Tại Nghệ An, các nghiên cứu bước đầu về bệnh đốm nâu chanh leo đã xác định nguyên nhân gây bệnh là do nấm Alternaria. Nghiên cứu trình bày trong bài báo này cung cấp thông tin khoa học nhằm xác định chính xác tới mức loài của nấm gây bệnh dựa trên phân tích các đặc điểm hình thái và trình tự DNA mã hóa vùng Internal Transcribed Spacer (ITS). Vùng ITS hiện được coi là mã vạch phân tử (barcode) phổ biến và quan trọng nhất của nấm (Schoch et al., 2012) và cũng đã được sử dụng để xác định nấm Alternaria (Sanka et al., 2012; Singh et al., 2018).
Kết nghiên cứu Khoa học BVTV - Số 4/2019 ĐỊNH DANH LOÀI Alternaria sesami GÂY BỆNH ĐỐM NÂU CHANH LEO TẠI NGHỆ AN The Identification of Alternaria sesami Causing Brown Spot Disease of Passion Fruit in Nghe An Võ Thị Dung , Hà Viết Cƣờng , Hà Minh Thanh Đỗ Duy Hƣng Ngày nhận bài: 15.3.2019 Ngày chấp nhận:16.7.2019 Abstract Brown spot is a dangerous and common disease of passion fruit in Nghe An The disease has been known to be caused by several Alternaria species worldwide The major aim of this study is to identify the identity of Alternaria species causing the brown spot diseaseof passion fruit in Nghe An The Alternaria isolates were isolated from brown spot lesions and cultured on nutrient media The morphological characteristics and sporulation manner of the Alternaria isolates were evaluated The Internal Transcribed Spacer (ITS) gene of 11 Alternaria isolates collected from Nghe An (7 isolates), Quang Binh (1 isolate), Thanh Hoa (1 isolate), Ha Tinh (1 isolate) and Hoa Binh (1 isolate) were sequenced directly from the PCR amplicons Sequence analysesshowed that the ITS sequences of the 11 Alternaria isolates were identical with each other and with those of Alternaria species, A sesami, A ricini and A acalyphicola, of the Section Porri Phylogenetic analysis showed the 11 Alternaria isolates, A sesami, A ricini and A acalyphicola formed a separate cluster on the ITS tree In the ITS2 region, 11 Alternaria isolates, A sesami, A ricini and A acalyphicola contain nucleotide (G) distinct from 60 remaining Alternaria species of this Section The conidia of the Alternaria species causing the brown spot disease were smooth wall and produced singly on conidiophores, meaning that the sporulation manner and conidial morphology of the Alternaria causing brown spot are similar with those of A sesami but distinct with those of A ricini and A acalyphicola In combination with the result of inoculation on sesame plant conducted previously, the Alternaria species causing brown spot disease of passion fruit in Nghe An is identified as A sesami Keywords: Alternaria sesami, Internal Transcribed Spacer (ITS), Nghe An, Passion fruit, sporulation * ĐẶT VẤN ĐỀ Chanh leo trồng có giá trị kinh tế cao, trồng nhiều Việt Nam Nghệ An, chanh leo loại đưa vào danh sách cấu trồng Tuy nhiên nay, người trồng chanh leo gặp nhiều khó khăn sản xuất bệnh hại cơng, có bệnh đốm nâu, bệnh nghiêm trọng Nghệ An Bệnh gây hại làm giảm khă quang hợp cây, làm hư hại vỏ quả, giảm chất lượng thương phẩm quả, ảnh hưởng lớn đến hiệu kinh tế Trên giới bệnh đốm nâu chanh leo xác định lồi Alternaria gây gồm A passiflorae, A alternata, A macrospora, A aliena, A aragakii, A hawaiiensis, Trường Đại học Kinh tế Nghệ An Học viện Nông nghiệp Việt Nam Viện Bảo vệ thực vật A tenuissima, A tropica, A guangxinesis, A bannaensis A tomato (Holliday, 1995; Chen& Zhang, 1997; Ploetz, 2003; Simmons, 1993; Ram et al., 1977; Fischer& Rezende, 2008) Trong số loài trên, A passiflorae A alternata xem loài phổ biến nhất, phân bố khắp giới (Fischer & Rezende, 2008; Joy & Sherin, 2012) Hiện nay, dựa đặc điểm hình thái trình tự gen, khoảng 280 lồi Alternaria phân loại phân chia vào 27 nhóm lồi gọi Section (Lawrence et al., 2013, 2016), Section Porri (từ tên lồi đại diện A porri) Section lớn với tổng số 63 loài ghi nhận (Woudenberg et al., 2014) Các loài công bố gây hại chanh leo A passiflorae, A macrospora, A aragakii, A hawaiiensis, A tropicavà A tomato thuộc Section Tại Việt Nam, có nghiên cứu nguyên nhân gây bệnh đốm nâu chanh leo Gần đây, 39 Kết nghiên cứu Khoa học nghiên cứu dựa đặc điểm hình thái 71 mẫu nấm Alternaria phân lập chanh leo thu Lâm Đồng Đắk Nông xác định nguyên nhân gây bệnh nấm A.passiflorae (Phan Thị Thu Hiền CS, 2015) Có thể thấy, tất cơng bố nguyên nhân gây bệnh đốm nâu chanh leo giới Việt Nam dựa đặc điểm hình thái nấm Giống nhiều chi nấm khác, phân loại nấm Alternaria dựa đặc điểm hình thái chứng tỏ khơng xác (Lawrence et al., 2016) Chẳng hạn, loài A hawaiiensis công bố gây bệnh đốm nâu chanh leo, sau phân tích trình tự gen, phân loại lại loài A Passiflorae (Woudenberg et al., 2014) Tại Nghệ An, nghiên cứu bước đầu bệnh đốm nâu chanh leo xác định nguyên nhân gây bệnh nấm Alternaria Nghiên cứu trình bày báo cung cấp thông tin khoa học nhằm xác định xác tới mức lồi nấm gây bệnh dựa phân tích đặc điểm hình thái trình tự DNA mã hóa vùng Internal Transcribed Spacer (ITS) Vùng ITS coi mã vạch phân tử (barcode) phổ biến quan trọng nấm (Schoch et al., 2012) sử dụng để xác định nấm Alternaria (Sanka et al., 2012; Singh et al., 2018) VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Phân lập nấm đánh giá đặc điểm hình thái Mẫu lá, chanh leo bị bệnh đốm nâu điển hình thu thập rửa nước vòi Mẫu khử trùng bề mặt cồn 70% 30 giây thấm khô giấy thấm vô trùng Các mảnh mô (5 x mm) chứa mô bệnh mô khỏe cắt đặt môi trường WA (Water Agar) ủ nhiệt độ o 28 C Khi sợi nấm phát triển dài cách mô bệnh 12cm, nấm làm cấy đỉnh sinh trưởng sợi nấm sang môi trường PDA (Potato Dextrose Agar) Các đặc điểm hình thái nấm gồm tản nấm, sợi nấm, cành bào tử phân sinh, bào tử phân sinh, cách sinh bào tử phân sinh quan sát từ mẫu nấm nuôi cấy môi trường dinh dưỡng gồm PDA, PDA+1%YE (PDA bổ sung 1% Yeast Extract), PCA (Potato Carrot Agar) 40 BVTV - Số 4/2019 2.2 PCR giải trình tự DNA tổng số chiết từ sợi nấm theo phương pháp CTAB (Cetyltrimethyl ammonium bromide) Doyle and Doyle (1987).DNA hòa 50µL đệm TE bảo quản -20°C Phản ứng PCR thực với hai mồi ITS1và ITS4 (White et al., 1990) để nhân vùng ITS mẫu nấm Phản ứng PCR thực với DreamTaq Polymerase hãng Fermentas với nhiệt độ gắn mồi 52°C Sản phẩm PCR tinh chiết từ gel agarose dùng kít tinh chiết Gel Extraction Kit D2500 (Omega, USA) theo hướng dẫn nhà sản xuất Sản phẩm PCR tinh chiết giải trình tự chiều Hãng First Base (Singapore) Macrogen (Hàn Quốc) Trình tự nucleotide biên tập lắp ráp dùng phần mềm Seqman (DNASTAR, LaserGene) 2.3 Phân tích trình tự Các trình tự mẫu xác định danh tính sơ so sánh với trình tự sở liệu MYCOBANK (http://www.mycobank.org/) Căn trình tự đa chuỗi thực với phần mềm ClustalX2.1 (Larkin et al., 2007) Cây phả hệ xây dựng phần mềm MEGA7.0 (Kumar et al., 