Nghiên cứu đặc điểm lâm sàng, hình ảnh nội soi, mô bệnh học và sự biểu lộ dấu ấn miễn dịch p53, ki67, BRAF v600e của polyp đại trực tràng

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y DƯỢC ĐOÀN ANH THẮNG NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM LÂM SÀNG, HÌNH ẢNH NỘI SOI, MÔ BỆNH HỌC VÀ SỰ BIỂU LỘ DẤU ẤN MIỄN DỊCH P53,

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN

TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y DƯỢC

ĐOÀN ANH THẮNG

NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM LÂM SÀNG, HÌNH ẢNH NỘI SOI, MÔ BỆNH HỌC VÀ SỰ BIỂU LỘ DẤU ẤN MIỄN DỊCH P53, Ki67, BRAF V600E CỦA POLYP

ĐẠI TRỰC TRÀNG

LUẬN ÁN TIẾN SĨ Y HỌC

Thái Nguyên - 2020

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN

TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y DƯỢC

ĐOÀN ANH THẮNG

NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM LÂM SÀNG, HÌNH ẢNH NỘI SOI, MÔ BỆNH HỌC VÀ SỰ BIỂU LỘ DẤU ẤN MIỄN DỊCH P53, Ki67, BRAF V600E CỦA POLYP

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi Các số liệu, kết quả nghiên cứu được trình bày trong luận án là trung thực và chưa từng được công bố trong bất kỳ công trình nào khác

Thái Nguyên, tháng 01 năm 2020

Đoàn Anh Thắng

LỜI CẢM ƠN

Để hoàn thành luận văn này, tôi đã nhận được rất nhiều sự giúp đỡ của các thầy cô, đồng nghiệp, bạn bè và những người thân yêu trong gia đình

Tôi xin trân trọng cảm ơn

Ban Giám hiệu, Phòng Đào tạo sau Đại học, Trường Đại học Y Dược Thái Nguyên, đã tận tình giúp đỡ, tạo điều kiện cho tôi trong suốt quá trình học tập và nghiên cứu

Tôi xin trân trọng cảm ơn Ban giám đốc, tập thể cán bộ khoa Khám bệnh Bệnh viện Trường Đại học Y khoa Thái Nguyên, Bộ môn, khoa Giải phẫu bệnh, Bệnh viện Trường Đại học Y Hà Nội đã tạo điều kiện giúp đỡ tôi trong suốt quá trình học tập và hoàn thành luận văn

Tôi xin trân trọng cảm ơn Thầy PGS.TS Nguyễn Trọng Hiếu, PGS.TS Trần Đức Quý đã tận tình, tâm huyết hướng dẫn tôi thực hiện luận văn này

Tôi xin trân trọng cảm ơn các thầy cô giáo của Bộ môn Nội - Trường Đại học Y Dược Thái Nguyên đã truyền đạt cho tôi những kiến thức về chuyên môn

và nghiên cứu khoa học

Tôi cũng xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành đến các Thầy, Cô trong Hội đồng khoa học đã đóng góp nhiều ý kiến quý báu cho luận văn

Cuối cùng, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới: Gia đình, người vợ PGS.TS Lưu Thị Bình đã luôn sát cánh, giúp đỡ và động viên tôi trong suốt quá trình học tập, nghiên cứu

