các phương pháp hân lập và tinh chế

MỤC LỤC CHƯƠNG 1: KỸ THUẬT CHIẾT TÁCH 1.1 Kỹ thuật chiết lỏng – lỏng 1.1.1 Nguyên tắc 1.1.2 Điều kiện chiết .3 1.2 Kỹ thuật chiết rắn – lỏng .5 1.2.1 Kỹ thuật chiết cổ điển 1.2.1.1 Kỹ thuật chiết ngấm kiệt (Percolation) 1.2.1.2 Kỹ thuật chiết ngâm dầm (Maceration) 1.2.1.3 Kỹ thuật chiết máy Soxhlet 1.2.1.4 Kỹ thuật chiết lôi nước 1.2.2 Kỹ thuật chiết đại 10 1.2.2.1 Kỹ thuật chiết hỗ trợ vi sóng 10 1.2.2.2 Kỹ thuật chiết hỗ trợ siêu âm 13 1.2.2.3 Kỹ thuật chiết chất lỏng siêu tới hạn (supercritical fluid method) 14 1.2.2.4 Kỹ thuật chiết áp suất cao (Pressurized liquid extraction) 16 1.3 Kỹ thuật chiết pha rắn 17 1.4 Phương pháp thu hồi dung môi 19 CHƯƠNG 2: PHƯƠNG PHÁP NHẬN DANH MỘT SỐ LOẠI HỢP CHẤT TỰ NHIÊN 20 2.1 Alkaloid 20 2.1.1 Đại cương .20 2.1.2 Phương pháp định tính alkaloid 21 2.1.3 Phương pháp chiết tách alkaloid 21 2.2 Flavonoid 23 2.2.1 Đại cương .23 2.2.2 Phương pháp định tính flavonoid 24 2.2.3 Phương pháp chiết tách flavonoid 25 2.3 Terpenoid – Steroid 27 2.3.1 Đại cương .27 2.3.2 Phương pháp định tính terpenoid-steroid .29 2.3.3 Phương pháp chiết tách terpenoid-steroid 30 2.4 Chất béo 30 2.4.1 Đại cương .30 2.4.2 Phương pháp định tính chất béo 32 2.4.3 Phương pháp tách chiết chất béo 32 2.5 Glycosid 33 2.5.1 Đại cương .33 2.5.2 Phương pháp chiết tách glycosid 34 2.6 Hợp chất phenol 35 2.6.1 Đại cương .35 2.6.2 Phương pháp định tính hợp chất phenol 36 2.6.3 Phương pháp chiết tách hợp chất phenol .37 CHƯƠNG 3: PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ 38 3.1 Giới thiệu 38 3.1.1 Nguyên tắc 38 3.1.2 Phân loại .39 3.1.3 Các loại pha tĩnh sử dụng sắc ký 40 3.2 Sắc ký lớp mỏng 42 3.2.1 Tổng quát .42 3.2.2 Quy trình sắc ký lớp mỏng 44 3.2.2.1 Chuẩn bị .44 3.2.2.2 Chấm dung dịch lên mỏng 45 3.2.2.3 Khai triển sắc ký 45 3.2.2.4 Hiện hình vết sau giải ly 45 3.2.2.5 Đọc kết 45 3.2.3 Ứng dụng 46 3.3 Sắc ký cột 46 3.3.1 Sắc ký cột hở 46 3.3.1.1 Nguyên tắc .46 3.3.1.2 Lựa chọn chất hấp thu, dung môi giải ly cột cách nhồi cột 47 3.3.2 Một số kỹ thuật sắc ký cột khác 50 3.3.2.1 Sắc ký cột khô (DCC) 50 3.3.2.2 Sắc ký chớp nhoáng .51 3.3.2.3 Sắc ký nhanh-cột khô 52 3.4 Sắc ký khí 52 3.4.1 Giới thiệu máy sắc ký khí 53 3.4.2 Chuẩn bị mẫu yếu tố ảnh hưởng đến việc tách mẫu 55 3.4.3 Ứng dụng 58 3.5 Sắc ký lỏng hiệu cao 58 3.5.1 Giới thiệu máy sắc ký lỏng hiệu cao 58 3.5.2 Chuẩn bị mẫu .59 3.5.3 Ứng dụng 60 3.6 Một số kỹ thuật sắc ký khác 60 3.6.1 Sắc ký giấy 60 3.6.2 Sắc ký trao đổi ion 61 3.6.3 Sắc ký gel .62 3.6.4 Sắc ký lực 63 3.6.5 Sắc ký tương tác kỵ nước .63 CHƯƠNG 4: MỘT SỐ THỦ THUẬT KHI TINH CHẾ HỢP CHẤT HỮU CƠ .65 4.1 Kỹ thuật kết tinh 65 4.1.1 Giới thiệu 65 4.1.2 Các giai đoạn kết tinh 66 4.1.3 Các phương pháp kết tinh 67 4.2 Kỹ thuật chưng cất 69 4.2.1 Chưng cất đơn giản 70 4.2.2 Chưng cất phân đoạn 71 4.2.3 Chưng cất lôi nước 72 4.3 Kỹ thuật thăng hoa 72 4.4 Kỹ thuật điện di 73 4.4.1 Nguyên tắc 73 4.4.2 Phân loại .74 4.4.3 Cách tiến hành 75 4.5 Các phương pháp làm khô mẫu 76 Phương pháp phân lập tinh chế CHƯƠNG 1: ThS Nguyễn Thị Ngọc Lan KỸ THUẬT CHIẾT TÁCH Chiết dùng dung mơi thích hợp có khả hòa tan chất cần tách tinh chế để tách chất khỏi môi trường rắn lỏng khác Lý phổ biến để thực trình chiết phân tích hóa học để tách làm giàu chất phân tích, hay tách khỏi chất gây nhiễu phân tích Phổ biến q trình chiết dung mơi nước dung mơi hữu Chiết chất nằm chất lỏng khác gọi chiết lỏng, chiết chất chúng nằm chất rắn gọi chiết rắn Tùy theo chất chất bị chiết môi trường chúng tồn ta chọn dung môi chiết thích hợp cho hòa tan chất định chiết mà khơng hòa tan chất mơi trường 1.1 Kỹ thuật chiết lỏng – lỏng Kỹ thuật gọi chiết dung môi Đây phương pháp tách dựa di chuyển chất từ pha lỏng sang pha lỏng khác tính tan khác chúng hai pha lỏng riêng biệt Trong đó, pha dung dịch chứa chất cần chiết, pha lại dung mơi chiết Nguyên tắc chiết dung môi không phân cực (ether dầu hỏa, benzene,…) hòa tan tốt hợp chất có tính khơng phân cực (alcol béo, ester béo,…), dung mơi phân cực trung bình (diethyl ether, chloroform,…) hòa tan tốt hợp chất có tính phân cực trung bình (hợp chất ether, aldehyde, ketone, ester,…) dung mơi phân cực mạnh (methanol, ethanol, nước,…) hòa tan tốt hợp chất có tính phân cực mạnh (alcol, acid,…) -1- Phương pháp phân lập tinh chế ThS Nguyễn Thị Ngọc Lan Khả hòa tan Dung mơi Ether dầu hỏa Nhóm chức hữu Alkane Alkene (C=C), alkyne (CC) n-hexane Benzene Hợp chất thơm Toluene Dichloromethane Chloroform Ether (-O-) Aldehyde Ethyl acetate Butanol ( (-CHO), ketone ) Hợp chất có tính phân cực tăng dần Methanol Ethanol Nước Ester (-COOR), ( ) amide Hydroxyl (-OH), amine (-NH2) Carboxyl (-COOH) Dung mơi có độ phân cực khác hòa tan nhiệt độ phòng hợp chất có độ phân cực tương ứng (chỉ phù hợp với đơn chức) Bảng 1: Độ phân cực dung môi Chỉ số phân cực Nhiệt độ sôi (oC) n-Hexane 0.0 36 Toluene 2.4 111 Diethyl ether 2.8 35 n-Butanol 3.9 118 Tetrahydrofurane 4.0 65 Chloroform 4.1 61 Ethyl acetate 4.4 77 Acetone 5.1 56 Methanol 5.1 65 Ethanol 5.2 78 Acetonitrile 5.8 82 Dimethylsulfoxide 7.2 189 Nước 9.0 100 Dung môi -2- Phương pháp phân lập tinh chế ThS Nguyễn Thị Ngọc Lan 1.1.1 Nguyên tắc Nguyên tắc chiết lỏng – lỏng phân bố chất tan vào hai pha lỏng hai pha lỏng khơng hòa tan vào Hằng số phân bố chất tan cho biết khả hào tan chất hai pha lỏng thời điểm cân bằng, biểu diễn số phân bố K 𝐾= 𝐶𝑎 𝐶𝑏 Trong đó: Ca: nồng độ chất tan pha (a) giai đoạn cân Cb: nồng độ chất tan pha (b) giai đoạn cân Mục đích chiết dung môi để sơ tinh chế hóa hợp chất Nếu chất tan X chất tưởng đồng với chất X có số phân bố lớn tạp bẩn chất khác có cấu trúc hóa học khơng tương đồng với X lại có số phân bố nhỏ áp dụng kỹ thuật chiết lỏng – lỏng để cô lập X chất tương đồng với 1.1.2 Điều kiện chiết • Dung mơi hòa tan tốt chất cần tách • Dung mơi tinh khiết, trung tính, khơng độc, khơng q dễ cháy, dễ bay • Chiết nhiều lần, lần lượng dung mơi • Thực nhiệt độ thích hợp giữ khơng đổi q trình • Sự phân lớp chiết phải rõ ràng, nhanh dễ tách riêng biệt hai pha • Lắc trộn để trình chiết xảy tốt Việc chiết lỏng – lỏng thực phễu chiết, chất cần tách ban đầu nằm chất lỏng pha hữu pha nước, sử dụng thêm nước dung mơi hữu thích hợp để tách chất cần chiết loại bỏ bớt tạp chất khỏi dung dịch ban đầu Tùy vào tỉ trọng dung môi hữu nước mà pha hữu nằm so với pha nước -3- Phương pháp phân lập tinh chế ThS Nguyễn Thị Ngọc Lan Phễu chiết (separating funnel) sử dụng chiết lỏng – lỏng Muốn kiểm tra xem hợp chất chiết vào pha hữu hợp chất lại pha nước chiết lần hồn tất, sử dụng sắc ký lớp mỏng, mỏng cần so sánh đồng thời vết pha nước pha hữu Sự chiết dung mơi cụ thể gọi hoàn tất lần chiết n, mỏng khơng nhìn thấy vết chất pha nước pha hữu Cũng kiểm tra cách nhỏ giọt dung dịch chiết lần thứ n lên kiếng sạch, sau bay hết dung mơi, khơng vết mặt kiếng Kỹ thuật chiết lỏng – lỏng có nhược điểm phải lắc phễu chiết nhiều lần, nên dung môi phễu chiết tạo nhũ tương, gây khó khăn việc tách pha thành hai lớp Để khắc phục nhược điểm này, sử dụng đũa thủy tinh dài đưa vào phễu chiết, khuấy nhẹ dung dịch cọ xát nhẹ vào thành bình, chỗ mặt mặt thoáng dung dịch nhằm phá vỡ bọt khí để dung dịch nhanh chóng phân thành hai lớp Cũng phá bọt cách ly tâm dung dịch Ngồi ra, sử dụng dung mơi ethyl acetate, acetonitrile, … dung mơi có tan nước nên lắc nhiều lần dễ tạo nhũ tương, cho thêm muối NaCl để giảm hòa tan vào dung mơi hữu nước Trong trường hợp chất cần chiết tan pha lỏng nhiều dung môi hay khơng chọn dung mơi khơng dùng phương pháp chiết thường trên, mà phải dùng phương pháp chiết liên tục Để lắp ráp dụng cụ cho phương pháp chiết liên tục cần phải biết tỉ khối dung môi cao hay thấp so với chất cần chiết, tỉ khối khác dụng cụ lắp ráp khác Trong phương pháp chiết này, thực chiết, hai pha lỏng không trộn lẫn vào (hai dung mơi, có dung mơi có chứa chất phân tích) bơm liên tục ngược chiều với tốc độ định hệ chiết, phễu chiết, hay bình chiết liên hồn đóng kín để chúng tiếp xúc với -4- Phương pháp phân lập tinh chế ThS Nguyễn Thị Ngọc Lan Hoặc dung mơi chuyển động, cần pha đứng n bình Khi đó, chất phân tích phân bố vào hai dung mơi theo tính chất chúng, để đạt đến trạng thái cân Để thực cách chiết này, phải có hệ thống máy chiết, cột chiết hay bình chiết, có bơm để bơm chất theo dòng chảy ngược chiều với tốc độ định thích hợp, chất, hay chất chuyển động ngược chiều nhau, phải