2016) KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1 Đặc điểm hình thái nấm Alternaria gây bệnh đốm nâu chanh leo Nghệ An Nấm Alternaria chanh leo chủ yếu gây hại phận Trên vết bệnh, nấm hình thành cành bào tử phân sinh riêng rẽ cành hình thành bào tử phân sinh đơn lẻ có mỏ dài Trên mơi trường ni cấy nhân tạo PDA+1%YE, PCA PDA, tản nấm tạo vòng tròn đồng tâm, đều, dày, có màu nâu đậm Trên môi trường nuôi cấy nhân tạo, nấm dễ dàng sinh sản bề mặt mơi trường (Hình 1A) Cành bào tử phân sinh mọc trực tiếp từ sợi nấm vng góc với sợi nấm, dạng đơn lẻ, phân nhánh không phân nhánh Cành bào tử phân đa bào, kích thước 80 X 3-5 μm, có màu nâu đến nâu đậm.Bào tử phân sinh non trưởng thành thường có hình elip, kích thước (49 - 102) X (12 - 24) µm Bào tử trưởng thành nhẵn, màu đậm, có - 10 vách ngăn ngang, - vách Kết nghiên cứu Khoa học ngăn dọc, vách ngăn dọc xuất vị trí ngăn thứ - bào tử vách ngăn dọc khác vị trí có đường kính bào tử lớn so với vị trí khác Bào tử phân sinh có mỏ kéo dài theo thời gian sinh trưởng bào tử, kích thước 186 - 390 X 2,5 μm) Bào tử phân sinh mọc đơn lẻ từ đỉnh cành bào tử phân sinh (Hình 1) BVTV - Số 4/2019 Quảng Bình (1 mẫu), Thanh Hóa (1 mẫu) Hòa Bình (1 mẫu) nhân PCR giải trình tự trực tiếp chiều mồi PCR Sau loại bỏ trình tự nhiễu đầu, bốn mẫu Alternaria thu Nghệ An, ký hiệu từ NA1 đến NA4, có kích thước 518 bp; bảy mẫu lại có kích thước 532 bp (Bảng 1) Bảng Nguồn gốc kết giải trình tự vùng ITS 11 mẫu nấm Alternaria phân lập từ vết bệnh đốm nâu chanh leo Việt Nam STT Hình Đặc điểm hình thái nấm Alternaria gây bệnh đốm nâu chanh leo Nghệ An (A, B), đó: A: Cách sinh bào tử nấm bề mặt môi trƣờng PDA; B: cành bào tử phân sinh bào tử phân sinh hình thành từ sợi nấm ni cấy môi trƣờng PDA Bào tử phân cành bào tử phân sinh loài A sesami (C) theo Simmons, 2004 3.2 Kết giải trình tự vùng ITS tìm kiếm chuỗi tƣơng đồng Genbank Vùng ITS 11 mẫu nấm Alternaria phân lập từ vết bệnh đốm nâu chanh leo tím thu thập từ Nghệ An (7 mẫu), Hà Tĩnh (1 mẫu), 10 11 Ký hiệu mẫu NA1 NA2 NA3 NA4 NA5 NA6 NA7 HT1 QB1 TH1 HB1 Địa điểm thu mẫu Nghệ An Nghệ An Nghệ An Nghệ An Nghệ An Nghệ An Nghệ An Hà Tĩnh Quảng Bình Thanh Hóa Hòa Bình Kích thước (bp) 518 518 518 518 532 532 532 532 532 532 532 Tiếp theo, trình tự vùng ITS 11 mẫu nấm Alternaria trình tự đa chuỗi phần mềm Clustal so sánh trình tự cho thấy chúng đồng 100 % với nhau, chứng tỏ chúng thuộc lồi Tuy nhiên, khác kích thước nên trình tự chúng trình bày cụ thể sau với phần trùng đánh dấu: >Trình tự mẫu NA1, NA2, NA3 NA4 (518 bp): TAACAAGGTCTCCGTAGGTGAACCTGCGGAGGGATCATTACACAAATATGAAGGCGGGCTGG CACCTCTCGGGGTGGCCAGCCTTGCTGAATTATTCCACCCGTGTCTTTTGCGTACTTCTTGTTTC CTTGGTGGGCTCGCCCACCACAAGGACCAACCCATAAACCTTTTTGTAATGGCAATCAGCGTCAG TAACAATGTAATAATTACAACTTTCAACAACGGATCTCTTGGTTCTGGCATCGATGAAGAACGCAG CGAAATGCGATAAGTAGTGTGAATTGCAGAATTCAGTGAATCATCGAATCTTTGAACGCACATTGC GCCCTTTGGTATTCCAAAGGGCATGCCTGTTCGAGCGTCATTTGTACCCTCAAGCTTTGCTTG GTGTTGGGCGTCTTTTTGTCCCCCCGCTTGCGGGGAGACTCGCCTTAAAGTCATTGGCAGCC GGCCTACTGGTTTCGGAGCGCAGCACAAGTCGCGCTCTCTTCCAGCCCCAAGGTCTAGCATC CAACAAG >Trình tự mẫu NA5, NA6, NA7, HT1, QB1, TH1 HB1 (523 bp): GCGGGCTGGCACCTCTCGGGGTGGCCAGCCTTGCTGAATTATTCCACCCGTGTCTTTTGCGT ACTTCTTGTTTCCTTGGTGGGCTCGCCCACCACAAGGACCAACCCATAAACCTTTTTGTAATGGC AATCAGCGTCAGTAACAATGTAATAATTACAACTTTCAACAACGGATCTCTTGGTTCTGGCATCGA TGAAGAACGCAGCGAAATGCGATAAGTAGTGTGAATTGCAGAATTCAGTGAATCATCGAATCTTT 