Đánh giá một số tính chất sinh y học của nấm linh chi ganoderma lucidum

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC T ự NHIÊN Tên đề tài: ĐÁNH GIÁ MỘT SỐ TÍNH CHAT SINH Y HỌC CỦA NẤM LINH CHI GANODERMA LUCIDUM Chủ trì đề tài: Th.s Tạ Bích Thuận Cán tham gia: Th.s Nguyễn Quang Huy CN Nguyễn Thị Thanh Hương H N ôi - 0 Báo cáo tóm tát: a Tên đề tài: Đánh giá số tính chất sinh y học nấm Linh chi Ganoderma lucidum QT-06-25 M ã số: b Chủ trì đề tài: Ths Tạ Bích Thuận c Các cán tham gia: Ths Nguyễn Quang Huy CN Nguyễn Thi Thanh Hương d Mục tiêu nội dung nghiên cứu: M ụ c tiêu: Đánh giá tác dụng sinh y học nấm Ganoderma lucidum khả chống viêm thực nghiệm, khả bảo vệ vi sinh vật chống lại chất ức chế sinh trưởng khả bảo vệ lipit khỏi peroxit hoá N ội dung: - Tìm hiểu tác dụng chống viêm thực nghiệm nấm Ganoderma lucidum đối tượng động vật điều kiện phòng thí nghiệm - Tim hiểu khả bảo vệ vi sinh vật chống lại chất ức chế sinh trưởng nấm Ganoderma lncidum - Tìm hiểu khả bảo vệ peroxit hoá lipit tế bào gan chuột nấm Ganoderma lucidum e Các kết đạt được: - N u ô i t r n g v thu s i n h k h ố i nấm Ganoderma liiciclum - Tách chiết ca o nấm Ganoderma lưcidum từ sinh khối Đánh giá khả chống viêm thực nghiệm chuột nhắt trắng cho uống tiêm dịch chiết nấm Ganoderma hicidum - Đánh giá khả nãng bảo vệ vi sinh vật nấm Ganoderma lucidum sử dụng N a N chất ức c h ế sinh trưởng - Đánh giá khả bảo vệ peroxit hoá lipit tế bào gan chuột dịch chiết nấm Ganoderma lucidum f Tinh hình kinh p h í : Tổng kinh phí đề tài là: 0.000.000 V N Đ Thanh toán dịch vụ cồng cộng: 1.100.000 V N Đ Hội nghị: 1.000.000 V N Đ Chi phí thuê mướn: 8.500.000 V N Đ Chi phí nshiệp vụ chun mơn: 9.400.000 V N Đ Sum m ary a) The title of subject: Evaluation of several biomedical characteristics of Ganoderma lucidum Numerical code: QT - 06 - 25 b) The grant holder: M.Sc Ta Bich Thuan c) The Participants: M.Sc Nguyen Quang Huy B.Sc Nguyen Thi Thanh Huong d) Objectives and contents * Objectives: Investigate including the biomedical activities o f Ganioderma lucidum extract (GLE) anti-inflammatory, protection effect toward microorganism against growth-inhibitors, and anti-lipidperoxidation * Contents : > Evaluate the anti-inflammatory o f GLE on the animal in laboratorial condition > Evaluate the protection effect toward microorganism against growth- inhibitor > Evaluate the anti-lipidperoxidation o f GLE on mice liver cells, e) The obtained results: > C u ltu re and harvest biomass of Ganoderma lucidum > Prepare extract of Ganoderma lucidum > Data about the anti-inflam m atory activity of G L E on white mice through oral and injection route > Data about the protection effect of G L E tow ard m icroorganism against grow th-inhibitor N a N > Data about the anti-lipidperoxitdation of G L E on mice liv e r cells X Á C N H Ậ N C Ủ A B A N C H Ủ N H IỆ M K H O A (ký ghi rõ họ tên) PHÓ C llủ NHIỆM KHOA PGS.TS 'M m (Êuan jtfc fõ ỗ N H N C Ủ A T R Ư Ờ N G CH Ủ TRÌ ĐỂ TÀI (ký ghi rõ họ tên) / C'L /3 i oA M Ụ C LỤ C M Ở ĐẦU T Ổ N G Q U A N TÀI LIỆU G iớ i thiệu nấm L in h chi Ganoderma lucidum 1.1 Vị trí nấm Linh chi hệ thống phản loại 1.2 Đặc điểm sinh học nấm Linh chi Ganoderma lucidum Giới thiệu sô tác dụng sinh y dược nấm Linh chi Ganoderma lucidum 2.1 Tác dụng chữa bệnh nấm Linh chi Ganoderma lucidum 2.2 Tác dụng chống oxi hoá củ a nấm Linh chi Ganoderma lucidum 2.3 Khả kháng sinh, kháng viêm nấm Linh chi Ganoderma lucidum 2.4Khả chống tác nhản gây đột biến ung thư nấm Linh chi Ganoderma lucidum N G U Y Ê N LIỆU, PHƯƠNG PHÁP N GHIÊN c ú u 12 Nguyên liệu 12 C ác hoá chất 12 Dụng cụ 12 Phương pháp nghiên cứu 12 4.1 Phương pháp nuôi cấy nấm Linh chi Ganoderma lucidum 12 4.2 Phương pháp tách chiết cao nấm Linh chi Ganoderma lucidum 12 4.3 Đánh giá khả chống viêm thực nghiệm 13 4.4 Đánh giá lioạt tính chống peroxit hố lipit gan chuột 13 4.5 Phương pháp đánh giá khả bảo vệ vi sinh vật dịch chiết nấm Linh Ganoderma lucidum với tác nhân gây ức chế sinh trưởng KẾT Q U Ả NG H IÊN CÚƯ 14 15 N uô i cấy thu sinh khối sợi nấm L in h chi Ganoderma lucidum 15 Tách chiết cao nấm từ sinh khối sợi nấm L in h chi Ganoderma lucidum 15 Đánh giá khả chống viêm nấm L in h chi Ganoderma lucidum động vật thực nghiệm 16 K h ả bảo vệ vi sinh vật nấm L in h chi sử dụng N a N chất gây ức ché sinh trưởng 19 4.1 Xác định nồng độ clịcìi chiết nấm Linh chi có tác dụng kích thích sinh trưởng vi khuẩn 19 4.2 Xác địnli nồng độ N a N j gây chếtdối với vi khuân 4.3 