NGHIÊN CỨU BIỂU HIỆN GEN GmCHI LIÊN QUAN ĐẾN TỔNG HỢP FLAVONOID VÀ CẢM ỨNG TẠO RỄ TƠ Ở CÂY THỔ NHÂN SÂM (TALINUM PANICULATUM)

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƢỜNG ĐẠI HỌC SƢ PHẠM ––––––––––––––––––––––– VŨ THỊ NHƢ TRANG NGHIÊN CỨU BIỂU HIỆN GEN GmCHI LIÊN QUAN ĐẾN TỔNG HỢP FLAVONOID VÀ CẢM ỨNG TẠO RỄ TƠ Ở CÂY THỔ NHÂN SÂM (TALINUM PANICULATUM) LUẬN N TIẾN S SINH HỌC TH I NGUYÊN - 2019 ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƢỜNG ĐẠI HỌC SƢ PHẠM –––––––––––––––––––– VŨ THỊ NHƢ TRANG NGHIÊN CỨU BIỂU HIỆN GEN GmCHI LIÊN QUAN ĐẾN TỔNG HỢP FLAVONOID VÀ CẢM ỨNG TẠO RỄ TƠ Ở CÂY THỔ NHÂN SÂM (TALINUM PANICULATUM) Ngành: Di truyền học Mã số: 9420121 LUẬN N TIẾN S SINH HỌC Ngƣời hƣớng dẫn khoa học: GS.TS Chu Hoàng Mậu TH I NGUYÊN - 2019 i LỜI CAM ĐOAN Tơi xin cam đoan cơng trình nghiên cứu tơi dƣới hƣớng dẫn GS.TS Chu Hồng Mậu Các kết trình bày luận án trung thực, phần đƣợc công bố Tạp chí khoa học chuyên ngành với đồng ý cho phép đồng tác giả; phần lại chƣa cơng bố cơng trình khác Mọi trích dẫn ghi rõ nguồn gốc Tơi xin chịu trách nhiệm hồn tồn nội dung số liệu trình bày luận án Thái Nguyên, ngày 12 tháng năm 2019 TÁC GIẢ Vũ Thị Nhƣ Trang ii LỜI CẢM ƠN Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới GS.TS Chu Hoàng Mậu trực tiếp hƣớng dẫn thƣờng xun chia sẻ, động viên khích lệ để tơi có đƣợc tự tin lòng đam mê khoa học giúp tơi hồn thành luận án Tơi xin chân thành cảm ơn PGS.TS Lê Văn Sơn cán bộ, nghiên cứu viên Phòng Cơng nghệ ADN ứng dụng, Viện Công nghệ sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam giúp đỡ tạo điều kiện tốt để tơi hồn thành số thí nghiệm nghiên cứu thuộc đề tài luận án Tôi xin chân thành cảm ơn giúp đỡ thầy cô cán Bộ môn Sinh học đại & Giáo dục Sinh học, Khoa Sinh học, Trƣờng Đại học Sƣ phạm - Đại học Thái Nguyên Đƣợc học tập sinh hoạt chuyên môn tập thể khoa học nghiêm túc, nhận đƣợc nhiều góp ý quý báu, đƣợc trang bị thêm phƣơng pháp nghiên cứu có hiểu biết sâu sắc vấn đề Sinh học đại Tôi xin cảm ơn thầy cô cán Khoa Sinh học, thầy cô cán phòng Đào tạo, Trƣờng Đại học Sƣ phạm - Đại học Thái Nguyên giúp đỡ tạo điều kiện thuận lợi cho tơi hồn thành khố học Cuối cùng, tơi xin tỏ lòng tri ân ngƣời thầy, đồng nghiệp, gia đình bạn bè điểm tựa tinh thần vững chắc, giúp đỡ, động viên, khích lệ, chia sẻ khó khăn ln đồng hành tơi q trình học tập Thái Nguyên, ngày 12 tháng năm 2019 TÁC GIẢ Vũ Thị Nhƣ Trang iii MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN i LỜI CẢM ƠN ii MỤC LỤC iii DANH MỤC KÍ HIỆU, CÁC TỪ VÀ CHỮ VIẾT TẮT v DANH MỤC CÁC BẢNG viii DANH MỤC CÁC HÌNH ix MỞ ĐẦU .1 Đặt vấn đề Mục tiêu nghiên cứu Nội dung nghiên cứu Những đóng góp luận án Ý nghĩa khoa học thực tiễn đề tài luận án Chƣơng TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 NGHIÊN CỨU NUÔI CẤY IN VITRO Ở CÂY THỔ NHÂN SÂM 1.1.1 Cây Thổ nhân sâm 1.1.2 Nghiên