41 Kết nghiên cứu Khoa học BVTV - Số 4/2019 GAACGCACATTGCGCCCTTTGGTATTCCAAAGGGCATGCCTGTTCGAGCGTCATTTGTACCCTCA AGCTTTGCTTGGTGTTGGGCGTCTTTTTGTCCCCCCGCTTGCGGGGAGACTCGCCTTAAAGTCAT TGGCAGCCGGCCTACTGGTTTCGGAGCGCAGCACAAGTCGCGCTCTCTTCCAGCCCCAAGGTCT AGCATCCAACAAGCCTTTTTTTCAACTTTTGACCTCGGATCAGGTAGGGATACCCGCTGAACTTAA GCATATCAATAAGC và A acalyphicola với phần trăm đoạn so sánh từ 89.9 – 96.9 % mức đồng trình tự 100% Đáng ý, tất loài xác định thuộc Section Porri chi Alternaria Trình tự vùng ITS 11 mẫu nấm Alternaria trên, tiếp theo, sử dụng để xác định loài gần gũi từ Cơ sở liệu MYCOBANK Kết tìm kiếm (Bảng 2) cho thấy loài gần gũi xác định gồm A sesami, A ricini Bảng Tìm kiếm Cơ sở liệu MYCOBANK xác định lồi gần gũi dựa trình tự vùng ITS mẫu Alternaria gây bệnh đốm nâu chanh leo TT Loài Mã GenBank/CBS 10 A sesami A sesami A ricini A ricini A ricini A sesami A acalyphicola A sesami A ricini A ricini JF780939 JF780940 CBS 353.86 CBS 215.31 KJ718228 KJ718231 KJ718097 CBS 240.73 KJ718227 KJ718226 Mức đồng trình tự (%) 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 Phần trăm đoạn so sánh (%) 96,9 94,4 94,2 89,9 89,9 89,9 89,9 89,9 89,9 89,9 Ghi chú: Chỉ trình bày 10 mẫu gần gũi nhất; mã mẫu nấm lưu trữ CBS-KNAW Fungal Biodiversity Centre (Hà Lan) 3.3 So sánh trình tự phân tích phả hệ Dựa kết tìm kiếm lồi gần gũi, trình tự ITS 11 mẫu Alternaria gây bệnh đốm nâu chanh leo phân tích với trình tự tương ứng tất 63 lồi Alternaria thuộc Section Porri cơng nhận (Woudenberget al., 2014) (Bảng 3) Tổng số 74 trình tự trình tự đa chuỗi, so sánh trình tự phân tích phả hệ (Bảng 3, Hình 2, Hình 3) Kết so sánh trình tự cho thấy tất 11 mẫu Alternaria gây bệnh đốm nâu chanh leo đồng trình tự 100% với So sánh cho thấy mẫu Alternaria gây bệnh đốm nâu chanh leo có mức đồng trình tự 100 % với lồi A sesami, A ricini A acalyphicola Đáng ý, so sánh trình tự cho thấy mẫu nấm Alternaria gây bệnh đốm nâu chanh leo nghiên cứu có mức đồng trình tự 98,0 % với lồi A passiflorae (Bảng 3) Bảng So sánh trình tự vùng ITS 11 mẫu Alternaria gây bệnh đốm nâu chanh leo với loài Alternaria thuộc Section Porri TT 42 Loài A acalyphicola A ricini A sesami A agerati A citrullicola Ký chủ Quốc Gia Mã GenBank Acalypha indica Ricinus communis Sesamum indicum Ageratum houstonianum Citrullus vulgaris Seychelles Nhật Bản Ấn Độ Mỹ Síp KJ718097 KJ718226 JF780939 KJ718098 KJ718144 Mức đồng trình tự (%) 100 100 100 99,7 99,7 Kết nghiên cứu Khoa học TT Loài BVTV - Số 4/2019 Ký chủ A cyamopsidis 10 11 12 13 14 15 16 17 A aragakii A blumeae A cassiae A deserticola A sennae A azadirachtae A cucumerina A venezuelensis A zinniae A macrospora A novae-guineensis Cyamopsis tetragonoloba Passiflora edulis Blumea aurita Sauropus androgynus Đất sa mạc Senna corymbosa Azadirachta indica Luffa acutangula Phaseolus vulgaris Zinnia elegans Gossypium barbadense Citrus sp 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 A obtecta A sidae A crassa A nitrimali A rostellata A steviae A thunbergiae A tillandsiae A anodae A tagetica A catananches A cichorii A dichondrae A grandis A jesenskae A linariae A montanica A multirostrata A paralinicola A passiflorae A protenta A ranunculi A scorzonerae A silybi A solani A allii A alternariacida A carthami A carthamicola A centaureae Alternaria cirsinoxia Alternaria porri Alternaria solani-nigri Euphorbia