen Bt (Nha Hố, Ninh Thuận) TÀI LIỆU THAM KHẢO Joanne D and K Olsen, 1996 The Potential for Transgenic Cotton Plants to select for resistance in Helicoverpa armigera Cotton on to the future th Proceeding of the Australian Cotton conference, th th 14 -16 , August, The Australian Cotton Growers’ Research Association, p 295-298 Du Min, 2002 Situation of the Bt transgenic cotton in China New Genetical Approaches to Cotton nd Improvement, Proceeding of the Meeting of the Asian Cotton Research and Development Network, November 14-16, Tashkent, Uzbekistan, p 10-21 Li Fuguang and Cui Jinjie, 2001 Study on insect resistant transgenic cotton harbouring double gene and its resistance to insect pest Chinese Agricultural Science, p 70-76 Xia Jingyuan, 2000 Resistance of transgenic Bt cotton to Helicoverpa armigera Hỹbner (Lepidoptera: Noctuidae) and its effects on other insects in China Proceeding of the first Vietnam-Sino conference on cotton technology and its industrialization, November, 2000, Hochiminh City, Vietnam, p 13-14 Phản biện: GS-TS-NCVCC Phạm Văn Lầm TÁCH LỚP CHẤT KHÁNG NẤM VÀ KHẢO SÁT HIỆU LỰC PHÕNG TRỪ BỆNH HÉO VÀNG CÀ CHUA (Fusarium oxysporum) CỦA CHẾ PHẨM SINH HỌC VH- BIOCHEM 01 Isolation of Antifungal Class and Evaluation of The Disease Control Efficacy of VH-Biochem 01 Against Wilt Disease on Tomato Caused by Fusarium oxysporum 2 Nguyễn Mai Cƣơng , Hà Viết Cƣờng , Nguyễn Đức Huy Đoàn Thị Xuân Liễu Ngày nhận bài: 26.03.2018 Ngày chấp nhận: 16.04.2018 Abstract The result of bioautography assay and isolation of antifungal class from Bacillus velezensis HSHC1 broth TM culture using an Amberlite XAD16 shown that the antifungal compounds against Fusarium oxysporum caused wilt disease on tomato belongs to lipopeptide family The antifungal efficacy of VH-Biochem 01 product containing 10 CFU/g had a disease control value of 71.31% after 21 days treatment at a concentration of g/l against Fusarium wilt disease on tomato This value is less than that from Tramy SL (74.24%), at a concentration of ml/l Keywords: Fusarium wilt disease, Fusarium oxysporum, Bacillus velezensis HSHC1, bioautography assay, VH-Biochem 01 Trung tâm Hóa sinh Hữu cơ, Viện Hóa học Công nghiệp Việt Nam Bộ môn Bệnh cây, Khoa Nông học, Học Viện Nông nghiệp Việt Nam ĐẶT VẤN ĐỀ Bệnh héo vàng cà chua (Fusarium oxysporum) loại bệnh hại phổ biến, xuất gây hại nhiều vùng trồng cà chua 25 Kết nghiên cứu khoa học Việt Nam Bệnh gây hại tất phận Khi bị nhiễm bệnh, chuyển sang màu vàng héo dần từ phần lên ngọn, sinh trưởng kém, cuối toàn héo dần chết Nấm gây bệnh phát o triển thích hợp nhiêt độ 25 – 30 C, phát sinh gây hại nặng vào mùa mưa giai đoạn bắt đầu hoa trở Nấm F oxysporum có phổ ký chủ rộng xâm nhiễm ký sinh gây hại nhiều họ trồng có giá trị kinh tế chuối, cà chua, khoai tây, lạc, vừng, hồ tiêu, dưa hấu [1,2] Mỗi dạng F oxysporum thường gây héo loài ký chủ, bệnh héo vàng hại cà chua ghi nhận loài F oxysporum f.sp lycopersici Nấm F.oxysporum tồn chủ yếu đất, nấm xâm nhập qua rễ gây bệnh vào bó mạch Do nơi