có tách pha, để tách chất trình chiết, để lấy chất chiết liên tục, hay theo thời điểm (chu kỳ) định mà cân chiết đạt Phương pháp chiết cho hiệu suất cao, tiết kiệm dung môi liên tục đun sôi nên dễ phân hủy chất cần tách Đây phương pháp chiết ứng dụng chiết sản xuất công nghệ (a) (b) (a) Hệ thống chiết lỏng – lỏng liên tục với dung mơi có tỉ trọng lớn nước (b) Hệ thống chiết lỏng – lỏng liên tục với dung mơi có tỉ trọng nhỏ nước 1.2 Kỹ thuật chiết rắn – lỏng Đối với chất rắn chất cần chiết thành nang nhỏ phân tán chất rắn Hiệu suất chiết chất rắn chất lỏng phụ thuộc trước hết vào độ hòa tan, tốc độ chuyển từ pha sang pha khác Tính tan phụ thuộc vào dung mơi tốc độ hòa tan phụ thuộc vào bề mặt tiếp xúc Vì để tăng cường bề mặt tiếp xúc dung môi chiết chất cần chiết, cần nghiền chất rắn nhỏ tốt Có thể tiến hành chiết nguội cách ngâm chất rắn vào dung môi thời gian chiết dung mơi Hoặc thực chiết nóng cách đun hồi lưu dung mơi với chất rắn thời gian chiết -5- Phương pháp phân lập tinh chế ThS Nguyễn Thị Ngọc Lan 1.2.1 Kỹ thuật chiết cổ điển 1.2.1.1 Kỹ thuật chiết ngấm kiệt (Percolation) Hệ thống gồm bình ngấm kiệt thủy tinh, đáy bình van khóa để điều chỉnh vận tốc dung dịch chảy ra; bình chứa đặt bên để hứng dung dịch chiết Phía cao bình ngấm kiệt phễu chiết để chứa dung môi tinh khiết Hệ thống chiết ngấm kiệt Dung mơi rót từ từ vào bình phủ xấp mặt bột cây, sử dụng dung mơi nóng nguội Để n sau thời gian, thường 12-24 Mở van bình ngấm kiệt cho dung dịch chiết chảy giọt nhanh đồng thời mở khóa phễu chiết để dung mơi tinh khiết chảy xuống bình ngấm kiệt Điều chỉnh cho vận tốc dung môi tinh khiết chảy vào bình ngấm kiệt với vận tốc dung dịch chiết chảy khỏi bình So sánh với phương pháp ngâm dầm, phương pháp đòi hỏi thiết bị phức tạp chút hiệu lại cao cơng hơn, q trình chiết liên tục, dung mơi bình ngấm kiệt bão hòa mẫu chất liên tục thay -6- Phương pháp phân lập tinh chế ThS Nguyễn Thị Ngọc Lan dung mơi tính khiết Kiểm tra việc chiết kiệt mẫu sắc ký lớp mỏng kiếng 1.2.1.2 Kỹ thuật chiết ngâm dầm (Maceration) Kỹ thuật ngâm dầm tương tự kỹ thuật chiết ngấm kiệt khơng đòi hỏi thiết bị phức tạp, dễ dàng thao tác với lượng lớn mẫu Ngâm bột bình chứa bình thủy tinh thép khơng rỉ, có nắp đậy Tránh sử dụng bình nhựa dung mơi hữu hòa tan nhựa, gây nhầm lẫn hợp chất có chứa Rót dung mơi tinh khiết vào bình xấp bề mặt lớp bột Giữ yên nhiệt độ phòng đêm ngày, dung môi xuyên thấm vào cấu trúc tế bào thực vật hòa tna hợp chất tự nhiên Sau đó, dung dịch chiết lọc ngang qua giấy lọc; thu hồi dung mơi có cao chiết Tiếp theo, rót tiếp dung mơi vào bình chứa mẫu tiếp tục trình chiết thêm số lần chiết kiệt mẫu Giấy lọc Phễu lọc Bột Bình thủy tinh Dung dịch chiết qua lọc Kỹ thuật chiết ngâm dầm Có thể gia tăng hiệu chiết cách đảo trộn lớp bột Mỗi lần ngâm dung môi, cần 24 đủ, với lượng dung mơi cố định bình, mẫu chất hòa tan vào dung mơi đến đạt mức bão hòa, khơng thể hòa tan thêm nhiều Dung môi sau thu hồi, làm khan nước chất làm khan tiếp tục sử dụng để chiết lần sau -7- Phương pháp phân lập tinh chế ThS Nguyễn Thị Ngọc Lan lớn khỏi cột trước, phân tử nhỏ khỏi cột sau Ứng dụng: kỹ thuật dùng để tách đại phân tử có nguồn gốc sinh học như: protein, polysaccharide, acid nuleic, enzyme, Người ta ứng dụng vào việc đoán trọng lượng phân tử hợp chất chưa biết 3.6.4 Sắc ký lực Sắc ký lực hấp thụ phát lực sinh học mà phân tử sinh học có với phân tử khác cố định pha ổn định Có nhiều phương pháp để rửa giải phân tử lực có nhiều loại sắc ký lực khác nhau, bước theo gradient thường sử dụng Thường sử dụng hệ thống có áp suất thấp Các giá thể (thường agarose) thường chịu áp suất 50psi Nhược điểm: đắt tiền, khó tẩy rửa, chọn lọc phối tử, gắn kết phối tử lên giá thể hoạt hóa thường gặp nhiều khó khăn Ưu điểm: phát triển phương pháp tinh protein A (protein A antigen cho IgG), bắt giữ tốt, cho phép phân tách protein dạng ngun thủy hoạt tính với dạng biến tính Sử dụng sắc ký lực cho tương tác kháng nguyên-kháng thể để tinh kháng nguyên Ngược lại, giá thể có liên kết với kháng nguyên chuyên biệt bắt giữ kháng thể chuyên biệt cho kháng nguyên Ứng dụng nhiều gắn kết protein A vào gel để gắn kết với globulin miễn