pulcherrima Sida fallax Datura stramonium Solanum viarum Euphorbia pulcherrima Stevia rebaudiana Thunbergia alata Tillandsia usneoides Anoda cristata Tagetes erecta Catananche caerulea Cichorium intybus Dichondra repens Solanum tuberosum Fumana procumbens Linaria maroccana Cirsium arvense Richardia scabra Linum usitatissimum Passiflora edulis Hordeum vulgare Ranunculus asiaticus Scorzonera hispanica Silybum marianum Ageratum houstonianum Allium cepa Solanum lycopersicum Helianthus annuus Carthamus tinctorius Centaurea solstitialis Cirsium arvense Allium cepa Cyphomandra betacea Quốc Gia Mã GenBank Mỹ KJ718156 Mức đồng trình tự (%) 99,5 Mỹ Thái Lan Malaysia Namibia Ấn Độ Úc Mỹ Venezuela New Zealand Mỹ Papua New Guinea Mỹ Kiribati Síp Puerto Rico Mỹ Nhật Bản Úc New Zealand Nam Phi Anh Hà Lan Síp Italy Mỹ Slovakia Đan Mạch Mỹ Mỹ Canada Mỹ New Zealand Israel Hà Lan Nga Ý Puerto Rico Anh Canada Iraq Mỹ Canada Mỹ New Zealand KJ718111 KJ718126 KJ718136 KJ718249 KJ718230 KJ718115 KJ718153 KJ718263 KJ718270 KC584204 KJ718202 99,3 99,3 99,3 99,3 99,3 99,1 99,1 99,1 99,1 98,9 98,9 KJ718204 KJ718232 KJ718147 KJ718201 KJ718229 KJ718252 KJ718257 KJ718260 KJ718110 KC584221 KJ718139 KJ718141 KJ718166 KJ718239 KJ718177 KJ718180 KJ718194 KJ718195 KJ718206 KJ718210 KJ718220 KJ718225 KJ718191 KJ718233 Y17070 KJ718100 KJ718105 KJ718132 KJ718134 KJ718140 KJ718143 KJ718218 KJ718242 98,9 98,9 98,7 98,7 98,7 98,7 98,7 98,7 98,5 98,5 98,0 98,0 98,0 98,0 98,0 98,0 98,0 98,0 98,0 98,0 98,0 98,0 98,0 98,0 98,0 97,8 97,8 97,8 97.8 97.8 97.8 97.8 97.8 43 Kết nghiên cứu Khoa học TT Loài 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 Alternaria argyroxiphii Alternaria calendulae Alternaria pipionipisi Alternaria tropica Alternaria bataticola Alternaria dauci Alternaria echinaceae Alternaria ipomoeae Alternaria neoipomoeae Alternaria pseudorostrata Alternaria conidiophora Alternaria agripestis Alternaria anagallidis BVTV - Số 4/2019 Ký chủ Argyroxiphium sp Calendula officinalis Cajanus cajan Passiflora edulis Ipomoea batatas Daucus carota Echinacea sp Ipomoea batatas Ipomoea batatas Euphorbia pulcherrima Datura stramonium Euphorbia esula Anagallis arvensis Quốc Gia Mã GenBank Mỹ Đức Ấn Độ Mỹ Nhật Bản Italy New Zealand Ethiopia Nam Phi Mỹ Síp Canada New Zealand KJ718112 KJ718127 KJ718214 KJ718261 KJ718117 KJ718158 KJ718170 KJ718175 KJ718198 JN383483 KJ718145 KJ718099 KJ718108 Mức đồng trình tự (%) 97.6 97.6 97.6 97.4 97.2 97.2 97.2 97.2 97.2 97.2 96.9 87.3 86.4 Tất 63 loài phân loại theo Woudenberg et al.(2014) Trên vùng ITS nấm có vùng phụ ký hiệu ITS1 ITS2, có mức độ biến động cao (tiến hóa trung tính) nên xem vùng chủ chốt để phân loại nấm (Blaalidet al., 2013; Yang et al., 2018) So sánh trình tự ITS cho thấy 11 mẫu Alternaria gây bệnh đốm nâu chanh leo loài A sesami, A ricini A acalyphicola có nucleotide khác biệt so với tất 60 lồi Alternaria lại Section Porri Nucleotide khác biệt G, nằm vùng ITS2 (Hình 2) Hình Đoạn trình tự thuộc vùng ITS2 chứa nucleotide (G, đƣợc đánh dấu hình tam giác) A sesami, A ricini A acalyphicola 11 mẫu nấm Alternaria gây bệnh đốm nâu chanh leo Nghệ An khác biệt so với 60 lồi Alternaria lại Section Porri 44 Kết nghiên cứu Khoa học Tương tự kết so sánh trình tự, phân tích phả hệ dựa tồn trình tự ITS cho thấy tất 11 mâu nấm Alternaria gây bệnh đốm nâu chanh leo loài A.sesami, A ricini A