Đánh giá khả Ganoderma lucidum 21 bảo vệ vi khuẩiicủa dịch chiết nấm Linh chi 21 Đ ánh giá khả nãng chỏng peroxit hoá lip it gan chuột dịch chiết Ganoderma lucidum 22 THẢO L U Ậ N 24 KẾT L U Ậ N V À KIẾN NGHỊ 26 K ế t luận 26 K iế n nghị 26 TÀI LIỆU TH A M K H Ả O 27 Nấm Linh Chi từ lâu coi loại thuốc dân gian có tác dụng tăng cường sức khỏe chữa trị nhiều loại bệnh bệnh gan, thận, bệnh tiểu đường, bệnh dị ứng, cắt ho suyễn, điều hoà huyết áp, làm giảm lượng đường máu, tăng cường thị lực, giảm colesteron, chống lão hố có khả chống oxy hố cao Nấm Linh Chi có lồi có khả tăng cường thải độc gan, kích thích hệ thống miễn dịch hoạt động có hiệu cao Các nghiên cứu y dược học cho thấy lồi Linh chi khác sản sinh loại hợp chất sinh học khác có tính chất biệt dược q Ngồi nấm Linh chi kìm hãm sinh tổng hợp ADN tế bào ung thư, kìm hãm phát triển khối u, làm giảm đau bệnh nhân di Trải qua thời gian dài lịch sử tiến hoá với biến động thời tiết, khí hậu mơi trường, Linh chi trường tồn giữ nguyên giá trị siêu dược liệu mình, nhân sâm nước Châu Á Nhật Bản, Trung Quốc, Hàn Quốc việc nghiên cứu, phát triển sử dụng Linh chi triển khai với quy mô rộng lớn, phân loại học, thu hái tự nhiên, nuôi trồng chủ động, nghiên cứu thành phần hoá học, hợp chất tự nhiên, tác dụng dược liệu phương pháp điều trị lâm sàng Trong năm gần đây, việc nghiên cứu nấm Linh chi nhiều nhà khoa học quan tâm đến Nhưng để tìm hiểu kỹ nguyên nhân, tác dụng khả chữa bệnh nấm Linh chi Việt Nam chưa nghiên cứu sâu Với mục đích nhằm nghiên cứu, tìm hiểu thêm khả dược liệu nấm Linh chi giao thực đề tài “Đánh giá số tính chất sinh y học nấm Linh chi Ganoderma ỉiicidum” Đề tài nghiên cứu nhằm mục đích như: thăm dò khả nãng chống viêm thực nghiệm, tác dụng bảo vệ vi sinh vật chống lại chất ức chế sinh trưởng xác định khả bảo vệ peroxit hoá lipit đối tượng sinh vật nói chung Thơng qua kết mà đề tài đạt được, bước đầu đánh giá bổ sung thêm số tính chất dược liệu quý nấm Linh chi Ganoderma lucidum nuôi trồng Việt Nam TỔNG QUAN TÀI LIỆU G iớ i thiệu nấm L in h chi Ganoderma lucidum 1.1 Vị trí nấm Linh chi hệ thống phản loại Các nấm Linh Chi trước xếp vào nhóm nấm nhiều lỗ (polypore) Lịch sử nghiên cứu hệ thống tự nhiên họ Linh Chi nói lịch sử nghiên cứu cấu trúc bào tử đảm chúng Từ 120 năm trước, Karten, nhà nấm học Phần Lan, lần tách từ nấm polypore nhóm nấm đặc biệt, xây dựng nấm độc lập Ganoderma Karst theo kiểu bào tử đảm đặc trưng Đó kiểu bào tử đảm có lớp vỏ kép, hình trứng cụt, bề mặt sần sùi mụn cóc, gò nhỏ, nhờ việc phân loại nấm Linh Chi tiến bước quan trọng Người ta dễ dàng lọc từ nhóm Polypore, Formes, Boletus lồi mà vị trí tự nhiên chúng thuộc Ganoderma Chính Patouillard (1889) góp phần to lớn việc khái quát kiểu bào tử đặc trưng Ganoderma Karst Tuy thân tên chi - derma nghĩa lớp vỏ, gamo láng bóng thể nét chủ đạo hình thái thể bên ngồi đa số chúng có lớp vỏ láng bóng chói màu verni, màu từ vàng - vàng cam - đỏ hung, nâu tím - nâu đen [3] Tuy nhiên, tính đồng cao cấu trúc bào tử loài chi đặc trưng Q trình phân hố Ganoderma Karst Amauroderma Murr mối quan hệ chặt chẽ chúng chủ yếu dựa vào cấu trúc đảm bào tử Donk - nhà nấm học Halan xây dựng nên họ Linh Chi Ganodermataceace Donk, lần tách khỏi họ polyporaceace thừa nhận rộng rãi [1] Trong trình phân hố dạng sống nhóm Ganoderma từ xuống đất với q trình tiến hố cấu trúc bào tử đảm, Linh Chi phân loại : Giới nấm Mycetalia Ngành nấm đảm Basidiomycota Lớp nấm đảm Basidiomycetes Bộ nấm lỗ Aphyllophorales Họ Linh Chi Ganodermataceace Chi Ganoderma Loài Gauoderma lucidum ỉ Đặc điểm sinh học Ganoderma lucidum 1.2.1 Đặc điểm hình thái Nấm có thể có cuống dài, ngắn hay khơng có cuống Mũ nấm dính lệch hay dính bên, màu nâu đỏ, bóng lống, mũ nấm dạng thận, đơi xòe hình quạt nhiều dị dạng [3] Trên mặt mũ có vân gợn đồng tâm có tia rãnh phóng xạ, màu sắc từ vàng nâu - vàng cam - đỏ cam - đỏ nâu - nâu tím - nâu đen mũ nấm sẫm màu dần già Đường kính tán biến động từ 2-30 cm, dày 0,8 - 2,5 cm Thịt nấm dày từ 0,4 - cm màu vàng kem - nâu nhạt - trắng Khi dạng tươi, thịt nấm mềm, dai, già khô chắc, cứng nhẹ Hệ sợi nấm kiểu trimitic, đầu tận lớp sợi phình hình trứng màng dày đan kít vào tạo thành lớp vỏ láng phủ mặt mũ cuống 1.2.2 Đặc điểm sinh sản Ganoderma lucidum Thể sinh sản dạng ống, dày từ 0,2 - l,7cm gắn ống nhỏ thẳng đứng, miệng tròn trắng - vàng ánh xanh, có đảm bào tử , hình trứng - trứng cụt Bào tử giá có vỏ với lớp cấu trúc hai lớp màng, màng ngồi nhẵn khơng màu, màng màu nâu gỉ sắt, phát triển thành gai nhọn vươn sát màng Đường kính - 6,5 X 8,5 - 11,5 cm [3] 1.2.3 Chu trình sống Ganoderma lucidum Các bào tử đảm đơn bội, điều kiện thuận lợi nảy mầm tạo hệ sợi sơ cấp (primary hyphase) Trong thực nghiệm tỷ lệ nảy mầm nhiệt độ 28 - 30°c thấp Hệ sợi sơ cấp đơn bội mau chóng phát triển, phối hợp với (plasmogamie) tạo hệ sợi thứ cấp (sợi song hạch dicargon hyphase) phát triển, phân nhánh mạnh, lan khắp giá thể Lúc này, thường có tượng hình thành bào tử vơ tính màng dày (gasterospores - Chlamydospores) Chúng dễ dàng rơi gặp điều kiện phù hợp nảy mầm cho hệ sợi song hạch tái sinh [2] Hệ sợi thứ cấp phát triển mạnh đạt tới giai đoạn cộng bào, tức vách ngăn (septum) hồ tan Tiếp giai đoạn sợi bện kết (mating) để chuẩn bị cho hình thành mầm mống thể Đây giai đoạn phân hóa hệ sợi Từ hệ sợi nguyên thuỷ phát triển thành sợi cứng (skeletal hyphase) màng dày, phân nhánh thành cấu trúc bó gắn chặt SỢI bện (binding) phân nhánh mạnh Từ phát triển thành mầm mống thể màu trắng mịn vươn dài đến trụ tròn mập Dần dần phần đính trục bắt đầu xoè thành tán, lúc lớp vỏ láng đỏ da cam dần xuất Tán lớn phát triển dần thành bào tầng (hvmenium) bắt đầu phát tán bào tử đảm liên tục nấm giàsẫm màu, khơ tóp lại lụi dần vòng - tháng 1.2.4 Các yếu tố sinh thái Gaiioderma lucidum Nấm Linh Chi mọc gốc, rễ sống đãchết, nhiều cày gỗ mọc rừng ăn quả, đặcbiệt Đậunhư lim xanh, lim vàng, phượng vĩ bị nấm xâm nhập Là loài phân bố rộng, điều kiện phát triển tốt nấm dạng sợi 28 - 30°c Quả thể gặp rộ vào mùa mưa từ tháng - 1 Nấm mọc tốt bóng rợp, có ánh sáng khuếch tán nhẹ Do có lớp vỏ bóng láng mà chịu nắng rọi chịu mưa liên tục Đối với hệ sợi nấm, nuôi cấy mơi trường dịch thể với nhiệt độ thích hợp từ 27 - 32°c, phát triển tốt pH từ - 8,5 Sau -2 ngày phần sợi già bắt đầu ngả vàng mầm thể dễ xuất [1] 1.2.5 Thành phần hoá dược đặc tính dược lý Ganoderma lucidum Với phương pháp thơng dụng, người ta phân tích hợp chất tự nhiên chủ yếu có Linh chi thường thấy Nước : 12 - 13 % Cellulose : 54 - 56 % Lignine : 13 - 14 % Hợp chất Nitơ : 1,6 - 2,1 % Lipit : 1,9 - 2% Hợp chất phenol 0,08 - 0,1% Hợp chất sterol toàn phần : 0,11 - 0,16% Saponin toàn phần : 0,3 -1,33 Akaloid glucosid tổng số : 1,82 - 3,06% Ngoài hợp chất nhóm lacton lên đến 2%, với số hợp chất khác [2] G iớ i thiệu sỏ tác dụng sinh y dược nám Linh chi Ganoderma lucidum 2.1 Tác dụng chữa bệnlỉ nấm Linh chi Ganoderma lucidiim Bên cạnh tác dụng loại thực phẩm chức nâng cho người lồi sinh vật khác, nấm loại thuốc hiệu để chữa bệnh khác Nấm thuốc có lịch sử lâu dài thuốc dàn gian Hiện có khoảng 200 lồi nấm biết đến có khả ức chế số bệnh khác Tuy khơng tìm hiểu trọng nhiều nước châu Âu châu Á, hàng nghìn năm Linh chi với vài lồi nấm khác ln đề cao, coi loài thảo dược quý Nhật Bản Trung Quốc, Linh chi coi vị thuốc đầy tiềm Trong tác phẩm thuốc cổ Trung Quốc Nhật Bản phân loại có lồi thuốc tốt siêu hạng, loại dược thảo có tác dụng dùng để phục hổi sinh lực tuổi xuân, kéo dài tuổi thọ, Linh chi coi số Còn loại nấm khác loại thuốc bổ dùng để chữa bệnh ốm đau bình thường Đã có nhiều nghiên cứu cho thấy hiệu nấm Linh chi điều trị bệnh như: chống lại tăng hàm lượng cholesterol, xơ vữa động mạch, tăng huyết áp, bệnh trĩ, sâu răng, nhiễm trùng răng, béo phì nhiều vấn đề nghiêm trọng khác Nấm Linh chi coi có ảnh hưởng tốt để điều trị trường hợp bị đột quỵ, bệnh liên quan đến não tuỷ, hẹp vành, nhồi máu tim, trường hợp viêm tĩnh mạch , bệnh nảy sinh tắc nghẽn động mạch Hơn có hiệu việc điều trị chứng viêm da điển hình, viêm phế quản, hen suyễn, viêm mũi dị ứng, viêm gan mãn tính Linh chi có tác dụng tăng cường khả miễn dịch thể, có khả chống ung thư Nó có ảnh hưởng tương tự với bệnh tiểu đường, chống lại q trình ơxi hố Đã có nhiều cơng trình nghiên cứu với mục đích để tách chiết, tinh số dẫn xuất hợp chất tự nhiên Linh chi có ứng dụng tốt phục vụ y dược học Các hợp chất tự nhiên có Linh chi chứng minh có khả chống phóng xạ, tia u v tác nhân gây đột biến việc ngăn cản hoạt động gốc tự có khả làm thương tổn đến ADN, nguyên nhân gây bất ổn di truyền [17] Qua bước đầu đánh giá dịch chiết nấm Linh chi nồng độ từ 0.5 - mg/ml có tác dụng kích thích sinh trưởng khơng gây độc tố có hại với vi khuẩn 4.2 Xúc định nồng độ NaNs gây chết vi khuẩn Khi làm thí nghiệm sử dụng NaN:, chất có tác dụng gây ức chế sinh trưởng vi khuẩn làm tác nhân gây chết ức chế sinh trưởng vi khuẩn Để chọn nồng độ gây ức chế thích hợp chúng tơi tiến hành nuôi cấy vi khuẩn với nồng độ NaN3 khác Kết