cứu định danh Thổ nhân sâm 1.1.3 Tái sinh in vitro Thổ nhân sâm 1.1.4 Nuôi cấy rễ tơ Thổ nhân sâm 15 1.2 FLAVONOID VÀ CON ĐƢỜNG TỔNG HỢP FLAVONOID Ở THỰC VẬT 22 1.2.1 Flavonoid 22 1.2.2 Con đƣờng tổng hợp flavonoid thực vật 28 1.3 ENZYME CHI VÀ BIỂU HIỆN GEN MÃ HÓA CHI 33 1.3.1 Enzyme CHI 33 1.3.2 Gen CHI 37 1.3.3 Nghiên cứu biểu gen CHI 39 Chƣơng VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 42 2.1 VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU 42 2.1.1 Vật liệu thực vật 42 2.1.2 Chủng vi khuẩn loại vector 43 iv 2.2 HÓA CHẤT, THIẾT BỊ VÀ ĐỊA ĐIỂM NGHIÊN CỨU 43 2.2.1 Hóa chất, thiết bị nghiên cứu 43 2.2.2 Địa điểm nghiên cứu 45 2.3 PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 45 2.3.1 Phƣơng pháp định danh mẫu Thổ nhân sâm 46 2.3.2 Các phƣơng pháp nuôi cấy in vitro 47 2.3.3 Phƣơng pháp chuyển gen GmCHI Thổ nhân sâm 51 2.3.4 Phƣơng pháp phân tích chuyển gen 53 2.3.5 Các phƣơng pháp phân tích, xử lý số liệu 57 Chƣơng KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 58 3.1 KẾT QUẢ ĐỊNH DANH CÁC MẪU THỔ NHÂN SÂM 58 3.1.1 Đặc điểm hình thái mẫu Thổ nhân sâm thu số địa phƣơng 58 3.1.2 Đặc điểm trình tự nucleotide vùng ITS đoạn gen matK 60 3.1.3 Thảo luận kết định danh mẫu Thổ nhân sâm tự nhiên 66 3.2 TẠO DÕNG THỔ NHÂN SÂM CHUYỂN GEN GmCHI 67 3.2.1 Nghiên cứu hệ thống tái sinh in vitro phục vụ chuyển gen Thổ nhân sâm 67 3.2.2 Kết chuyển gen GmCHI tạo Thổ nhân sâm chuyển gen 76 3.2.3 Kết phân tích Thổ nhân sâm chuyển gen 80 3.2.4 Thảo luận kết tạo dòng Thổ nhân sâm chuyển gen GmCHI 87 3.3 TẠO DÕNG RỄ TƠ TỪ CÂY THỔ NHÂN SÂM 89 3.3.1 Kết tạo dòng rễ tơ từ Thổ nhân sâm 90 3.3.2 Thảo luận kết tạo dòng rễ tơ từ Thổ nhân sâm 97 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ .100 Kết luận 100 Đề nghị 101 TÀI LIỆU THAM KHẢO .105 PHỤ LỤC 119 v DANH MỤC KÍ HIỆU, C C TỪ VÀ CHỮ VIẾT TẮT Kí hiệu, viết tắt Tiếng Anh Nghĩa tiếng Việt AS Acetosyringone BAP Benzylaminopurine bp base pairs Cặp bazơ nitơ CCM Co-cultivation medium Môi trƣờng đồng nuôi cấy cDNA Complementary DNA bổ sung CHI Chalcone isomerase C4H Cinnamate 4-hydroxylase CHS Chalcone synthase 4CL 4-Coumarate CoA ligase Cộng cs CTAB Cetyltrimethyl ammonium bromide 2,4 D 2,4-Dichlorophenoxyacetic acid DFR Dihydroxyflavonol 4reductase DNA Deoxyribonucleic acid dNTP Deoxynucleoside triphosphate FAP Fatty-acid-binding proteins F3H Flavanone-3-hydroxylase ELISA Enzyme-linked Xét nghiệm ELISA immunosorbentassay FLS Flavonol synthase FNS II Flavone synthase II GA3 Gibberellic acid Axit gibberellic GM Germination medium Môi trƣờng nảy mầm GmCHI Glycine max chalcone vi Kí hiệu, viết tắt Tiếng Anh Nghĩa tiếng Việt isomerase IAA Idole acetic acid Axit idole acetic IBA Idolbutylic acid Axit idolbutylic IFS Isoflavone synthase ITS Internal transcribed spacers Kb Kilo base kDa Kilo Dalton LB Luria Bertani Môi trƣờng dinh dƣỡng nuôi