BVTV - Số 4/2019 acalyphicola phân nhóm thành cụm với nhau, độc lập với loài Alternaria khác Section Porri (Hình 3) Hình Phân tích phả hệ dựa tồn trình tự vùng ITS 11 mẫu nấm Alternaria gây bệnh đốm nâu chanh leovà tất 63 loài Alternaria thuộc Section Porri theo Woudenberg et al (2014) 45 Kết nghiên cứu Khoa học Nguồn gốc lồi trình bày Bảng Cây xây dựng phần mềm MEGA7 theo phương pháp Neighbor-Joining với khoảng cách di truyền xác định dùng mơ hình thay chuỗi Jukes - Cantor Giá trị ởcác nốt giá trị thống kê bootstrap dạng % (1.000 lần lặp) trình bày giá trị > 50% Thanh bar trình bày khoảng cách di truyền 3.4 So sánh loài Alternaria gây bệnh đốm nâu chanh leo với A sesami, A ricini A acalyphicola Dựa đặc điểm hình thái, so sánh trình tự tìm kiếm lồi gần gũi từ sở liệu MYCOBANK, nơi lưu giữ thông tin mẫu nấm thẩm định, tất 11 mẫu nấm Alternaria gây bệnh đốm nâu chanh leo Việt Nam thuộc loài thuộc Section Porri chi Alternaria Dựa so sánh trình tự phân tích phả hệ gen ITS,các mẫu nấm Alternaria gây bệnh chanh leo phân biệt với 60 lồi Alternaria thuộc Section Porri phân biệt với lồi lại Section nàylà A.sesami, A ricini A acalyphicola Các nghiên cứu phân loại phân tử gần chi Alternaria cho thấy gen ITS khơng đủ để phân loại tới mức lồi lồi có quan hệ gần gũi (Lawrenceet al., 2013, 2016) Chính vậy, phân tích bổ sung dựa đặc điểm hình thái sinh học mẫu nấm Alternaria nghiên cứu với loài kể thực (Bảng 4) Kết so sánh cho thấy loài Alternaria gây bệnh đốm nâu chanh leo loài A.sesami, A ricini A acalyphicola chia sẻ nhiều đặc điểm hình tháigiống liên quan đến cành bào tử phân sinh đặc biệt bào tử phân sinh khả sinh bào tử môi trường nhân tạo (Bảng 4) Về khả sinh bào tử môi trường nhân tạo, lồi sinh sản vơ tính dễ dàng, tạo nhiều cành bào tử phân sinh bào tử phân sinh môi trường nuôi cấy nhân tạo Đặc điểm quan trọng nhiều lồi, chủng nấmkể Alternaria yêu cầu điều kiện dinh dưỡng vật lý đặc biệt để sinh sản môi 46 BVTV - Số 4/2019 trường nhân tạo (Su et al., 2012; Rodrigueset al., 2010; Chaurasiaet al., 1998) Nhìn chung, phân loại loài Alternaria dựa đặc điểm hình thái tương đối khó hình thái chúng thay đổi theo điều kiện ni cấy (Woudenberg, 2015).Tuy nhiên, so sánh đặc điểm hình thái cho thấy lồi Alternaria gây bệnh đốm nâu chanh leo có đặc điểm giống với lồi A sesami (Hình 1) khác với loài A ricini A acalyphicola cách sinh bào tử phân sinh bề mặt bào tử phân sinh Bào tử phân sinh loài Alternaria gây bệnh đốm nâu chanh leo A sesami hình thành riêng lẻ từ đỉnh cành bào tử phân sinh, bào tử phân sinh A ricini A acalyphicola mọc thành chuỗi bào tử, (Bảng 4, Simmons, 2007) Bề mặt bào tử phân sinh non trưởng thành loài Alternaria gây bệnh đốm nâu chanh leo A sesami nhẵn A ricini A acalyphicola không nhẵn (Bảng 3, Simmons, 2004, 2007) Cũng cần ý rằng, bề mặt nhẵn hay không nhẵn Alternaria đặc điểm ổn định, không bị ảnh hưởng điều kiện muôi cấy (Simmons, 2007) Một đặc điểm sinh học hữu ích giúp định danh lồi Alternaria gây bệnh đốm nâu chanh leo tính gây bệnh ký chủ Cho tới nay, loài A ricini, A acalyphicola A sesami công bố gây bệnh ký chủ, thầu dầu (Ricinus communis), tai tượng xanh (Acalypha indica) vừng (Sesamum indicum) (Woudenberget al., 2014) Chính vậy, tính gây bệnh lồi Alternaria gây bệnh đốm nâu chanh leo Nghệ An đánh giá lây nhiễm nhân tạo số ký chủ kết lây nhiễm (khơng trình bày báo này) cho thấy