đảm nhận chức hút nước, hút chất dinh dưỡng mặt đất nên việc phòng trừ thuốc hóa học ln gặp nhiều khó khăn [3,4] Trong giai đoạn 2003-2005, tỉ lệ mắc bệnh héo vàng nấm F oxysporum gây cà chua Hà Nội chiếm 5% [5] Những năm gần đây, người dân thường sử dụng chế phẩm Starner 20WP, Copper-B 75WP, Bonny 4SL, Ridozeb 72WP, Manozeb 80WP, Tramy 2SL, Tachigaren 30SL…Tuy nhiên, việc sử dụng biện pháp hóa học phòng trừ nấm F oxysporum gây tác động lớn tới môi trường, hiệu sử dụng giảm dần bị kháng thuốc có nguy tồn dư thuốc sản phẩm sau thu hoạch chế biến chủ yếu dùng để tưới xuống đất Bên cạnh đó, biện pháp kỹ thuật canh tác áp dụng nhằm giảm thiểu thiệt hại thay đổi cấu vụ mùa, sử dụng giống trồng mẫn cảm với bệnh Tuy nhiên, hiệu đạt thấp nguồn bệnh tồn thời gian dài, gặp điều kiện thuận lợi bùng phát trở lại [4,6] Để khắc phục nhược điểm biện pháp sinh học nhà khoa học đầu tư nghiên cứu, ứng dụng khuyến khích sử dụng Biện pháp sử dụng vi sinh vật có ích, sản phẩm có nguồn gốc sinh học thuốc thảo mộc, sản phẩm công nghệ sinh học giống chuyển gen kháng bệnh nhằm ngăn chặn giảm bớt thiệt hại bệnh hại gây 26 BVTV – Số 2/2018 Đây biện pháp tốt, có nhiều triển vọng tương lai Cho tới thời điểm nay, chưa có chế phẩm kháng nấm F oxysporum hiệu có nguồn gốc VSV thương mai hóa hay nghiên cứu chuyên sâu Việt Nam Trên giới, có nhiều loại vi sinh vật đối kháng, thường nấm vi khuẩn, chủ yếu có nguồn gốc từ đất, nghiên cứu, ứng dụng mức thương mại phòng chống sinh học bệnh vi khuẩn Agrobacterium, Pseudomonas, Streptomyces, Bacillus, nấm Gliocladium, Trichoderma, Ampelomyces, Candida, Coniothyrium, Chaetomium [8,9,10] Trong số Bacillus có ưu điểm bật đa dạng chủng loài, khả chịu điều kiện khắc nghiệt cao Nghiên cứu cung cấp dẫn liệu khoa học xác định lớp chất kháng nấm khảo sát hiệu lực phòng trừ bệnh héo vàng cà chua (Fusarium oxysporum) chế phẩm VH- Biochem 01 VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Vật liệu nghiên cứu Nguồn nấm Fusarium oxysporum phân lập từ mẫu bệnh héo vàng hại cà chua Nam Hồng - Đông Anh – Hà Nội Chế phẩm sinh học dạng bột thấm nước chứa vi khuẩn đối kháng chủng Bacillus velezensis HSHC1 với mật độ 10 CFU/g Môi trường dùng để phân lập nuôi cấy nấm Fusarium oxysporum: WA (20g agar/l), PGA (dịch lọc từ 200g khoai tây/l, 20 g agar/l, 20 g glucose/l), trấu cám (trấu cám 40g, nước cất vô trung 24 ml), TSB (17 g tryptone/l, g phytone/l, g NaCl/l, 2,5g K2HPO4/l, 2,5 g glucose/l ), PDA (4g khoai tây/l, 20 g agar/l, 20 g dextrose/l) Thuốc trừ nấm: Tramy SL 2.2 Phƣơng pháp nghiên cứu 2.2.1 Ảnh hưởng điều kiện nuôi cấy đến sinh trưởng phát triển HSHC1 Khuẩn lạc Bacillus velezensis tách cấy truyền vào ống nghiệm tích 15 ml chứa ml mơi trường TSB nuôi cấy o 30 C, 24h Sau đó, dịch ni cấy tiếp tục cấy truyền sang bình tam giác 250 ml chứa 50 ml môi trường TSB với tỉ lệ giống 1% Qui trình ni cấy thực khoảng nhiệt độ Kết nghiên cứu khoa học từ 20-45 C, pH ban đầu 2-8, tốc độ lắc 150 vòng/phút 24h Chỉ số OD đo thiết bị đo OD600 DiluPhotometer™ bước sóng 600 nm Giá trị