cấy vi khuẩn LDOX Leucoanthocyanidin oxygenase L-Tyr L-tyrosine Axit amin L-tyrosine mRNA Messenger ribonucleic acid RNA thông tin MS Murashige Skoog, 1962 Môi trƣờng dinh dƣỡng nuôi cấy mô thực vật NAA Naphthaleneacetic acid Axit naphthaleneacetic OD Optical density Mật độ quang Ori Origin Điểm khởi đầu chép PAL Phenylalanine ammonia- lyase PCR Polymerase chain reaction Ri-plasmid Root inducing- plasmid RM Rooting medium Môi trƣờng tạo rễ RNA Ribonucleic acid Axit ribonucleic Rol Root locus Gen rol rpm Revolutions per minute Số vòng/ phút scFv Single-chain variable Phản ứng chuỗi trùng hợp fragment SDS Sodium dodecyl sulfate SEM Shoot elongation medium Môi trƣờng kéo dài chồi SIM Shoot induction medium Môi trƣờng cảm ứng tạo chồi Taq DNA Thermus aquaticus DNA vii Kí hiệu, viết tắt Tiếng Anh polymerase polymerase T-DNA Transfer DNA Nghĩa tiếng Việt Đoạn DNA đƣợc chuyển vào thực vật TDZ Thidiazuron Ti-plasmid Tumor inducing - plasmid Plasmid gây khối u T0, T1 Các hệ chuyển gen T0 Cây chuyển gen tái sinh từ chồi ống nghiệm Hạt chuyển gen T0 T1 nảy mầm thành T1 TL-DNA Transfer left -DNA Vùng biên trái đoạn DNA đƣợc chuyển vào thực vật TR-DNA Transfer right -DNA Vùng biên phải đoạn DNA đƣợc chuyển vào thực vật UV Ultraviolet Tia cực tím Vir Virus interferon resistance Gen vir vvm Volume volume minute Thể tích khí/thể tích chất lỏng/ phút WPM Woody plant medium Môi trƣờng dinh dƣỡng nuôi cấy thân gỗ WT Wild type X-gal 5-bromo-4-chloro-3-indolylβ-D-galacto-pyranoside ZT Zeatin Cây không chuyển gen viii DANH MỤC C C BẢNG Bảng 2.1 Thống kê trình tự mồi sử dụng nghiên cứu 444 Bảng 3.1 Sự sai khác trình tự nucleotide vùng ITS phân lập từ mẫu Thổ nhân sâm so với T paniculatum, mã số EU410357 622 Bảng 3.2 Sự sai khác trình tự nucleotide đoạn gen matK phân lập từ mẫu Thổ nhân sâm so với T paniculatum, mã số AY015274 644 Bảng 3.3 Ảnh hƣởng javel 60 % HgCl2 0,1 % đến t lệ nảy mầm hạt 688 Bảng 3.4 Ảnh hƣởng BAP đến phát sinh sinh trƣởng chồi từ mầm 70 Bảng 3.5 Ảnh hƣởng BAP đến phát sinh sinh trƣởng chồi từ đoạn thân mang mắt chồi bên 711 Bảng 3.6 Ảnh hƣởng tổ hợp mg/l BAP IBA đến phát sinh, sinh trƣởng chồi từ đoạn thân mang mắt chồi bên 733 Bảng 3.7 Ảnh hƣởng IAA đến khả rễ Thổ nhân sâm 744 Bảng 3.8 Ảnh hƣởng NAA đến khả rễ Thổ nhân sâm 755 Bảng 3.9 Hiệu tạo đa chồi từ mầm đoạn thân mang mắt chồi bên sau lây nhiễm A tumefaciens 777 Bảng 3.10 Kết biến nạp cấu trúc mang gen GmCHI vào Thổ nhân sâm 799 Bảng 3.11 Hàm lƣợng flavonoid tổng số hai dòng Thổ nhân sâm chuyển gen T1- 2.2; T1- 10 đối chứng không chuyển gen 866 Bảng 3.12 Kết khảo sát vật liệu thích hợp tạo rễ tơ Thổ nhân sâm 90 Bảng 3.13 Ảnh hƣởng mật độ vi khuẩn A rhizogenes, nồng độ AS, thời gian nhiễm khuẩn, thời gian đồng nuôi cấy đến hiệu chuyển gen tạo rễ tơ từ mô Thổ nhân sâm 932 Bảng 3.14 Xác định ngƣỡng diệt khuẩn cefotaxime sau tuần 943 Bảng 3.15 