dịch 3.6.5 Sắc ký tương tác kỵ nước Sắc ký tương tác kỵ nước phuơng pháp bổ sung tốt cho kỹ thuật phân tách khác Trong năm gần đây, phương pháp trở nên thông dụng bước trình sắc ký - 63 - Phương pháp phân lập tinh chế ThS Nguyễn Thị Ngọc Lan Loại hạt Macro-Prep có dẫn xuất nhóm kỵ nước, gốc methyl hay t-butyl Các gốc hấp dẫn gốc kỵ nước khác có bề mặt protein Khi cho mẫu protein vào điều kiện nồng độ muối cao ép phần kỵ nước lại gần đính với Q trình rửa giải thực cách giảm dần nồng độ muối phần kỵ nước lại vào dung dịch Đặc điểm: Phân tách phân tử theo tính kỵ nước phân tử Các nhóm kỵ nước khác đựợc cố đinh bề mặt giá thể Dưới điều kiện nồng độ muối cao (thấp) CÁC phần kỵ nước phân tử tương tác nhóm cố định Các phân tử gắn kết rửa giải cách giảm áp lực ion hòa tan phân tử khỏi giá thể Ưu điểm: cho phép cô mẫu, công suất cao, nhanh, mẫu thu nhận nồng độ muối thấp Nhược điểm: số protein bị tủa nồng độ muối cao, khó nâng cấp quy mơ lớn - 64 - Phương pháp phân lập tinh chế CHƯƠNG 4: ThS Nguyễn Thị Ngọc Lan MỘT SỐ THỦ THUẬT KHI TINH CHẾ HỢP CHẤT HỮU CƠ 4.1 Kỹ thuật kết tinh 4.1.1 Giới thiệu a) Khái niệm Kết tinh trình tách chất rắn hòa tan dung dịch dạng tinh thể Tinh thể vật rắn đồng có hình dạng khác nhau, giới hạn mặt phẳng Tinh thể gồm phân tử nước gọi tinh thể ngậm nước (tinh thể hydrat) Tùy theo điều kiện thực trình mà tinh thể ngậm số phân tử nước khác b) Phương pháp Kết tinh phương pháp thông dụng để tách chất rắn khỏi hỗn hợp chúng Có thể kết tinh từ dung dịch bão hòa từ trạng thái nóng chảy Phương pháp kết tinh đơn giản phương pháp kết tinh từ dung dịch bão hòa Điều kiện cần thiết để có q trình kết tinh phải tạo cho dung dịch bão hòa, tức làm cân pha hệ Do công nghiệp người ta sử dụng nhiều phương pháp: kết tinh tách phần dung môi, kết tinh với thay đổi nhiệt độ, kết tinh chân khơng Trong điều kiện sản xuất, q trình kết tinh bao gồm giai đoạn sau: - Giai đoạn kết tinh cách hạ nhiệt độ hay làm bay phần dung môi - Tách tinh thể khỏi dung dịch lại cách lắng, lọc, li tâm - Kết tinh lại (trong trường hợp cần thiết) - Rửa sấy khơ tinh thể Trong phòng thí nghiệm, trình kết tinh lại gồm giai đoạn sau: - Hòa tan mẫu chất rắn khơng tinh khiết dung mơi thích hợp - Lọc nóng dung dịch để loại bỏ chất phụ không tan - Làm lạnh dung dịch đuổi bớt dung môi để tạo dung dịch bão hòa gây mầm kết tinh - Làm khơ tinh thể Quy trình làm lại nhiều lần để thu chất tinh khiết Chú ý: khác cô đặc kết tinh: - Cô đặc tách phần dung môi để đạt đến trạng thái bão hòa - 65 - Phương pháp phân lập tinh chế ThS Nguyễn Thị Ngọc Lan đến bão hòa - Kết tinh tách phần dung môi hạ nhiệt độ để đạt đến trạng thái bão hòa Điểm khác hai q trình q trình kết tinh có q trình tạo mầm phát triển mầm tạo thành tinh thể, đặc khơng (trừ trường hợp đặc đến nồng độ cao, có nghĩa vừa đặc vừa kết tinh) Ứng dụng: cơng nghệ hóa chất thực phẩm trình kết tinh ứng dụng rộng rãi để nhận chất dạng sạch, sản xuất muối khống, sản xuất amonisunphat, sản xuất đường mía, đường củ cải, 4.1.2 Các giai đoạn kết tinh a) Q trình tạo mầm Mầm tinh thể gọi tâm kết tinh hình thành dung dịch trạng thái bão hòa dung dịch làm lạnh hay cho bốc phần dung môi (trong nồi nấu đường chẳng hạn) Theo quan điểm đại, mầm tạo liên kết ion (phân tử) va chạm với chất hòa tan dung dịch Mầm tinh thể đạt đến trạng thái cân với dung dịch kết tinh dừng lại Trạng thái bão hòa dung dịch tồn khoảng thời gian định gọi chu kì cảm ứng kéo dài từ vài giây đến vài tháng mà khoảng thời gian khơng có mầm tinh thể xuất Chu kì cảm ứng phụ thuộc vào chất chất tan dung mơi, vào mức độ q bão hòa dung dịch, vào nhiệt độ phương pháp khuấy trộn, vào tạp chất, vào tác động học Nếu trạng thái bão hòa lớn vượt giới hạn định (đến vùng bão hòa cao) xuất trình kết tinh tự nhiên, lúc lượng mầm tinh thể nhiều, lúc dung dịch đóng rắn khơng tạo thành tinh thể riêng biệt Có số dung dịch có độ q bão hòa lớn khơng xuất mầm tinh thể, cần phải kích thích q trình kết tinh cách cho vào dung dịch lượng nhỏ tinh thể chất tan tinh thể chất khác có cấu trúc tinh thể giống chất tan (chất cho thêm gọi chất trợ mầm), cách tác động học làm rung động, lắc, ma sát, (như làm ma sát tường chai lọ đũa thủy