pH điều chỉnh HCl 6N/NaOH 2N 2.2.2 Xác định lớp chất kháng nấm có hoạt tính từ dịch ni cấy Bacillus velezensis nuôi cấy o môi trường TSB 30 C, 120 vòng/phút 72h Tổng cộng 500 ml dịch nuôi cấy ly o tâm C, 7500 vòng/phút 20 phút để tách phần tế bào Dịch sau ly tâm hấp thụ 4% (g/ml) nhựa Amberlite XAD 16 2,5h có khuấy trộn (150 vòng/phút) Phần nhựa hấp thu thu hồi rửa giả 250 ml methanol Sau loại methanol quay chân không thu cặn rắn Phần cặn lipopeptide thô [8,11] Phần tế bào, hoạt chất lipopeptide, chất mang, phụ gia sử dụng để tạo sản phẩm VH-Biochem 01 Phần dịch thu sau hấp thu XAD 16 cất loại nước Hòa tan cặn nước thu băng methanol 50% nồng độ 1000 ppm Phần lipopeptide thô, sau hấp thu XAD 16 thử hoạt tính đĩa thạch PDA, đĩa giấy mm sử dụng 30µl dung dịch methanol chứa lipopeptide nồng độ 500 ppm 60 µl cho phần cặn nước Các khảo sát bioautography thực hệ dung môi chloroform/methanol/H2O: 65/25/4, sử dụng mỏng Silica tráng kính, chiều dày 0.5 mm Bản mỏng cắt đơi, đặt vào đĩa, đổ 20 ml môi trường PDA chứa nấm F o oxysporum (0.2%), nuôi cấy 30 C ngày Khả đối kháng nấm B velezensis HSHC1 nuôi cấy môi o trường PDA điều kiện 30 C ngày để đánh giá 2.2.3 Khảo sát hiệu lực phòng trừ bệnh héo vàng Fusarium oxsporum hại cà chua chế phẩm VH–Biochem 01 có vi khuẩn đối háng chủng Bacillus điều kiện nhà lưới Thí nghiệm tiến hành cà chua 20 ngày tuổi có – thật, bào tử nấm gây bệnh héo vàng đưa vào BVTV – Số 2/2018 xung quanh gốc cây, gồm công thức, công thức nhắc lại lần, lần nhắc lại 30 [7] Công thức 1: Tưới Chế phẩm VH Biochem 01 với liều lượng 1g/l vào đất quanh gốc sau lây bệnh nhân tạo ngày Công thức 2: Tưới thuốc so sánh Tramy SL với liều lượng 1ml/l vào đất quanh gốc sau lây bệnh nhân tạo ngày Công thức (Đối chứng): Tưới nước cất vào đất quanh gốc sau lây bệnh nhân tạo ngày Các tiêu theo dõi: Tính số bị bệnh (TLB %) công thức sau 7, 14, 21 ngày hiệu phòng trừ sau 21 ngày theo dõi Tỷ lệ bệnh tính theo cơng thức: Trong đó: A số bị bệnh héo vàng B tổng số điều tra Hiệu lực phòng trừ xác định theo cơng thức Abbott: Trong đó: C: Chỉ số bệnh công thức đối chứng, T: Chỉ số bệnh công thức thử nghiệm Xử lý số liệu phần mềm excel 2007 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 3.1 Ảnh hƣởng điều kiện nuôi cấy đến sinh trƣởng phát triển Bacillus velezensis HSHC1 Nhiệt độ thích hợp cho phát triển Bacillus 30-35 C, nhiệt độ giảm xuống, sinh trưởng phát triển (bảng 1) Ở o điều kiện 40 C, vi sinh vật tiếp tục phát triển, o nhiệt độ tăng tới 45 C, Bacillus không sinh trưởng phát triển Nghiên cứu ảnh hưởng pH môi trường ban đầu thực o 30 C, môi trường TSB, giá trị OD cho thấy chủng phát triển tốt sau 24h pH ban đầu 6-7 Do q trình ni cấy, giá trị pH thích hợp khoảng 6-7 27 Kết nghiên cứu khoa học BVTV – Số 2/2018 Bảng Ảnh hƣởng nhiệt độ nuôi cấy pH ban đầu tới sinh trƣởng phát triển B velezensis HSHC1 Nhiệt độ ( C) 20 25 30 35 40 45 OD (600 nm) 1,16 ± 0,07 1,49 ± 0,06 1,87 ± 0.06 1,86 ± 0,01 0,71 ± 0,05 0,01 ± 0,01 pH ban đầu OD (600 nm) 0,21 ± 0,01 0,83 ± 0,06 1,77 ± 0,06 1,91 ± 