Tác giả

Đoàn Anh Thắng

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT

Gen BRAF

Kháng nguyên ung thư bào thai

CS

CDK

DNA

Cộng sự Cyclin dependent kinase Deoxyribose Acid Nucleic

Gen NRAS

Kháng nguyên nhân tế bào tăng sinh

MỤC LỤC

ĐẶT VẤN ĐỀ 1

Chương 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

1.1 Đại cương về polyp đại trực tràng 3

1.1.1 Khái niệm 3

1.1.2 Dịch tễ học 3

1.1.3 Sơ lược về giải phẫu - mô học của đại trực tràng 4

1.1.4 Chẩn đoán 6

1.2 Đặc điểm lâm sàng và một số yếu tố nguy cơ của polyp đại trực tràng 7

1.2.1 Đặc điểm lâm sàng 7

1.2.2 Một số yếu tố nguy cơ của polyp đại trực tràng 8

1.3 Đặc điểm hình ảnh đại thể và mô bệnh học của polyp đại trực tràng 10

1.3.1 Phân loại polyp đại trực tràng trên hình ảnh nội soi 10

1.3.2 Mô bệnh học polyp đại trực tràng 12

1.4 Hóa mô miễn dịch 14

1.4.1 Lịch sử phát triển 14

1.4.2 Nguyên lý của HMMD 15

1.4.3 Ứng dụng của hóa mô miễn dịch trong chẩn đoán 16

1.5 Ứng dụng của hóa mô miễn dịch xét nghiệm P53, Ki67 và BRAF 19

1.5.1 P53 19

1.5.2 Ki67 24

1.5.3 BRAF 26

1.6 Các phương pháp cắt polyp đại trực tràng 29

1.7 Các nghiên cứu về hóa mô miễn dịch polyp đại trực tràng 32

1.7.1 Trên thế giới 33

1.7.2 Tại Việt Nam 35

Chương 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 36

2.1 Đối tượng nghiên cứu 36

2.1.1 Tiêu chuẩn chọn bệnh nhân nghiên cứu 36

2.1.2 Tiêu chuẩn loại trừ 36

2.2 Phương pháp nghiên cứu 36

2.2.1 Thiết kế nghiên cứu 36

2.2.2 Địa điểm và thời gian nghiên cứu 37

2.3 Chỉ tiêu nghiên cứu 37

2.3.1 Chỉ tiêu lâm sàng 37

2.3.2 Chỉ tiêu về nội soi, mô bệnh học và hóa mô miễn dịch 39

2.3.3 Chỉ tiêu về mối liên quan giữa sự biểu lộ của BRAF, P53, Ki67 với một số đặc điểm 40

2.4 Nội dung nghiên cứu 40

2.4.1 Kỹ thuật thu thập số liệu 40

2.4.2 Cách tiến hành một trường hợp nội soi nghiên cứu 41

2.4.3 Xét nghiệm mô bệnh học 43

2.4.4 Xét nghiệm hóa mô miễn dịch 45

2.5 Phương tiện nghiên cứu 48

2.5.1 Bộ dụng cụ dùng trong nội soi 48

2.5.2 Nguồn cắt đốt cao tần và thòng lọng điện 49

2.6 Xử lý số liệu 50

2.7 Đạo đức trong nghiên cứu 50

Chương 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 52

3.1 Đặc điểm lâm sàng, hình ảnh nội soi, mô bệnh học và các dấu ấn miễn dịch của đối tượng nghiên cứu 52

3.1.1 Một số đặc điểm chung 52

3.1.2 Đặc điểm lâm sàng của đối tượng nghiên cứu 54

3.1.3 Hình ảnh nội soi toàn bộ đại tràng 56

3.1.4 Đặc điểm mô bệnh học các polyp của đối tượng nghiên cứu 58

3.1.5 Đặc điểm biểu lộ dấu ấn miễn dịch BRAF, P53, Ki67 ở các polyp đại trực tràng của đối tượng nghiên cứu 61

3.2 Mối liên quan giữa đặc điểm lâm sàng, hình ảnh nội soi, mô bệnh học với các dấu ấn miễn dịch ở bệnh nhân polyp đại trực tràng 62

3.2.1 Mối liên quan giữa lâm sàng và biểu lộ các dấu ấn miễn dịch 62

3.2.2 Mối liên quan giữa hình ảnh nội soi và biểu lộ các dấu ấn hóa mô miễn dịch 68

3.2.3 Mối liên quan giữa đặc điểm mô bệnh học và biểu lộ các dấu ấn hóa mô miễn dịch 71

Chương 4: BÀN LUẬN 79

4.1 Đặc điểm lâm sàng, hình ảnh nội soi, mô bệnh học và các dấu ấn miễn dịch P53, Ki67, BRAF của đối tượng nghiên cứu 79