tinh) Độ nhám bề mặt thiết bị kết tinh vật liệu làm cánh khuấy có ảnh hưởng dến trình tạo mầm - 66 - Phương pháp phân lập tinh chế ThS Nguyễn Thị Ngọc Lan b) Quá trình phát triển mầm tinh thể Tinh thể phát triển kích thước đạt tới giá trị tới hạn mầm Tinh thể có lượng bề mặt lớn nên hút (hấp thụ) chất hòa tan dung dịch Sự lớn lên mầm tinh thể đồng thời theo mặt nó, vận tốc lớn lên mặt tinh thể có khác Theo thuyết khuếch tán sau xuất mầm tinh thể, bề mặt mầm tập trung, kết tụ chất hòa tan (ở dung dịch trạng thái tĩnh) Cùng với lớn lên mầm vật chất khuyếch tán từ môi trường xung quanh đến bề mặt mầm, chất lỏng xung quanh mầm loãng dần chất tan, tức tính chất q bão hòa khơng có chất hòa tan từ vùng xung quanh vào khu vực q trình lớn lên tinh thể ngừng lại 4.1.3 Các phương pháp kết tinh a) Trong công nghiệp Tùy thuộc vào điều kiện cụ thể mà áp dụng phương pháp kết tinh có tách dung mơi khơng tách dung mơi (hạ nhiệt độ dung dịch) kết tinh chân khơng Các q trình kết tinh thực theo phương pháp gián đoạn hay liên tục Quá trình gián đoạn có nhược điểm như: thiết bị cồng kềnh, tinh thể nhận không đều, thao thác vất vả Còn q trình kết tinh liên tục ứng dụng rộng rãi công nghiệp suất cao, tinh thể nhận có kích thước đặn ❖ Kết tinh tách phần dung môi Phương pháp áp dụng để kết tinh từ dung dịch độ hòa tan cấu tử phụ thuộc vào nhiệt độ Để tách dung mơi thực theo phương pháp sau: - Cô đặc dung dịch (cho bay nhiệt độ sôi) Phương pháp kết tinh cho bay cô đặc có nhược điểm tinh thể bị dính lên bề mặt truyền nhiệt đồng thời làm tăng nồng độ tạp chất có dung dịch Để hạn chế lượng chất rắn đọng bề mặt truyền nhiệt phải tăng vận tốc tuần hoàn dung dịch khuấy trộn - Cho bay dung môi nhiệt độ nhỏ nhiệt độ sôi dung dịch Cho bay tự nhiên (thực thiết bị hở), hay cho bay áp suất chân không - 67 - Phương pháp phân lập tinh chế ThS Nguyễn Thị Ngọc Lan ❖ Kết tinh với thay đổi nhiệt độ: (kết tinh không tách dung môi) Phương pháp áp dụng để kết tinh từ dung dịch độ hòa tan cấu tử phụ thuộc vào nhiệt độ Kết tinh có đuổi dung môi để tạo điều kiện tập hợp liên kết lớn (nếu lượng mầm nhiều tạo thành tinh thể nhỏ, mịn dễ đóng rắn, gây bất lợi) Hơn sản phẩm kết tinh có chứa nhiều tạp chất, ngồi việc đuổi dung mơi phương pháp tự bay tiến hành chậm, đặc hút chân khơng tương đối đắt tiền Do đó, việc kết tinh cách hạ nhiệt độ thuận lợi Để hạ nhiệt độ dung dịch thường dùng nước lạnh hay nước muối Phương pháp kết tinh làm việc liên tục hay gián đoạn Kết tinh gián đoạn cách cho dung dịch vào đầy thiết bị, sau kết tinh xong, nước tinh thể tháo ngồi Còn kết tinh liên tục thực nhiều thiết bị nối với nhau, dung dịch từ thiết bị qua thiết bị khác sản phẩm lấy liên tục ❖ Kết tinh chân không Trong phương pháp kết tinh chân không, phần dung môi bay nhờ vào nhiệt vật lí dung dịch Hơi bay theo đường bơm chân không Nhiệt độ dung dịch trạng thái bão hòa giảm đến nhiệt độ sơi tương ứng với áp suất chân không thiết bị Dung dịch đạt đến trạng thái bão hòa kết tinh Dung môi bay không nhiệt vật lí dung dịch mà tỏa nhiệt kết tinh Kết tinh tiến hành đồng thời bay hút chân không làm lạnh tăng cường q trình xảy tồn thể tích dung dịch, tinh thể hạn chế dính vào bề mặt thiết bị thời gian rửa thiết bị rút ngắn b) Trong phòng thí nghiệm Hòa tan chất rắn cần kết tinh dung mơi thích hợp vừa phải nhiệt độ sôi (thường nhiệt độ sôi dung môi) với lượng chất hòa tan xác định Đun sơi sau tiếp tục bổ sung thêm dung mơi đến chất rắn tan hồn tồn (ở nhiệt độ sơi) Nếu q trình hòa tan xuất lớp dầu cần thêm dung môi tiếp đun cho tan hết lớp dầu Nếu dung dịch hòa tan có màu cần thêm than hoạt tính (với lượng 12% hàm lượng chất hòa tan) vào dung dịch đun sơi lại dung dịch Sau hòa tan xong cần lọc nóng để loại chất bẩn khơng tan, tránh kết tinh lọc Dung dịch sau lọc, để nguội từ từ kết tinh Quá trình kết tinh lặp lại nhiều lần để thu chất tinh khiết Các tinh thể lọc, làm khô xác định nhiệt độ nóng chảy - 68 - Phương pháp phân lập tinh chế ThS Nguyễn Thị Ngọc Lan Ðiều quan trọng phải biết chọn thử dung mơi hòa tan: chất phân cực dễ tan dung môi phân cực, chất không phân cực dễ tan dung môi không phân cực - Các dung môi phân cực: nước, alcol, ether, ester, acetic