0,06 1,92 ± 0,04 1,24 ± 0,01 0,18 ± 0,04 3.2 Xác định lớp hoạt chất kháng nấm mang hoạt tính từ dịch ni cấy Hoạt tính đối kháng B velezensis HSHC1 nấm F.oxysporum gây bệnh héo vàng cà chua đánh giá môi trường PDA (hình 1) Vòng đối kháng hiệu đối kháng mạnh chủng HSHC1 Từ kết này, chế đối kháng nấm hoạt chất sinh tổng hợp giải phóng trình phát triển vi khuẩn, enzyme chế cạnh tranh dinh dưỡng tác động tất chế nêu Các thử nghiệm chứng minh có mặt chất kháng nấm môi trường nuôi cấy dung dịch lại khơng thể hoạt tính kháng nấm đĩa thạch Điều chứng tỏ chất kháng nấm hấp thu hoàn toàn vào hạt nhựa, dung dịch hàm lượng nhỏ, ngưỡng phát phương pháp thử hoạt tính (hình 2) HP1 HP2 CK HPO1 HPO2 FO B.1 HP: Lipopeptide hấp thu XAD 16 B.1 HPO: Cặn sau hấp thụ XAD 16 Nông độ: 500 ppm; thể tích sử dụng: 30 µL Hình Hoạt tính kháng nấm sau hấp thu XAD 16 Hình Hoạt tính kháng nấm sau hấp thu XAD 16 Trên sắc ký mỏng phun nước, kết hợp với kết thử bioautography (hình 3) B1: B Velezensis HSHC 1; tính chất hấp thu chất nhựa XAD 16 FO: Fusarium oxysporum cho thấy, phần hoạt chất tạo dịch nuôi cấy B velezensis HSHC1 thuộc lớp chất Hình Tính đối kháng B Velezensis HSHC lipopeptide Đây lớp chất kháng nấm đặc trưng Hình Tính đối kháng cho Bacillus Trong bioautography, có hai vùng B.Velezensis HSHC thể hoạt tính kháng nấm khác Vùng Kết thử hoạt tính kháng nấm lớp chất tương ứng với chất hoạt động bề mặt sau hấp thu nhựa XAD 16 phần cặn biosurfactant, vùng tương ứng với cyclo nước thu sau hấp thu cho thấy phần lipopeptide [8-11] 28 Kết nghiên cứu khoa học BVTV – Số 2/2018 3.3 Ảnh hƣởng thời gian nuôi cấy đến lƣợng hoạt chất thu nhận o Hình 3: Sắc ký mỏng bioautography Hình Sắc ký mỏng bioautography Tại điều kiện nuôi cấy: 30 C pH ban đầu 6,5; giá trị OD biến động đáng kể khoảng thời gian 20-72h (bảng 2) Điều giải thích giai đoạn sinh trưởng kết thúc sau 16h, sau vào giai đoạn cân suy vong Để thu lượng CFU tốt cho trình nhân giống để nuôi cấy môi trường mới, thời gian nuôi cấy nên thực khoảng thời gian từ 16-24h, sau giai đoạn này, vi sinh vật vào giai đoạn tiêu thụ chất tạo nên chất có hoạt tính Nếu thời gian tiếp tục kéo dài, Bacillus tạo thành dạng bào tử để chống lại nhiễm độc thiếu chất Điều thể rõ qua số lượng hoạt chất thu nhận tăng từ 0,82 g (20h) lên 1.00 g sau 72h, số OD khơng có thay đổi Do vậy, để thu nhận hoạt chất, trình ni cấy cần tiến hành 72h Bảng Ảnh hƣởng thời gian nuôi cấy đến số OD lƣợng lipopeptide thu đƣợc Thời gian nuôi cấy (h) OD 16 18 20 22 24 48 72 1,77 ± 0,06 1,83 ± 0,03 1,92 ± 0,04 1,91 ± 0,01 1,90 ± 0,04 1,90 ± 0,01 1,93 ± 0,00 (600 nm) Thời gian nuôi cấy (h) 24 36 48 60 72 84 96 Lượng lipopeptide 0,33 ± 0,02 0,63 ± 0,01 0,82 ± 0,01 0,95 ± 0,01 1,00 ± 0,02 0,99 ± 0,02 1,00 ± 0,02 thô (g) 3.4 Khảo sát hiệu lực phòng trừ bệnh héo vàng (Fusarium oxsporum) hại cà chua chế phẩm VH – Biochem 01 điều kiện nhà lƣới Chế phẩm VH – Biochem 01 sử dụng để đánh giá với bệnh héo vàng hại cà chua điều kiện nhà lưới cho thấy: công thức xử lý chế phẩm VH – Biochem 01 công thức sử dụng