lồi Alternaria gây bệnh vừng Dựa phân tích đặc điểm hình thái, trình tự vùng gen ITS tính gây bệnh vừng, chúng tơi kết luận lồi Alternaria gây bệnh đốm nâu chanh leo loài A.sesami 11 trình tự ITS gửi Genbank với danh tính lồi Như vậy, nghiên cứu (i) lần phát thấy loài A sesami Việt Nam, (ii) phát thêm ký chủ thứ A sesami chanh leo (iii) phát thêm loài Alternaria gây bệnh chanh leo Kết nghiên cứu Khoa học BVTV - Số 4/2019 Bảng Đặc điểm hình thái sinh học loài Alternaria gây bệnh đốm nâu chanh leo lồi Alternaria thuộc Section Porricó mức đồng trình tự 100 % gen ITS Đặc điểm Chỉ tiêu/ đơn vị A.sesami (Simmons, 2004) Hình thành cành bào tử phân sinh bào tử phân sinh môi trường nhân tạo Nhiều Cành bào tử phân sinh Mọc trực tiếp từ sợi, phân nhánh, phình to đỉnh (60-225) x (5.0-6.5) Cách mọc Kích thước (µm) Cách sinh bào tử phân sinh cành bào tử phân sinh Thân bào tử phân sinh Mỏ bào tử phân sinh Ký chủ Màu sắc Bề mặt Chiều dài (µm) Chiều rộng (µm) Số vách ngăn dọc Số vách ngăn ngang Nhiều A ricini (Simmons, 2007) Nhiều Alternaria gây bệnh đốm nâu chanh leo Nghệ An Nhiều Cành bào tử Hình thành Hình thành mọc trực tiếp nhánh nhánh vng góc đỉnh sợi nấm đỉnh sợi nấm với sợi nấm, Bào tử non hình elip hẹp, thót nhọn đỉnh Bào tử trưởng thành hình trứng hẹp Nâu đậm Nhẵn (50-150) x (56.0) Chủ yếu mọc đơn lẻ, mọc thành chuỗi bào tử Bào tử non hình Bào tử non hình trứng hẹp, thót elip, trứng hẹp nhọn đỉnh Bào tử trưởng Bào tử trưởng thành hình elip, thành hình trứng rộng trứng, elip, trứng ngược dài Nâu nhạt Nâu nhạt Không nhẵn Không nhẵn 100 - 130 70 - 95 70 - 100 49 - 102 19 - 32 20 - 23 17 - 26 12 - 24 1-3 1-3 1-5 0-3 10 - 12 - 10 - 11 - 10 Mọc đơn lẻ Hình dạng A acalyphicola (Simmons, 2007) (50-100) x (5.06.0) Chủ yếu mọc đơn lẻ, mọc thành chuỗi bào tử 80 x (3-5.0) Mọc đơn lẻ Bào tử non hình elip hẹp, thót nhọn đỉnh Bào tử trưởng thành hình trứng hẹp Nâu đậm Nhẵn Chiều dài (µm) 200- 325 110-175 Phần lớn có mỏ nhắn; có, 186 – 390 mỏ dài 75-125 Chiều rộng (µm) 2,5 1.5-2.0 1.5 - 2.0 2.5 Vừng Tai tượng xanh Thầu dầu Chanh leo, vừng* * Thí nghiệm lây nhiễm nhân tạo khơng trình bày nghiên cứu 47 Kết nghiên cứu Khoa học KẾT LUẬN Phân tích đặc điểm hình thái, trình tự vùng gen ITS, kết hợp với đánh giá tính gây bệnh ký chủ thực từ trước cho thấy loài Alternaria gây bệnh đốm nâu chanh leo thu thập Nghệ An, Hà Tĩnh, Quảng Bình, Hòa Bình loài A.sesami TÀI LIỆU THAM KHẢO Blaalid R., Kumar S., R H Nilsson, Abarenkov, K., Kirk, P M., & Kauserud, H., 2013 ITS versus ITS as DNA metabarcodes for fungi, Molecular ecology resources, 13(2): 218-224 Chaurasia S., Chand R & Joshi A K., 1998 A simple technique for the induction of sporulation in Alternaria triticina incitant of leaf blight of wheat, Journal of Plant Diseases and Protection, 17-21 Chen W Q., & Zhang T Y., 1997 Two new species of Alternaria from China, Mycological Research, 101(10): 1257-1258 Doyle J J & Doyle J L., 1987 A rapid DNA isolation procedure for small quantities of fresh leaf tissue, Phytochem Bull., 19, 11-15 Fischer I H., & Rezende J A., 2008 Diseases of passion flower (Passiflora spp.), Pest technology, 2(1): 1-19 Joy P P & Sherin C G., 2012 Diseases of Passion fruit (Passiflora edulis): Pathogen, Symptoms, Infection, Spread & Management, Technical Report, Kerala Agricultural University Kumar S., Stecher G., & Tamura K., 2016 MEGA7: molecular