acid - Các dung môi không phân cực: benzene, hexane, cyclohexane, CCl4, carbon disulfide - Có thể dùng hỗn hợp dung môi Các dung môi chọn phải thỏa mãn số tính chất sau: - Phải tan tốt chất hòa tan tan nhiệt độ thường lạnh - Khơng phản ứng hóa học với chất tan - Các tạp chất không tan với dung môi chọn nhiệt độ cao hòa tan tốt nhiệt độ thường lạnh - Dung môi chọn phải dễ dàng bay khỏi bề mặt tinh thể - Nhiệt độ sôi dung môi phải thấp nhiệt độ nóng chảy chất rắn khoảng 10→ 15% 4.2 Kỹ thuật chưng cất Chưng cất trình chuyển chất lỏng thành ngưng tụ thành lỏng Để chuyển chất lỏng thành hơi, tiến hành đun sôi chất lỏng Chất lỏng sơi áp suất áp suất bên ngồi Khi áp suất bên ngồi giảm nhiệt độ sơi chất giảm Với chất tinh khiết nhiệt độ sơi khơng đổi q trình đun, khơng có tượng nhiệt đun mạnh Nếu nhiệt độ sôi chất thấp nhiệt độ chất bị phân hủy tiến hành chưng cất áp suất thường Còn nhiệt độ sơi chất cao nhiệt độ phân hủy phải tiến hành chưng cất áp suất thấp Phương pháp chưng cất thường dùng để tách biệt (tinh chế) chất có nhiệt độ sơi khác khỏi hỗn hợp Có nhiều phương pháp chưng cất khác tùy thuộc vào tính chất hỗn hợp chất lỏng - Với chất có nhiệt độ sơi xa thường chọn phương pháp chưng cất đơn hay chưng cất thường - Với chất có nhiệt độ sơi gần thường chọn phương pháp chưng cất phân - 69 - Phương pháp phân lập tinh chế ThS Nguyễn Thị Ngọc Lan đoạn - Phương pháp chưng cất lôi nước dùng để tách biệt chất hỗn hợp, có chất khơng tan nước dễ bay với nước Thông thường phương pháp lựa chọn thỏa mãn điều kiện không thực với hai phương pháp Các phương pháp chưng cất tiến hành áp suất bình thường áp suất thấp tùy vào đặc điểm tính chất hỗn hợp chưng cất Dụng cụ dùng để chuyển từ dạng sang dạng lỏng trình chưng cất gọi ống sinh hàn Có nhiều loại ống sinh hàn: ống sinh hàn khơng khí, ống sinh hàn nước; ống sinh hàn thẳng, xoắn, bầu, tùy vào chất chất tùy vào mục đích sử dụng Với chất lỏng sơi nhiệt độ thấp 80oC dùng ống sinh hàn nước, cao 150oC dùng sinh hàn khơng khí, giới hạn 200- 300oC hứng trực tiếp nhánh bình cất 4.2.1 Chưng cất đơn giản Dùng để tách biệt chất đủ bền đun nóng thực tế khơng bị phân hủy nhiệt độ sôi Phương pháp thường dùng với chất có nhiệt độ sơi cao 40oC thấp 160oC chất lỏng sơi thấp 40oC nhiều sau chưng cất nên khơng có hiệu Nếu chưng cất sử dụng ống sinh hàn, ống sinh hàn thường lắp xuôi để chất ngưng tụ thu bình hứng Tốc độ cất thường từ 1-2 giọt chất lỏng rơi vào bình hứng giây Để chất lỏng sôi tránh tượng lửa khơng có tượng sơi với biểu hạt chất lỏng chuyển động bề mặt chất lỏng, dẫn đến tượng chất lỏng sôi trào mạnh tràn sang bình hứng, cần phải cho vào bình cất đá bọt, hay ống mao quản hàn kín đầu vào bắt đầu đun nóng Chú ý khơng cho đá bọt vào bình cất sôi Chưng cất đơn giản ứng dụng: - Khi nhiệt độ sôi hai cấu tử khác xa - Khi khơng đòi hỏi sản phẩm có độ tinh khiết cao - Tách hỗn hợp lỏng khỏi tạp chất không bay - Tách sơ hỗn hợp nhiều cấu tử - 70 - Phương pháp phân lập tinh chế ThS Nguyễn Thị Ngọc Lan Hệ thống chưng cất đơn 4.2.2 Chưng cất phân đoạn Chưng cất phân đoạn dùng để tách biệt hỗn hợp chất lỏng hòa tan vào Để tách chất khác khỏi hỗn hợp chất lỏng dùng phương pháp chưng cất thường nhiều lần thường gọi chưng cất “thuận dòng” Tuy nhiên để tăng hiệu suất chưng cất giảm số lần chưng cất, người ta dùng cột cất phân đoạn Bản chất tác dụng cột cất phân đoạn ngưng tụ phần hỗn hợp cho bay phần chất ngưng tụ lại cách liên tục Hơi bay lên cột cất phân đoạn cao giàu cấu tử có nhiệt độ sơi thấp, chất lỏng chảy trở lại vào bình giàu cấu tử có nhiệt độ sôi cao Cấu tạo cột cất đảm bảo tiếp xúc tốt chất lỏng chảy xuống lên trên, nên gọi chưng cất “ngược dòng” Trong cột cất, số mắt hay đĩa nhiều tách biệt hồn tồn tốc độ cất nhỏ, mắt hay đĩa có tác dụng lần cất thường - 71 - Phương pháp phân lập tinh chế ThS Nguyễn Thị Ngọc Lan Hệ thống chưng cất phân đoạn 4.2.3 Chưng cất lơi nước Q trình chưng nước trực tiếp hợp lí dùng để tách cấu tử không tan nước khỏi tạp chất không bay hơi, trường hợp sản phẩm ngưng phân lớp: cấu tử bay nước Ưu điểm trình chưng giảm nhiệt độ sơi hỗn hợp, nghĩa chưng nhiệt độ thấp nhiệt độ sôi cấu tử Điều có lợi chất dễ bị phân hủy