thuốc Tramy SL có hiệu cao việc kìm hãm phát triển bệnh so với công thức đối chứng sau xử lý 7, 14 21 ngày (bảng 3, hình 4) Chế phẩm VH – Biochem 01 có hiệu phòng trừ bệnh héo vàng cà chua đạt cao (71,21%) Chế phẩm VH-Biochem 01 có tiềm ứng dụng phòng trừ bệnh héo vàng cà chua nhằm thay loại thuốc bảo vệ thực vật có nguồn gốc hóa học 29 Kết nghiên cứu khoa học BVTV – Số 2/2018 Bảng Hiệu phòng trừ bệnh héo vàng (Fusarium oxysporum) hại cà chua chế phẩm VH – Biochem 01 Công thức CT1 CT2 Đối chứng LSD0.05 CV Tỷ lệ bệnh (%) sau phun lần DAI a a b 18,89 5,037 35,29 14 DAI a 11,11 a 10 b 41,11 13,32 28,34 CT1: Xử lý chế phẩm VH – Biochem 01 21 DAI a 21,11 a 18,89 b 73,33 10,23 11,95 CT2: Xử lý thuốc Tramy SL Hiệu phòng trừ (%) DAI 100 100 - 14 DAI 72,97 75,67 - 21 DAI 71,21 74,24 - CT3: Cơng thức đối chứng Hình Cây cà chua sau xử lý 21 ngày với chế phẩm VH – Biochem 01 điều kiện nhà lƣới KẾT LUẬN Kết phân tích bioautography, phun nước hấp thu nhựa XAD 16 xác định lớp chất kháng nấm tạo B velezensis HSHC sản phẩm VH-Biochem 01 thuộc lớp chất lipopeptide, lớp chất kháng nấm đặc trưng cho Bacillus Điều kiện ni cấy thích hợp cho HSHC để thu nhận hoạt chất tăng o sinh khối 30 C, pH ban đầu 6-7 72h Hiệu phòng trừ bệnh héo vàng (Fusarium oxysporum) cà chua điều kiện nhà lưới chế phẩm sinh học VH – Biochem 01 có chủng vi khuẩn Bacillus cho hiệu phòng trừ cao đạt 71,21% sau 21 ngày xử lý chế phẩm TÀI LIỆU THAM KHẢO Đỗ Tấn Dũng, 2002 Bệnh héo rũ hại trồng cạn biện pháp phòng chống NXB Nông nghiệp, Hà Nội 30 Nguyễn Văn Viên, Đỗ Tấn Dũng 2003 Bệnh hại cà chua nấm, vi khuẩn biện pháp phòng chống Sách chuyên khảo, Học Viện Nông nghiệp Việt Nam Đỗ Tiến Hoàng, 2007 Nghiên cứu bện héo vàng (Fusarium oxysporum) hại trồng cạn Hè Thu năm 2017 Gia Lâm – Hà Nội thử chế phẩm sinh học phòng trừ bệnh NXB Nông Nghiệp Huang et al, 2013 Isolation and partial characterization of cyclic lipopeptide antibiotics produced by Paenibacillus ehimensis B7 BMC Microbiology, 13:87 Nguyễn Kim Vân ,1998 Bệnh héo vàng cà chua số yếu tố ảnh hưởng đến phát triển bệnh đồng ruộng Tạp chí Bảo vệ thực vật, 16 (160), tr 8-10 Ngô Thị Xuyên Nguyễn Văn Đĩnh, 2006 Nghiên cứu tinh hình bệnh hại cà chua nhà lưới đồng ruộng năm 2003 – 2005 Tạp chí Khoa học Nơng nghiệp Việt Nam, số 4- 5, trang 1-7 Ongena M, et al, 2008 Bacillus lipopeptides: versatile weapons for plant disease biocontrol Trends in Microbiology, 16(3), 115-125 ... 3.4 Khảo sát hiệu lực phòng trừ bệnh héo vàng (Fusarium oxsporum) hại cà chua chế phẩm VH – Biochem 01 điều kiện nhà lƣới Chế phẩm VH – Biochem 01 sử dụng để đánh giá với bệnh héo vàng hại cà chua. .. cứu cung cấp dẫn liệu khoa học xác định lớp chất kháng nấm khảo sát hiệu lực phòng trừ bệnh héo vàng cà chua (Fusarium oxysporum) chế phẩm VH- Biochem 01 VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1... 01 có hiệu phòng trừ bệnh héo vàng cà chua đạt cao (71,21%) Chế phẩm VH -Biochem 01 có tiềm ứng dụng phòng trừ bệnh héo vàng cà chua nhằm thay loại thuốc bảo vệ thực vật có nguồn gốc hóa học 29