Ảnh hƣởng trạng thái môi trƣờng đến tăng trƣởng rễ tơ Thổ nhân sâm 965 116 general flavonoid and legume-specific 5-deoxy(iso) flavonoid in Lotus japonicas”, Plant physiol, 3, pp 941 - 951 105 Shyamkumar B., Anjaneyulu C., Giri C C (2003), “Multiple shoot induction from cotyledonary node explants of Terminalia chebula”, Biologia Plantarum, 47, pp 585 - 588 106 Siddique I., Anis M (2006), “Thidiazuron induced high frequency shoot bud formation and plant regeneration from cotyledonary node explants of Capsicum annuum L.”, Indian J Biotechnol, 5, pp 303 - 308 107 Siddique I., Anis M (2009), “Morphogenic response of the alginate encapsulated nodal segment and antioxidative enzymes analysis during acclimatization of Ocimum basilicum L.”, Journal of Crop Science and Biotechnology, 12, pp 233 - 238 108 Smith S A., Brown J W., Yang Y., Bruenn R., Drummond C P., Brockington S F., Walker J F., Last N., Douglas N A., Moore M J (2018), “Disparity, diversity, and duplications in the Caryophyllales”, New Phytol, 217, pp 836 - 854 109 Southern E M (1975), “Detection of specific sequences among DNA fragments separated by gel electrophoresis”, J Mol Biol, 98, pp 503 - 517 110 Sun H J., Cui M., Ma B., Ezura H (2006), “Functional expression of the tastemodifying protein, miraculin, in transgenic lettuce”, FEBS Lett, 580, pp 620 - 626 111 Tatiana D Veselova, Khalima K D., Margarita V R., Alexander C T (2012), “Embryology of Talinum paniculatum (Jacq.) Gaertn and T triangulare (Jacq.) Willd (Portulacaceae s.l., Caryophyllales)”, Wulfenia, 19, pp.107 - 129 112 Thiruvengadam M., Praveen N., Kim E H., Kim S H., Chung I M (2014), “Production of anthraquinones, phenolic compounds and biological activities from hairy root cultures of Polygonum multiflorum Thunb”, Protoplasma, 251(3), pp 555 - 566 113 Thwe A., Arasu M V., Li X., Park C H., Kim S J., Al-Dhabi N A., Park S U (2016), “Effect of different Agrobacterium rhizogenes strains on hairy root 117 induction and phenylpropanoid biosynthesis in tartary buckwheat (Fagopyrum tataricum Gaertn)”, Front Microbiol, 7, e65349 114 Timonin A C (2005), “Cymoid evolution resulting in (closed) thyrse: Talinum Adans (Portulacaceae) versus Wilhelm Troll”, Wulfenia, 12, pp 1-19 115 Tomilov A., Tomilova N., Yoder J I (2007), “Agrobacterium tumefaciens and A rhizogenes transformed roots of the parasitic plant Triphysaria versicolor retain parasitic competence”, Planta, 225, pp 1059 - 1071 116 Tsumura Y., Kawahara T., Wickneswari R., Yoshimura K (1996), “Molecular phylogeny of Dipterocarpaceae in Southeast Asia using RFLP of PCRamplified chloroplast genes”, Theor Appl Genet, 93, pp 22 - 29 117 Vanhala L., Hiltunen R., Oksman-Caldentey K M (1995), “Virulence of different Agrobacterium strains on hairy root formation of Hyoscyamus muticus”, Plan Cell Rep, 14, pp 236 - 240 118 Veena V., Taylor