nhiệt độ cao chất có nhiệt độ sơi cao Chưng nước trực tiếp tiến hành gián đoạn hay liên tục Ðối với chất hữu tan nước, khơng phản ứng với nước có áp suất lớn nhiệt độ sôi nước thường dùng phương pháp chưng cất lôi theo nước Phương pháp lôi nước áp dụng cho chất có nhiệt độ sơi lớn 100oC 4.3 Kỹ thuật thăng hoa Thăng hoa trình làm bay chất rắn thành ngưng tụ lại thành trạng thái rắn, không qua trạng thái lỏng Những chất chuyển từ trạng thái rắn sang trạng thái khí mà không qua trạng thái lỏng gọi chất thăng hoa Sự thăng hoa áp suất chất rắn tăng theo nhiệt độ nên đun nóng đến nhiệt độ mà áp suất chất rắn áp suất bên ngồi chất thăng hoa Dựa vào tính chất để tinh chế chất rắn có áp suất lớn nhiệt độ thấp nhiệt độ nóng chảy chúng áp suất thường, ví dụ tinh thể iod, benzoic acid, naphtalene, quinon, … Đối với chất bay không thăng hoa áp suất thường thăng hoa chậm tiến hành áp suất thấp - 72 - Phương pháp phân lập tinh chế ThS Nguyễn Thị Ngọc Lan Sự thăng hoa xảy nhiệt độ thấp nhiệt độ nóng chảy nhiệt độ sơi Phương pháp thăng hoa có ưu điểm phương pháp khác thu chất tinh khiết dùng lượng nhỏ chất Ngược lại phương pháp có nhược điểm chất bẩn phải có tính bay khác nhiều so với chất tinh chế, trình thăng hoa thường chậm hao phí nhiều chất phương pháp khác Tốc độ thăng hoa tỉ lệ thuận với áp suất chất nhiệt độ xác định, tỉ lệ với độ lớn bề mặt chất bay tỉ lệ nghịch với áp suất bình Phương pháp tiến hành thăng hoa áp suất thường Với dụng cụ đơn giản, lượng nhỏ: chất cần thăng hoa vào bát sứ, phủ giấy lọc có chọc thủng nhiều lỗ nhỏ đậy bát phễu thủy tinh có bọc giấy tẩm ướt hay vải ướt bên ngồi, có đậy cuống phễu bơng Sau đó, đun nóng bát sứ lửa đèn cồn hay bếp điện qua lưới amiăng hay bếp cách cát cách cẩn thận đun nóng q phân hủy chất thăng hoa Những chất khơng khó thăng hoa áp suất thường thăng hoa áp suất thấp Ưu điểm: công nghệ đơn giản, thời gian ngắn, độ tinh khiết cao, giá thành rẻ Nhược điểm: khơng có nhiều chất thăng hoa thực tế Dụng cụ thăng hoa áp suất thường Dụng cụ thăng hoa áp suất thấp 4.4 Kỹ thuật điện di Điện di trình dịch chuyển phân tử tích điện dung dịch tác dụng điện trường Điện di thường dùng việc tinh phân tích phân tử sinh học nucleic acid, protein số phức hợp carbohydrat, lipid 4.4.1 Nguyên tắc Dựa vào tích điện định khối lượng khác phân tử protein hay nucleic acid nên đặt chúng điện trường chúng di chuyển Các ion - 73 - Phương pháp phân lập tinh chế ThS Nguyễn Thị Ngọc Lan mang điện tích ngược dấu di chuyển theo hai hướng ngược chiều nhau, ion mang điện tích dấu di chuyển chiều di chuyển với vận tốc khác nên tách rời Có nhiều phương pháp khác sử dụng để phân tích ADN ARN như: phương pháp ly tâm, sắc ký, đo qunag phổ kế, điện di: agarose gel, polyacrylamide, điện di trường xung điện Nhưng điện di agarose gel phương pháp sử dụng phổ biến ưu điểm nhanh tương đối đơn giản Hệ thống điện di dung dịch sử dụng hệ đệm dung dịch thay cho môi trường rắn, hệ thống chịu ảnh hưởng xáo trộn mẫu có khuếch tán phân tử tích điện, làm giảm độ phân giải trình ứng dụng, phân tách bước loại bỏ mẫu Như hệ thống điện di dung dịch phải sử dụng vài phương tiện nhằm ổn định dung dịch tế bào điện di Máy điện di với gel đặt nằm ngang dựng đứng 4.4.2 Phân loại Điện di thường phân loại dựa vào khác môi trường điện di chất mang rắn nơi mà phân tử tích điện dịch chuyển • Điện di giấy (Paper Electrophoresis): Điện di giấy phương pháp điện di thường sử dụng để phân tích phân giải phân tử cỡ nhỏ Phương pháp không sử dụng để phân giải đại phân tử (ví dụ protein…) hấp thụ sức căng bề mặt liên kết với giấy điện di thường làm thay đổi biến tính đại phân tử tạo độ phân giải • Điện di mao quản (Capillary Electrophoresis): vật chất phân tích mơi trường điện di đặt ống mao dẫn mịn, dài (thông thường dài từ 50 đến - 74 - Phương pháp phân lập tinh chế ThS Nguyễn Thị Ngọc Lan 100cm đường kính từ 15 đến 100 μm) Một lượng mẫu nhỏ (cỡ nano lít) đặt đầu ống mao dẫn chịu điện di trường tạo điện áp từ 20 đến 30kV • Điện di gel (Gel Electrophoresis): Đối với phương pháp điện di gel, phân tử phân tách hệ đệm lỏng hỗ trợ chất polime • Điện di hội tụ (Electrofocalisafion): Đó kiểu điện di thực gradient pH Các