evolutionary genetics analysis version 7.0 for bigger datasets, Molecular Biology and Evolution, 33(7): 1870-1874 Larkin M A., Blackshields G., Brown N., Chenna R., McGettigan P A., McWilliam H., Valentin F., Wallace I M., Wilm A., and Lopez R., 2007 Clustal W and Clustal X version 2.0, Bioinformatics, 23: 2947-2948 Lawrence D P., Gannibal P B., Peever T L., & Pryor B M., 2013 The sections of Alternaria: formalizing species-group concepts, Mycologia, 105(3): 530-546 10 Lawrence D P., Rotondo F., & Gannibal P B., 2016 Biodiversity and taxonomy of the pleomorphic genus Alternaria, Mycological Progress, 15(1): 11 Phan Thị Thu Hiền, Đặng Thị Hạnh, Huỳnh Tiến Đơng, Lê Đình Đơn, 2015 Nghiên cứu nấm 48 BVTV - Số 4/2019 Alternaria passiflorae gây bệnh đốm nâu chanh dây (Passiflora edulis), Tạp chí Bảo vệ Thực vật, Số 6: 17-23 12 Ploetz R C (Ed.), 2003 Diseases of tropical fruit crops, CABI 13 Ram B., Naidu R., & Singh H P., 1977 Alternaria macrospora Zimm a new record on passion fruit (Passiflora edulis Sims.) from India, Current Science, 46(5):165 14 Rodrigues T T., Maffia L A., Dhingra O D., & Mizubuti E S., 2010 In vitro production of conidia of Alternaria solani, Tropical Plant Pathology, 35(4): 203-212 15 Sankar N R., Devamma M N., & Giridhar D., 2012 First report of Alternaria alternata causing leaf spot on Rumex vesicarius in India, Australasian Plant Disease Notes, 7(1), 17-18 16 Schoch C L., Seifert K A., Huhndorf S., Robert V., Spouge J L., Levesque C A &Chen W., 2012 Nuclear ribosomal internal transcribed spacer (ITS) region as a universal DNA barcode marker for Fungi, Proceedings of the National Academy of Sciences, 109(16): 6241-6246 17 Simmons E G., 2004 Novel dematiaceous hyphomycetes, Studies in Mycology, 50(1): l9-218 18 Simmons E G., 2007 Alternaria: An Indentification Manual (No PA 632.488 S56.) 19 Simmons E G., & Roberts R G., 1993 Alternaria themes and variations (73), Mycotaxon, 48, 109-140 20 Singh N K., Patel D B., Chaudhari S R., Morad B G., Rabari S M., Chattopadhyay A., & Tetarwal M L., 2018 Morphometric and internally transcribed spacer gene sequence-based characterization of Alternaria burnsii, Current Science, 114(9): 1927 21 Su Y Y., Qi Y L., & Cai L., 2012 Induction of sporulation in plant pathogenic fungi, Mycology, 3(3), 195-200 22 Woudenberg J H., 2015 Restyling Alternaria, PhD thesis, Wageningen University 23 Woudenberg J H C., Truter M., Groenewald J Z., & Crous P W., 2014 Large-spored Alternaria pathogens in section Porri disentangled, Studies in Mycology, 79: 1-47 24 White T J., Bruns T., Lee S J W T., & Taylor J L., 1990 Amplification and direct sequencing of fungal ribosomal RNA genes for phylogenetics, PCR Protocols: A guide to Methods and Applications 18(1): 315-322 ... thấy tất 11 mẫu Alternaria gây bệnh đốm nâu chanh leo đồng trình tự 100% với So sánh cho thấy mẫu Alternaria gây bệnh đốm nâu chanh leo có mức đồng trình tự 100 % với loài A sesami, A ricini... nấm Alternaria gây bệnh đốm nâu chanh leo nghiên cứu có mức đồng trình tự 98,0 % với loài A passiflorae (Bảng 3) Bảng So sánh trình tự vùng ITS 11 mẫu Alternaria gây bệnh đốm nâu chanh leo với loài. .. điểm sinh học hữu ích giúp định danh loài Alternaria gây bệnh đốm nâu chanh leo tính gây bệnh ký chủ Cho tới nay, loài A ricini, A acalyphicola A sesami công bố gây bệnh ký chủ, thầu dầu (Ricinus