4.1.1 Đặc điểm lâm sàng 79

4.1.2 Đặc điểm nội soi 84

4.1.3 Đặc điểm mô bệnh học 89

4.1.4 Đặc điểm các dấu ấn hóa mô miễn dịch 92

4.2 Mối liên quan giữa đặc điểm lâm sàng, hình ảnh nội soi, mô bệnh học và các dấu ấn HMMD ở đối tượng nghiên cứu 98

4.2.1 Liên quan giữa đặc điểm lâm sàng với các dấu ấn HMMD 98

4.2.2 Liên quan giữa hình ảnh nội soi với các dấu ấn miễn dịch 101

4.2.3 Liên quan giữa mô bệnh học với các dấu ấn hóa mô miễn dịch 103

KẾT LUẬN 111

TÀI LIỆU THAM KHẢO

DANH MỤC BẢNG

Bảng 3.1 Một số đặc điểm nhân khẩu học 52

Bảng 3.2 Tiền sử gia đình, bản thân 53

Bảng 3.3 Thói quen ăn uống, sinh hoạt của bản thân 53

Bảng 3.4 Đặc điểm lâm sàng bệnh nhân polyp đại trực tràng 54

Bảng 3.5 Vị trí polyp được cắt qua nội soi 56

Bảng 3.6 Hình dạng các polyp được cắt qua nội soi 56

Bảng 3.7 Kích thước các polyp được cắt qua nội soi 57

Bảng 3.8 Số lượng polyp được quan sát qua nội soi 57

Bảng 3.9 Đặc điểm bề mặt các polyp được cắt qua nội soi 58

Bảng 3.10 Đặc điểm mô bệnh học polyp u tuyến 59

Bảng 3.11 Đặc điểm mô bệnh học polyp dạng răng cưa 59

Bảng 3.12 Đặc điểm mô bệnh học polyp dạng u mô thừa 60

Bảng 3.13 Biểu lộ BRAF, P53, Ki67 ở các polyp đại trực tràng 61

Bảng 3.14 Mức độ biểu lộ các dấu ấn miễn dịch P53, Ki67 và BRAF 61

Bảng 3.15 Đặc điểm tổ hợp biểu lộ bộ 3 dấu ấn miễn dịch ở các polyp 62

Bảng 3.16 Liên quan giữa đặc điểm nhân khẩu học với biểu lộ P53 62

Bảng 3.17 Liên quan giữa đặc điểm nhân khẩu với biểu lộ Ki67 63

Bảng 3.18 Liên quan giữa đặc điểm nhân khẩu với biểu lộ BRAF 64

Bảng 3.19 Liên quan giữa đặc điểm lâm sàng với biểu lộ P53 65

Bảng 3.20 Liên quan giữa đặc điểm lâm sàng với biểu lộ Ki67 66

Bảng 3.21 Liên quan giữa đặc điểm lâm sàng với biểu lộ BRAF 67

Bảng 3.22 Liên quan giữa biểu lộ BRAF và đặc điểm hình ảnh nội soi 68

Bảng 3.23 Liên quan giữa biểu lộ P53 và đặc điểm hình ảnh nội soi 69

Bảng 3.24 Liên quan giữa biểu lộ Ki67 và đặc điểm hình ảnh nội soi 70

Bảng 3.25 Biểu lộ các dấu ấn BRAF, P53, Ki67 tại vùng có loạn sản và

không loạn sản 71

Bảng 3.26 So sánh mức độ phát hiện biểu lộ miễn dịch (dương tính) tại vùng loạn sản và không loạn sản 72

Bảng 3.27 So sánh mức độ biểu lộ dấu ấn hóa mô miễn dịch tại vùng loạn sản và không loạn sản 73

Bảng 3.28 Liên quan giữa biểu lộ BRAF và polyp có tổn thương răng cưa 74

Bảng 3.29 Liên quan giữa biểu lộ BRAF tại vùng loạn sản và không loạn sản với phân loại tổn thương polyp dạng răng cưa 74

Bảng 3.30 Liên quan giữa biểu lộ BRAF và đặc điểm mô bệnh học 75

Bảng 3.31 Liên quan giữa biểu lộ miễn dịch P53 và đặc điểm mô bệnh học 76

Bảng 3.32 Liên quan giữa biểu lộ miễn dịch Ki67 và đặc điểm mô bệnh học 77

Bảng 3.33 Liên quan giữa biểu lộ các dấu ấn BRAF, P53, Ki67 và tình trạng viêm phát hiện trên mô bệnh học 78

Bảng 4.1 Tỷ lệ polyp đại trực tràng qua một số nghiên cứu 85

Bảng 4.2 Hình dạng polyp đại trực tràng qua một số nghiên cứu 86

Bảng 4.3 Kích thước polyp đại trực tràng qua một số nghiên cứu 87

DANH MỤC BIỂU ĐỒ

DANH MỤC HÌNH

Hình 1.1 Hình thể ngoài của đại trực tràng 4

Hình 1.2 Polyp dạng dẹt 10

Hình 1.3 Polyp không cuống 10

Hình 1.4 Polyp có cuống 11

Hình 1.5 Polyp nửa cuống 11

Hình 1.6 Hình dạng polyp 11

Hình 1.7 Cơ chế điều hòa P53 21

Hình 1.8 Sơ đồ kiểm soát chết tế bào theo chương trình 22

Hình 1.9 Đột biến BRAF 27

Hình 1.10 Sơ đồ điều hòa việc chuyển tín hiệu protein kinase 28

1

ĐẶT VẤN ĐỀ

Polyp đại trực tràng (PLĐTT) là một dạng u lồi vào trong lòng đại trực tràng, có cuống hoặc không cuống, do niêm mạc đại trực tràng và tổ chức đệm dưới niêm mạc tăng sinh quá mức tạo thành Các nghiên cứu về PLĐTT cho thấy tần suất mắc bệnh trong cộng đồng dao động từ 30-50% tùy theo tính chất

và quy mô của các cuộc điều tra [111] Bệnh PLĐTT cũng như ung thư ĐTT

có tỷ lệ mắc cao ở các nước phương Tây (Úc, Newzeland, châu Âu và Bắc Mỹ), thấp hơn ở các quốc gia châu Phi và Nam Trung Á [111], [ 129]