thành phần di chuyển theo điểm đẳng điện dừng lại vùng có pH tương ứng với pH đẳng điện chúng • Điện di hai chiều (Electrophorese bidimensionnell): Thực lần điện di theo hướng vuông góc với Có thể kết hợp điện di acrylamide-agarosse, điện di đơn điện di hội tụ, Trong thực hành, người ta thực điện di hội tụ theo hướng, điện di gel acrylamide-SDS theo hướng thứ hai • Điện di miễn dịch: Điện di miễn dịch thực gel agarose lam kính phim nhựa, cho phép phân tích đồng thời nhiều mẫu thử 4.4.3 Cách tiến hành - Chất mang cấu tạo từ số vật liệu khác như: giấy, cellulose acetate, polycrylamide, agarose, tinh bột Trong đó, gel polyacrylamide agarose chất mang có tác dụng sàng lọc lực chọn theo kích thước Gel thường tạo thành dạng: thỏi, bản, mỏng Để tách protein thường sử dụng dụng gel polyacrylamide, để tách nucleic acid dùng gel polyacrylamide aragose tùy thuộc vào kích thước phân tử cần tách - Đưa lớp mẫu mỏng vào dung dịch ổn định chất mang (supporting media) có cấu tạo nhiều khe hở (mạng lưới) - Dưới tác dụng hiệu điện thế, phân tử khác mẫu di chuyển qua chất mang với vận tốc khác Chất mang cần thiết dòng điện qua dung dịch điện di tạo nhiệt trộn lẫn băng thiêu môi trường tạo cân - Các phân tử sau tách phát dạng băng (vệt) vị trí khác chất mang cách: o Nhuộm (ethyldium bromide, coomassie blue, AgNO3) o Sử dụng phương pháp phóng xạ ghi o Định lượng cách quét mật độ kế - 75 - Phương pháp phân lập tinh chế ThS Nguyễn Thị Ngọc Lan 4.5 Các phương pháp làm khô mẫu Sau chiết mẫu dung môi, lọc, thu hồi dung môi, hỗn hợp thu thu cần làm khơ vì: - Các hợp chất hỗn hợp ổn định bền chúng diện trạng thái khô trạng thái lỏng - Để biết khối lượng tính hiệu suất - Để tiếp tục tinh chế phương pháp khác - Nếu mẫu hợp chất tinh khiết muốn đo số liệu phổ lý tính a) Sấy khơ khí trơ máy quay chân khơng Khi quay chân khơng, đến lúc mẫu khơ hồn tồn, cho luồng khí trơ (N2) vào máy Nếu khơng có khí trơ, để mẫu lâu máy cô quay hoạt động b) Sấy khơ nhờ bình hút ẩm Mẫu cần làm khơ đặt cốc thủy tinh, miệng cốc đậy tờ giấy lọc, cột chặt nhờ cọng thun, dùng kim nhọn để đục số lỗ tờ giấy lọc Đặt cốc thủy tinh vào bình hút ẩm, đáy bình có chứa chất hút ẩm KOH, NaOH rắn, silica gel, P2O5, CaCl2 khan, … Đậy nắp bình, nắp cần thoa chất bôi trơn silicon để giữ bình kín Sử dụng ống cao su để nối vòi bình vào máy bơm hút Mở van khóa vòi bình, cho máy bơm hoạt động để hút khơng khí khỏi bình, đến bình chân khơng Cho máy bơm hút 30-60 phút tùy cơng suất máy Khóa van bình hút ẩm tắt máy bơm sau, rút ống cao su khỏi bình, để yên đêm Thực thao tác vài lần, mẫu chất bình khô - 76 - Phương pháp phân lập tinh chế ThS Nguyễn Thị Ngọc Lan Bình hút ẩm Cần lưu ý thay chất hút ẩm Hợp chất xem khô cân lần sau trọng lượng mẫu không thay đổi so với lần cân trước (giữa hai lần cân, mẫu sấy) c) Đông khô chân không (lyophillzation) Kỹ thuật áp dụng cho mẫu dịch chiết nước, thường dùng công nghiệp dược thực phẩm Dung dịch chiết chứa bình cầu, dung dịch làm đơng đặc thành đá cách nhúng bình cầu vào chậu thủy tinh kích thước lớn bình cầu, chậu có chứa ethanol acetone viên đá CO2 rắn Xoay tròn bình cầu để thành ngồi bình cầu tiếp xúc với lạnh Hỗn hợp alcol-CO2 làm dung dịch nước bên bình cầu hóa rắn thành đá cục Tiếp theo, lắp bình cầu vào máy đông khô chân không Hệ thống máy hạ nhiệt độ xuống -80oC, chân không sâu, kế nhiệt độ nâng dần lên Trong q trình nâng dần lên, nước bình cầu bốc hết khỏi bình cầu Sau khoảng 24 giờ, bình cầu chứa mẫu dạng khơ, tơi, xốp, dễ dàng hòa tan trở lại vào nước Dạng bột dễ hút ẩm, phải trữ bình kín đóng gói kín - 77 - ... alkaloid, để tinh chế phân lập riêng alkaloid phương pháp kết tinh phân đoạn dung môi, sử dụng thêm số phương pháp khác như: phương pháp trao đổi ion, phương pháp sắc ký cột, sắc ký lớp mỏng điều chế ... môi -2- Phương pháp phân lập tinh chế ThS Nguyễn Thị Ngọc Lan 1.1.1 Nguyên tắc Nguyên tắc chiết lỏng – lỏng phân bố chất tan vào hai pha lỏng hai pha lỏng khơng hòa tan vào Hằng số phân bố chất... bị đun nóng hấp thu vi sóng bốc nên sử dụng để hỗ trợ phương pháp chưng cất lơi nước Lò đơn cách Lò đa cách - 11 - Phương pháp phân lập tinh chế ThS Nguyễn Thị Ngọc Lan Chưng cất lôi nước Chưng