thu nhận bảng Bảng 5: Xác định nồng độ NaN, ức chế với B subtilis \ [NaN,] T h i\(% ) gian \ Đối chứng 0.0125% 0.025% 0.05% 0.1% 0’ 0.010 0.010 0.010 0.010 0.010 60’ 0.045 0.039 0.038 0.039 0.036 120’ 0.106 0.078 0.059 0.048 0.040 180’ 0.416 0.269 0.132 0.079 0.053 210’ 0.613 0.429 0.176 0.092 0.057 Xem xét số liệu bảng cho thấy phát triển vi khuẩn nuôi nồng độ NaN3 khác từ 0.025% đến 0.05% so với lô đối chứng có tỷ lệ giảm sinh trưởng rõ rệt Để tiến hành làm thí nghiệm chúng tơi chọn nồng độ NaN3 0.1% để đạt tỷ lệ diệt khuẩn tốt 4.3 Đánh giá khả bảo vệ vi khuẩn dịch chiết nấm Linh chi Sau xác định nồng độ tối ưu dịch chiết nấm GAL sinh trưởng vi khuẩn 0.5% nồng độ NaN3 0.1% có khả ức chế mạnh vi khuẩn Chúng tơi tiến hành làm thí nghiệm để đánh giá khả bảo vệ vi khuẩn dịch chiết nấm GAL cách ni vi khuẩn lơ thí nghiệm có nồng độ NaN3 0.1% với nồng độ dịch chiết nấm GAL khác Kết thể bảng 21 Bảng : Đ ánh giá tác dụng bảo vệ vi khuẩn dịch chiếl nấ m G A L tác dụng gây ức chế sinh trưởng NaN, Số khuẩn lạc phục hồi % phục hồi Nồng độ chất NaN3(0.1%) NaN, + 0.5 mg/ml GAL NaN3+ mg/ml GAL NaN,+ mg/ml GAL NaN3+ mg/ml GAL B subtilis E coli 10 1800 103 1541 96.81 91 1030 51.27 36.56 86 1568 54.14 - 16 1242 42.85 27.23 B subtilis - E coli - - Tiến hành nuôi cấy vi khuẩn lơ đối chứng thí nghiệm theo nồng độ Sau ni cấy lại vi khuẩn đạt đến pha sinh trưởng thời gian 150’ - 180’ E coli 200’ - 240’ B subtilis Lấy 50|il vi khuẩn ống đem cấy trải đĩa petri, nuôi cấy qua đêm Rồi tiến hành đếm khuẩn lạc đĩa thí nghiệm đối chứng để đánh giá khả bảo vệ vi khuẩn dịch chiết nấm GAL Qua kết bảng cho thấy với nồng độ dịch chiết nấm GAL 0.5 mg/ml tác động làm cho B subtilis phục hồi lớn dịch chiết nồng độ lại khơng cho kết dương tính E coli Còn nồng độ dịch chiết nấm GAL mg/ml cho thấy tác dụng phục hồi B subtilis 51.27%, E coli 36.56% Nhìn chung với thí nghiệm cho phép đánh giá nồng độ dịch chiết nấm GAL thấp từ 0.5 - mg/ml ảnh hưởng gây độc tố với vi khuẩn, nồng độ mg/ml dịch chiết nấm Linh chi có khả bảo vệ tương đối tốt hai chủng vi khuẩn B subtilis E coli Đánh giá khả nâng chống peroxit hoá lipit gan chuột dịch chiết nấm GAL Với thí nghiệm dùng chuột nhắt trắng chủng để làm đối tượng thí nghiệm Chuột ni phòne thí nghiệm sau - ngày Tiến hành mổ chuột, lấy gan tươi làm mầu Chúng sử dụng dịch chiết nấm GAL hai nồng độ 50 mg/ml 100 mg/ml Kết xác định hàm lượng sản phẩm trình peroxit hố lipit (DAM) mẫu thí nghiệm đối chứng thể bảng Bảng : Xác định hàm lượng DAM hình thành (mol) Lơ Đối chứng Thí nghiệm Nồng độ GALT"'"-^ 50 mg/ml 0.096 0.37 100 mg/ml 0.08 0.72 Sau xác định sản phẩm q trình peroxit hố lipit (DAM) lơ đối chứng lổ thí nghiệm, chúng tơi đánh giá trình mạnh hay yếu, hoạt fính chống oxi hố dịch chiết nấm GAL đánh giá tỷ lộ % DAM giảm mẫu thí nghiệm so với mẫu đối chứng Kết thể bảng Bảng : Dịch chiết nấm GAL ảnh hưởng tới trình peroxit hoá lipit gan chuột Nồng độ GAL Hoạt tính chống peroxit hố lipit 50 mg/ml 100 mg/ml 74.1% 88.6% Kết cho thấy hoạt tính chống peroxit hoá lipit dịch chiết nấm GAL phụ thuộc đáng kể vào nồng độ khác dịch chiết í ; >1 % •* : V 23 THẢO LUẬN Qua kết thu được, làm thí nghiệm theo mục tiêu đề tài chúng tơi nhận thấy q trình ni cấy sinh trưởng nấm Linh chi Ganoderma lucidum có tốc độ mọc, phát triển bình thường So sánh với cơng bố Lê Xuân Thám Trịnh Tam Kiệt cho phép kết luận nấm Ganoderma lucidiim phân lập ni cấy bảo quản điều kiện phòng thí nghiệm tốt, khơng có dấu hiệu giống bị thối hố Q trình chiết rút cao nấm Ganoderma liicidum áp dụng theo phương pháp B Lakshmi cộng thu mẫu nấm Ganoderma lucỉdưm dùng làm mẫu thí nghiệm phục vụ cho mục đích khác đề tài Tuy nhiên khuôn khổ đề tài chúng tơi thực q trình chiết cao nấm Ganoderma lucidum cồn chưa có đủ điều kiện để chiết rút cao nấm theo phương pháp khác Đánh giá khả kháng viêm, kháng khuẩn nấm Ganoderma lưcỉdưm cho thấy dịch chiết nấm làm giảm triệu chứng sưng chân chuột bị gây viêm cấp DEAE-Dextran 5% Trong trình làm thí nghiệm chúng tơi chọn hai đường xử lý chuột với dịch chiết nấm GAL khác cho uống tiêm Với kết thu (78.5% 95.3%) bước đầu đánh giá mức độ kháng viêm liều cho uống liều cho tiêm có khác khơng đáng kể Bên cạnh có nhiều cơng trình nghiên cứu khác chứng minh chuột tổ chức mô hình thành mầm bệnh xử lý dịch chiết nấm GAL so sánh với đối chứng người ta thấy tế bào lympho lớp biểu mô da chuột giảm đáng kể Do chứng tỏ nấm Linh chi thực có tác dụng kháng viêm [6] Nhưng thí nghiệm, đề tài chúng tơi đánh giá hiệu kháng khuẩn, kháng viêm nấm GAL mức độ biểu hiện, chất trình chưa tìm hịểu.