C G (2007), “Agrobacterium rhizogenes: recent developments and promising applications”, In Vitro Cell Dev Biol Plant, 43, pp 383 - 403 119 Vijayan K., Tsou C H (2010), “DNA barcoding in plants: taxonomy in a new perspective”, Curr Sci, 99, pp 1530 - 1540 120 Wang R K., Zhan S F., Zhao T J., Zhou X L., Wang C E (2015), “Positive selection sites in tertiary structure of Leguminosae Chalcone isomerase 1”, Genet Mol Res, 14, pp 1957 - 1967 121 Yao L H., Jiang Y M., Shi J (2004), “Flavonoid in food and their health benefits”, Plant Food Hum Nutr, 59, pp 113 - 122 122 Yogananth N., Jothi Basu M (2009), “TLC method for determination of plumbagin in hairy root culture of Plumbago rosea L.”, Glob J Biotechnol Biochem, 4, pp 66 - 69 123 Yosephine S W M., Yachya A., Kristanti A N (2012), “Effect of aeration and inoculum density on biomass and saponin content of Talinum paniculatum 118 Gaertn hairy roots in balloon-type bubble bioreactor”, J Pharm Biomed Sci, 2(4), pp 47 - 52 124 Yosephine S W M., Nike O S S., Alfinda N K (2014), “Production of adventitious root and saponin of Talinum paniculatum (Jacq.) Gaertn in temporary immersion bioreactor”, Scholars Academic Journal of Biosciences (SAJB), 2(4), pp 246 - 250 125 Yosephine S W M., Kristanti A N., Utami E S W (2015), “Optimization of culture conditions of Talinum paniculatum Gaertn adventitious roots in balloon type bubble bioreactor using aeration rate and initial inoculum density”, Asian J Biol Sci, 8, pp 83 - 92 126 Yosephine S W M., Kristanti A N., Utami E S W., Yachya A (2015), “Effect of sucrose and potassium nitrate on biomass and saponin content of Talinum paniculatum Gaertn hairy root in balloon-type bubble bioreactor”, Asian J Biol Sci, 5, pp 1027 - 1032 127 Yulia W I., Razief N (2005), “Study of phytochemistry of Java ginseng compare to Korean ginseng in: Development of animal health and production for improving the sustainability of livestock farming in the integrated agriculture system”, German institute for tropical and subtropical agriculture, pp 45 - 49, Indonesia 128 Zenn Z C., Yi C C., Yi H C., Yen L (2006), “cDNA cloning and molecular characterization of 4-Coumarate: Coenzyme A ligase in Eucalyptus camaldulensis”, Taiwan J For Sci, 21, pp 87 - 100 129 Zhang X., Wang X., An L., Fan S., Xiang W (1995), “Plant regeneration from protoplasts of Talinum paniculatum”, Acta Botanica Sinica, 37(10), pp 754760 130 Zhao J., Ma L., Liu X., Wu H (2009), “Induction of calluses and establishment of plantlet rapid propagation in Talinum paniculatum”, Journal of Southwest University of Science and Technology, 1, pp 103 - 107 131 Zhu W., Jia Q., Wang Y., Zhang Y., Xia M (2012), “The anthocyanin cyanidin-3-O-β-glucoside, a flavonoid, increases hepatic glutathione synthesis and protects hepatocytes against reactive oxygen species during hyperglycemia: involvement of a cAMP-PKA-dependent signaling pathway”, Free Radical Bio Med, 52, pp 314 - 327 119 PHỤ LỤC Phụ lục Hình ảnh mẫu Thổ nhân sâm thu thập đƣợc số địa phƣơng phía Bắc Việt Nam TN1 HT TN2 QN BG Hình P1.1 Năm mẫu Thổ nhân sâm thu thập địa phƣơng phía Bắc Việt Nam TN1: thành phố Thái Nguyên; TN2: huyện Đại Từ, tỉnh Thái Nguyên; QN: huyện Hoành Bồ, tỉnh Quảng Ninh; HT: thị xã Sơn Tây, Hà Nội; BG: huyện Tân Yên tỉnh Bắc Giang 120 Phụ lục Kết xác định vùng ITS, đoạn gen matK, rpoB, rpoC1 mẫu Thổ nhân sâm BLAST NCBI Hình P2.1 Kết xác định vùng ITS mẫu Thổ nhân sâm BLAST NCBI Hình P2.2 Kết xác định đoạn gen matK mẫu Thổ nhân sâm BLAST NCBI 121 Hình P2.3 Kết xác định đoạn gen rpoC1 mẫu Thổ nhân sâm BLAST NCBI Hình P2.4 Kết xác định đoạn gen rpoB mẫu Thổ nhân sâm BLAST NCBI 122 Phụ lục Kết so sánh vùng ITS, đoạn gen matK, rpoB, rpoC1 mẫu Thổ nhân sâm với trình tự GenBank 123 Hình P3.1 Trình tự nucleotide vùng ITS phân lập từ năm mẫu Thổ nhân sâm (BG, TN2, QN, TN1, HT) trình tự nucleotide vùng ITS mang mã số EU410357 loài T paniculatum GenBank 124 125 126 Hình P3.2 Trình tự nucleotide đoạn gen matK phân lập từ năm mẫu Thổ nhân sâm (BG, TN2, QN, TN1, HT) trình tự nucleotide đoạn gen matK mang mã số AY015274 loài T paniculatum GenBank 127 Hình P3.3 Trình tự nucleotide đoạn gen rpoC1 phân lập từ năm mẫu Thổ nhân sâm (BG, TN2, QN, TN1, HT) trình tự nucleotide đoạn gen rpoC1 mang mã số GQ436061 loài T paniculatum GenBank 128 129 Hình P3.4 Trình tự nucleotide đoạn gen rpoB phân lập từ năm mẫu Thổ nhân sâm (BG, TN2, QN, TN1, HT) trình tự nucleotide đoạn gen rpoB mang mã số MG710385 loài T paniculatum GenBank 130 Phụ lục Thành phần môi trƣờng tái sinh Thổ nhân sâm chuyển gen Hỗn hợp Stock I (N1) Thành phần cho lít dung dịch 16,6 g CaCl2.2 H2O 95 g KNO3 + 8,5 g KH2PO4 + 82,5 g (NH4)NO3 + 18,5 g Stock II (N2) MgSO4.7H2O 1,24 g H3BO3 + 4,46g MnSO4.4H2O + mg CuSO4.7H2O Stock III (N3) + 1,72g ZnSO4.7H2O + 50 mg Na2MoO4.2H2O + 166 mg KI + mg CoCl2.6H2O Stock IV (N4) 5,56 g FeSO4.7H2O + 7,46 g Na2EDTA 20 mg Thiamine HCl + 100 mg pyridoxine HCl + 100 mg Stock V (N5) nicotic acid + 0,4 g glycine + 20 g Myoinositol 20 ml stock I/l + 20 ml stock II/l + 5ml stock (III, IV, V)/l MS0 GM + g agarose MS0 + 30 g/l sucrose + 50 ml/l nƣớc dừa MS0 + 30 g/l sucrose + 100 μmol/l acetosyringon + 50 CCM ml/l nƣớc dừa Môi trƣờng SIM lần 1: MS0 + 30 g/l sucrose + 50 ml/l nƣớc dừa + mg/l BAP + 500 mg/l cefotaxim + 50 mg/l kanamycine SIM Môi trƣờng SIM lần 2: MS0 + 30 g/l sucrose + 50 ml/l nƣớc dừa + mg/l BAP + 500 mg/l cefotaxim + 50 mg/l kanamycine MS0 + 30 g/l sucrose + 50 ml/l nƣớc dừa + 500 mg/l SEM cefotaxim + 50 mg/l kanamycine MS0 + 30 g/l sucrose + 0,5 mg/l IAA + 500 mg/l RM cefotaxim + 50 mg/l kanamycine * Ghi chú: Các môi trường chuẩn pH = 5,8 khử trùng Thí nghiệm tiến hành nhiệt độ 25 ± 2oC, thời gian chiếu sáng 16 sáng/ngày