đến Về khả ức chế q trình peroxit hố lipit tiến hành với xem xét khả kháng viêm, kháng khuẩn Kết cho thấy khả ức chế peroxit hoá lipit nấm GAL tế bào gan chuột có tác dụng đáng kể Quá trình ức chế peroxit hố lipit phụ thuộc vào nồng độ dịch chiết nấm GAL Theo đánh giả tác B Lakshmi Shin-Duk Kim cho thấy dịch chiết nấm GAL làm hạn chế bót gốc tự hoạt động, khả loại gốc 24 dịch chiết nấm GAL lớn Trong thí nghiệm chúng tơi đánh giá khả ức chế q trình peroxit hố lipit hai nồng độ dịch chiết nấm GAL 5% 10% (74.1% 88.6%) Tỷ lệ ức chế lớn Mặt khác tác giả chứng minh polysaccharide-peptide dịch chiết nấm GAL có khả loại gốc tự Thông qua kết hoạt tính chống oxi hố nấm Ganoderma lucidum bước đầu chúng tơi nhận định dịch chiết thơ nấm GAL có hàm lượng polysaccharide-peptide cao Khả bảo vệ vi khuẩn trước tác nhân gây ức chế sinh trưởng nấm GAL cho thấy có kết tốt Khi chúng tơi sử dụng NaN3 làm chất gây ức chế sinh trưởng hai chủng vi sinh vật B subtilìs E coli Các thí nghiệm chúng tơi xác định nồng độ thích hợp dịch chiết nấm GAL có khả kích thích phát triển sinh trưởng vi sinh vật từ 0.5 - mg/ml Kết phù hợp với nghiên cứu công bố Với nồng độ mg/ml dịch chiết nấm GAL khơng gây độc tố phụ hai chủng vi khuẩn làm thí nghiệm Bên cạnh tác nhân gây ức chế sinh trưởng NaN3 xác định ngưỡng gây ức chế vi khuẩn 0.01% Kết làm thí nghiệm đánh giá khả phục hồi tế bào vi khuẩn cho thấy nồng độ dịch chiết nấm GAL 0.5 mg/ml khả phục hồi B subtilis lớn 98.87% với E coli cho kết khơng tốt Khi dùng dịch chiết nấm GAL nồng độ mg/ml mg/ml tỷ lệ phục hồi tế bào B subtilis E coli cho kết tốt Với khuôn khổ đề tài chúng tơi làm thí nghiệm với chất gây ức chế sinh trưởng NaN3 Ngồi có nhiều chất gây đột biến khác mà quan tâm đến Mong tiến hành thí nghiệm nghiên cứu khác nhằm đánh giá khả ảnh hưởng dịch chiết nấm GAL bảo vệ vi sinh vật trước tác nhân gây đột biến khác Qua kết thu từ đề tài cho phép bước đầu đánh giá khả sinh y dược nấm Linh chi Ganoderma lucidum nuôi trồng Việt Nam Đây kết nhằm khẳng định thêm chất thảo dược quý loại nấm 'a i ì ị' i■ ’' i ■■ 1\1\" 25 K Ế T LUẬN VÀ K I Ế N N G H Ị Kết luận - Q trình ni cấy thu sinh khối tách chiết cao nấm Linh chi Ganoderma lucỉdum dùng làm mẫu thí nghiệm chứng tỏ chủng nấm giữ nuôi trồng điều kiện phòng thí nghiệm tốt, khơng bị thoái hoá - Tỷ lệ kháng viêm, kháng khuẩn dịch chiết nấm GAL nồng độ 50 mg/ml 78%, nồng độ 100 mg/ml 87% nồng độ 200 mg/ml 95% So sánh hai cách sử dụng dịch chiết nấm GAL cho uống cho tiêm kết không sai khác đáng kể - Đối với trình sinh trưởng vi khuẩn nồng độ 0.5 - mg/ml dịch chiết nấm Linh chi không gây độc tố với vi khuẩn - Khả nãng phục hồi B subtilis nồng độ 0.5 mg/ml dịch chiết nấm Linh chi 98.87% nồng độ mg/ml khả phục hồi B subtilis E coli 51.27% 36.56% Khả phục hổi B sưbtilis tốt E coli - Khả chống peroxit hoá lipit dịch chiết nấm Linh chi hai nồng độ 50 mg/ml 100 mg/ml xác định 74.1% 88.6% Kiến nghị Đối tượng nghiên cứu loại nấm có tính dược liệu cao, gần nâng lên hàng biệt dược Cần tiến hành nghiên cứu nhiều phương pháp khác để có kết luận xác thêm khả sinh y dược loại nấm 26 TÀI LIỆU TH AM K H Ả O T i liệu tiếng V iệ t Chuyên san Nấm Linh Chi Ganodermataceae Denk - Bộ Y tế xuất 1995 Lê Xuân Thám - Nấm Linh Chi Dược Liệu quý Việt Nam, Nhà xuất mũi Cà Mau - 1996 Trịnh Tam Kiệt - Nấm lớn Việt Nam, Nhà xuất Khoa học kỹ thuật - Hà N ộ i, 1981 T i liệu tiếng A n h Ames BN Dietary carcinogens and anticarcinogens Oxygen radicals and degenerative diseases Science 1983;221:1256 B Lakshmi, T.A Ajith, Nayana Jose, K.K Janardhanan, Antimutangenic activity of methanolic extract of Ganoderma hicidum and its effect on hepatic damage caused by benzo[a]pyrene, 2006, Journal off Ethnopharmacology, 4200, No of Pages B Laksshimi, T A Ajith TA, N Sheena, Nidhi Gunapalan, and K K Janardhanan, Antiperoxidative, anti-inflamatory, and antimutangenic activities of ethanol extract of the mycelium of Ganoderma lucidum occuring in South India, 2003, Journal, 1:85-97 Berlett, B.S., Stadtman, E.R., Protein oxidation in aging, disease and oxidative stress, J Biol Chem., 1997, 272 (33), 20313 -20316 Bishayee s, Balasubramanian AS Assay of lipid peroxides formation J Neuro Chem 1979; 18:909 Camp ROR Prostaglandins, hydroxyfatty acids, leukotrienes, and inflammation of the skin Clin Exp Dermatol 1982;7:435 10 Cooke, M.S., Evans, M.D., Dizdaroghi, M., Lunec, J., Oxidative DNA damage: Mechanisms, mutation and disease, The Faseb J., 2003, 17, 11951214 11 Hikino, H., c Konno, Y Mirin, and T Hayashi Isolation and hypoglycemic 27 JOURNAL OF SCIENCE, Nat., Sci., & Tech., T.XXII, N03C AP, 2006 A L U A T I O N O F S E V E R A L B IO M E D IC A L C H A R A C T E R IS T IC S O F G A N O D E R M A L U C ID U M ( L E Y S S E X F R ) K A R T Ta Bich T huan F a c u lty o f B io lo g y, H a n o i U n iv e rsity o f S cien ce, V N U - H a n o i Tel: 0982568680, E m a il: thuantb@ vnu.edu un Ganoderma lucidum biomass to test several biomedical activities including anti-oxidant, anti-inflammatory and anti-mufigenic activities on mice and bacteria (Bacillus subtilis and Escherichia coli) Both routes of G lucidum intake (injection and oral route at 50-200 mg/ml) showed up fairly good anti-inflammatory effects of about 78%-95% on white mice Regarding to the antimutagenic effect, G lucidum extract at extremely low concentrations mg/ml could protect 95% B.subtilus viability from direct mutagen by NaN3 at the 0.1% lethal dose to micro-organisms The anti-oxidant activity of G lucidum via the inhibition on peroxidation of mouse lipid membrane was evaluated G lucidum at the concentration of 50 mg/ml and 100 mg/ml has the protective effect of 1.7% and 3.2%, respectively In conclusion, G lucidum extract has anti-oxidant, anti-inflammatory at 200 mg/ml concentrations while its anti-mutagenic activity obviously expresses even only at mg/ml Abstract We used the extract from In tro d u ctio n M u sh ro o m s represent la rg e ly u n tap p ie d reso u rces of p o w e r fu l new ir m a c e u t ic a l p r o d u c t s N a t u r a l p ro d u c ts a n d t h e i r a c tiv e p r in c i p le s a s s o u rc e s for v d r u g d isc o v e ry a n d t r e a t m e n t of d is e a s e s h a v e a t t r a c t e d a t t e n t i o n in r e c e n t y e a rs lu cid u m K a r s t is a w o o d - in h a b itin g m a c r o fu n g u s , c o m m o n ly k n o w n a s R e ish i In n e s e t r a d i t i o n a l m e d ic in e , f r u i t bodies of G a n o d erm a h a v e b e e n r e g a r d e d as n a c e a ” for a ll t y p e of d is e a s e s x id a tiv e d a m a g e to D N A , p r o te in , a n d , o th e r c ro m o lec u les b y r e a c ti v e oxygen species (ROS) is o n e of t h e m a jo r c o n tr i b u ti n g ;ors to a g in g a n d m a n y d e g e n e r a tiv e p ro c e s s e s s u c h a s c a n c e r , h e a r t d is e a s e s , a c ts [1] T h e p o l y n u c l e a r a r o m a tic h y d r o c a r b o n s (PA H ) i n food, p o l lu t e d a ir, a n d i r e t te s m o k e , etc., c o n t r i b u t e to t h e e x t e r n a l s o u rc e s of t h e fre e r a d ic a ls F re e ic a l- m e d ia te d o x i d a t io n of D N A b a s e s p r o d u c in g m u t a g e n i c le s io n s a r e k n o w n to t r i b u t e to i n i t i a t i o n , p ro m o tio n , a n d p ro g re s s io n c a rc in o g e n e s is [2 -7 ] H e n c e , th e lp o u n d s t h a t p o s s e s s a n tip e r o x id a tiv e , a n ti - i n f l a m m a t o r y , a n d a n t i m u t a g e n i c v itie s m a y b e of t h e r a p e u t i c v a lu e a g a i n s t v a r i o u s m u lt if a c t o r ia l d is o r d e rs ecially in c a n c e r I n t h is c o m m u n ic a t io n , o u r e a r lie r in v e s t ig a t io n s s h o w e d t h e a n ti- in f la m m a to r y , ip e ro x id a tiv e , a n d a n t i m u t a g e n i c a c tiv itie s of e th a n o l ic e x t r a c t of t h e m y c e liu m of u cid u m in V i e t n a m M aterials and m eth od s M a te r ia ls : White mice at 8-10 weeks, weighing 22 ± g were selected They e fed in environmentally controlled conditions with free access to standard food and er B su b tilis and E coli were obtained from M icrobiology D ep a rtm en t o f H anoi 164 E v a lu a tio n o f se v era l b io m e d ic a l c h a r a c te r is tic s 165 University o f Science The strains were inoculated in n u trien t broth, incubated overnight at 37°C, and then used for each antim utagenic assay Mohr Sodium, KC1, D E A E dextran, Thiobarbituric, Tricloacetic acid were purchased from Sigma Agar and sodium azide (NaN3) were purchased from Merk O ther chemicals and reagents were of analytical grade M ethods: Lipid peroxidation inhibiting activity of the extract was determined by the method of Ohkawa et al [3,4] Inhibition of lipid peroxidation was determ ined by m easuring the optical density of the samples when treated with various G lucidum concentrations with the ones without any treatm ent (control) Anti-inflammatory activity was determ ined by the method of Ajith,TA et al [5] A ntim utagenic activity was determ ined by the method of Ames [6] NaN3 was used as the factor causing direct m utagens R esu lts and d iscu sio n s A n t i- i n f la m m a ti o n activity: White mice weighing 22±2 g were divided into four groups of five anim als each The three groups were induced inflam mation by injecting 0.03 ml dextran 5% into mice paw Then they were further injected with G lucidum a t concentrations of 50, 100, and 200 mg/ml into mice legs The fourth group was not injected and used as control Finally, we m easured sizes of mice paw (ml) after certain tim e periods (1- 24h) Percentage of inhibition through injection and oral route intake of extract G lucidum were showed at table and figure Both routes of intakes gave very good results about the anti-inflammatory effect of G lucidum extract on white mice Concentrations a t 50, 100 and 200mg/ml of G lucidum expressed 78%, 87.5% and 95% anti-inflam m atory, respectively Table Anti-inflammatory effect of ethanol extract of G./uddum on inflamed paw edema of mice which are induced by 5% dextran Injection Initial control paw thickness (ml) Paw thickness after 5% dextran injection (ml) Paw thickness after 3h of G lucidum injection (ml) % Inhibition 50mg/ml 0.426 ± 0.02 0.526 ± 0.02 0.434 ± 0.02 78.4 100mg/ml 0.458 ± 0.0 0.496 ± 0.02 0.448 ± 0.02 89.5 200mg/ml 0.426 ± 0.02 0.514 ± 0.02 0.494 ± 0.02 95.3 Concentration of extract G.lucidum A n t i m u t a g e n i c activity: The ethanol extract of G.lucidum showed significant antim utagenic activity against both direct acting m utagens and m utagens th a t require activation We determ ined the lowest concentration of N aN th a t cause direct m utagens on B.subtilis and E.coli is 0.1% and used this concentration to kill bacteria The resu lt of revertant T a B ic h T huan 120 100 a0 80 rC 60 £ 40 89.5 9 78.4 78 •H hƯ H □ njection | H Oral route 20 50 mg/ml 100 mg/ml 200 mg/ml Concentration of G lucidum F ig t Comparison of anti-inflammation effect of G.lucidum extract Dnies is shown on table When testing the anti-m utangenic activity of G lucidum ract, we found th a t the extract even at very low concentration of mg/ml have the tective effect on 95% B.subtilis viability (Fig 2) However, the extract a t higher concentration, mg/ml, m aintained only 30% ubtilis viability, indicating th a t the high concentration of extract may be toxic to the wth of bacteria When testing on E.coli, the anti-m utangenic activity of G lucidum ract was not clear compared to th a t on the B.subtilus Table Antimutagenic activity of ethanol extract of G.lucidum against sodium azide (NaN3) Concentration (mg/ml) Average number of revertant colonies/plate % Inhibition B.subtilis E.coli B.subtilis E.coli NaN3 (0.1) 10 1800 - - NaN3 + Gal (0.05) 103 1541 96.87 - NaNj + Gal (0.1) 91 1030 51.27 36.56 NaN3 + Gal (0.2) 86 1568 57.14 - NaN3 + Gal (0.5) 16 1242 42.85 27.23 Abbreviations: (-) negative A n tip e r o x id a tiv e a c tiv ity : Ethanol extract of G lucidum significantly inhibited in-vitro lipid peroxidation induced by Fe2+ in t liver The extracts at :entrations of 50 mg/ml and 100 mg/ml have the protective effect of 1.7% and dmal 3.2% (data not shown) E v a lu a tio n o f several b io m é d ic a l c h a r a c te r istic s 167 Tim e D 50 ■ 80 01 110 □ 130 □1 control % 150 % C o n c e n tra tio n o f G lu c id u m Fig2 Effect of the ethanol extract of G lucidumon the growth of bacteria In conclusion, the results of the present study indicate th a t the G.lucidum extract inhibits inflammation, mutations by mutagen and lipid peroxidation in a concentration-dependent manner Especially, anti-m utagenic activity expresses at extremely low concentration of mg/ml With above results, G.lucidum extract can be used as potential m aterial to protect living creatures against oxidants, removing free radicals in the micro-organism development G.lucidum will be regarded as a useful pharm aceutical source of nowaday biology REFERENCES [1] Ames BN., Dietary carcinogens and anticarcinogens, Oxygen radicals and degenerative diseases, Science ; 221(1983)1256-1264 [2] Jones S, Janardhanan KK, Antioxidant and antitumor activity of Ganoderma lucidum (Curt: Fr.) P Karst.-Reishi (Aphyllophoromycetideae) from South India I n t J M ed M ushr; 2(2000),ppl95-200 [3] Ohkawa H, Ohishi W, Yagi K, Assay for peroxides in animal tissues by thiobarbituric acid reaction, A n n a l B iochem \ 95(1979), pp351-358 [4] Bishayee S, Balasubramanian AS., Assay of lipid peroxides formation, J N euro Chem \ 18(1979), pp 909-913 [5] Ajith TA, Fanardhanan KK., Antioxidant and anti-inflammatory activities of methanolextract of Phellinus rimuss In d J E xp B io l ; 39(2001), pp 1166-1169 [6] Marol DM, Ames BN., Revised methods for the salmonella mutagenecity trst M u ta t R e s ; 113(1983), ppl73-215 [7] Camp ROR., Prostaglandins, hydroxyfatty acids, leukotrienes, and inflammation of the skin Clin E xp D e rm a to l'J(1982), pp435-444 Ta B ich Thuan p CHl KHOA HỌC ĐHQGHN, KHTN & CN, T.XX1I, số 3C PT., 2006 )ÁNH G IÁ M ỘT SỐ TÍNH CHAT SIN H Y HỌC CỦA NAM LIN H CHI G A N O D E R M A L U C ID U M (LEYSS EX FR ) KART T B íc h T h u ận Khoa Sinh học, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội Tel: 0982568680, Email: thuantb@vnu.edu.vn Trong nghiên cứu gần sử dựng dịch chiết từ sinh khơi ím Linh chi ni trồng Việt Nam để thử hoạt tính chơng viêm nhiễm L tác nhân gây đột biến, chổng lipit hóa đối tượng động vật vi sinh vật lác Đánh giá tác dụng chông viêm thực nghiệm, chúng tơi dùng dịch chiết ím làm thc tiêm uông đối tượng chuột nhắt trắng chủng (m-22±2 con) kết tỷ lệ chông viêm mẫu nấm 50 mg/ml 78%, mẫu nấm 100 g/ml có tỷ lệ 87%, mẫu 200 mg/ml có tỷ lệ 95% So sánh khả dùng dịch ìiết nấm để tiêm uống cho thấy sử dụng dịch chiết nấm nồng độ 200 mg/ml có ệu chông viêm triệt để ĐỒI với tác dụng chông đột biến, chọn subtilis, E.coli làm đốì tượng nghiên cứu Dùng NaN3 0.1% làm chất gây đột biến trực ấp, xác định nồng độ dịch chiết nấm từ 5-50 mg/ml không gây độc tô" với vi khuẩn, âc định tỷ lệ ức chế gây đột biến dịch chiết nấm vói vi khuẩn 30-95%.Kết *hiên cứu tính chơng oxi hóa thơng qua đánh giá ảnh hưỏng dịch chiết nấm inh chi lên q trình peroxit hóa lipit màng tế bào gan chuột cho thấy sử dụng ch chiết nấm nồng độ 50 mg/ml 1.7% sử dụng dịch chiết nấm nồng độ )0 mg/ml 3.2% Với kết nghiên cứu cho thấy dịch chiết nấm Linh chi có khả lơng q trình oxi hóa phân hủy gốc tự do, có khả chơng viêm nhiễm ìy đột biến Đây đánh nguồn dược liệu có ích sinh y dược iiLy ệ n P H I Ế U ĐẢ NG KÝ K Ế T QU Ả N G H I Ê N c ứ u K H - C N Tên để tài: Đánh giá số tính chất sinh y học Nấm Linh chi Ganoderma lucidum Mã số: QT-06-25 C quan chủ trì đề tài: Trường Đại học Khoa học Tự nhiên Đ ịa chỉ: 334 Nguyễn Trãi Thanh Xuân Hà Nội Tel: 8584287 Cơ quan quản lý đề tài: Khoa Sinh học Đ ịa chỉ: 334 Nguyễn Trãi, Thanh Xuân, Hà Nội Tel: 8584734 Tổng kinh phí thực chi: Trong đó: - Từ ngân sách nhà nước: khơng - Kinh phí trường: 20.000.000 VNĐ - Vay tín dụng: khơng -V ốn tự có: khơng - Thu hồi: khơng T h i gian nghiên cứu: Năm Thời gian bắt đầu: 3/2006 Thời gian kết thúc: 12/2006 Tên cán phối hợp nghiên cứu: Ths Nguyễn Quang Huy CN Nguyên Thị Thanh Hương Số đăng ký đề tài: Số chứng nhận đăng ký Bảo mật: Ngày: kết nghiên cứu: a Phổ biến rộng rãi: b Phổ biến hạn chế: c Bảo mật: Tóm tắt kết nghiên cứu: - Nuôi trồng thu sinh khối nấm Ganoderma liiciclum - Tách chiết cao nấm Ganoderma lưcidum từ sinh khối - Đánh giá khả chống viêm thực nghiệm chuột nhắt trắng cho uống tiêm dịch chiết nấm Ganoderma lucidum - Đánh giá khả nãng bảo vệ vi sinh vật nấm Ganoderma lucidum sử dụng NaN} chất ức chế sinh trưởng - Đánh giá khả bảo vệ peroxit hoá lipit màng tế bào gan chuột dịch chiết nấm Ganoderma lucidum K iế n nghị quy mô đối tượng áp dụng nghiên cứu: Đối tượng nghiên cứu loại nấm có tính dược liệu cao, gần nâng lên hàng biệt dược Yêu cầu nghiên cứu sâu thành phần hợp chất tự nhiên nấm Linh chi (tinh sạch, tinh chế) để sản xuất thành chế phẩm dược liệu có hiệu chữa bệnh cao C hủ nhiệm đề Thủ trưởng C hủ tịch H ộ i Thủ trưởng tài quan chủ trì đồng đánh giá quan quản lý đề tài thức đề tài Họ tên Học hàm học vị Ký tên Đóng dấu TL.G AM F)OC ... thiệu nấm L in h chi Ganoderma lucidum 1.1 Vị trí nấm Linh chi hệ thống phản loại 1.2 Đặc điểm sinh học nấm Linh chi Ganoderma lucidum Giới thiệu sô tác dụng sinh y dược nấm Linh chi Ganoderma lucidum. .. a Tên đề tài: Đánh giá số tính chất sinh y học nấm Linh chi Ganoderma lucidum QT-06-25 M ã số: b Chủ trì đề tài: Ths Tạ Bích Thuận c Các cán tham gia: Ths Nguyễn Quang Huy CN Nguyễn Thi Thanh... bệnh nấm Linh chi Ganoderma lucidum 2.2 Tác dụng chống oxi hoá củ a nấm Linh chi Ganoderma lucidum 2.3 Khả kháng sinh, kháng viêm nấm Linh chi Ganoderma lucidum 2.4Khả chống tác nhản g y đột