Nhiều nghiên cứu đã chứng minh rằng: PLĐTT là yếu tố nguy cơ gây ung thư đại trực tràng (UTĐTT) Đặc biệt polyp u tuyến đã được khẳng định

là tổn thương báo trước của hầu hết UTĐTT [58]

Theo nghiên cứu của Võ Hồng Minh Công (2015) cho biết: nguy cơ hình thành UTĐTT có liên quan chặt chẽ với kích thước polyp [5] Do vậy, nội soi đại trực tràng (ĐTT) để phát hiện sớm và cắt polyp qua nội soi đóng vai trò quan trọng Kỹ thuật nội soi đại tràng toàn bộ bằng ống mềm giúp chẩn đoán xác định PLĐTT, qua nội soi thầy thuốc có thể quan sát trực tiếp bề mặt của ĐTT, cho phép xác định hình thái, vị trí, tính chất, mức độ tổn thương của ống tiêu hóa nói chung và của PLĐTT nói riêng

Cùng với sự tiến bộ của y học hiện đại, việc phát hiện ra các gen thay đổi giúp chẩn đoán sớm một số các bệnh ung thư (UT) nói chung và UTĐTT nói riêng bằng kỹ thuật sinh học phân tử và hóa mô miễn dịch (HMMD) đã có những đóng góp đáng kể vào thực tiễn điều trị Nhiều nghiên cứu cho thấy bệnh nhân có u tuyến/PLĐTT khi lấy bệnh phẩm để làm mô bệnh học (MBH) thông thường cho kết quả lành tính, nhưng với kỹ thuật HMMD đã phát hiện được những thay đổi quan trọng khi bộc lộ được các dấu ấn miễn dịch là những marker có giá trị chẩn đoán sớm UT Biểu lộ Ki67 và P53 liên quan một

2

cách có ý nghĩa với kích thước và mức độ loạn sản trong u tuyến đại tràng Đa

số polyp tăng sản và u tuyến dạng răng cưa có P53(+), Ki67(+) [113] Đặc biệt trong một số nghiên cứu mới công bố gần đây, dấu ấn BRAF (biểu lộ gen BRAF V600E) được phát hiện ở một số bệnh/tổn thương lành tính được coi là tổn thương báo trước sự ác tính như u tuyến/polyp răng cưa của ĐTT, biểu lộ BRAF V600E như một điều kiện khởi đầu cần thiết cho sự chuyển dạng từ tổn thương lành tính sang ác tính hoặc từ độ ác tính thấp sang độ ác tính cao hơn, rất có giá trị theo dõi, tiên lượng các tổn thương ĐTT [36], [70]

Tại Việt Nam, đã có một số nghiên cứu về các dấu ấn HMMD trong PLĐTT và UTĐTT [7], [8], [9], [18], [22], các công bố này đều đã khẳng định tính ưu việt của các dấu ấn miễn dịch Tuy nhiên, HMMD phối hợp đồng thời các dấu ấn P53, Ki67, BRAF V600E chưa được tác giả nào đặt vấn đề nghiên cứu, đặc biệt rất ít chủ đề về PLĐTT (một trong những yếu tố nguy cơ UTĐTT) Xuất phát từ nhu cầu thực tế trong việc theo dõi, tiên lượng các PLĐTT,

chúng tôi tiến hành đề tài “Nghiên cứu đặc điểm lâm sàng, hình ảnh nội

soi, mô bệnh học và sự biểu lộ dấu ấn miễn dịch P53, Ki67, BRAF V600E của polyp đại trực tràng” với mục tiêu:

1 Mô tả đặc điểm lâm sàng, hình ảnh nội soi, mô bệnh học và các dấu ấn P53, Ki67, BRAF V600E ở bệnh nhân polyp đại trực tràng được cắt qua nội soi tại Bệnh viện Trường Đại học Y khoa Thái Nguyên

2 Phân tích mối liên quan giữa đặc điểm lâm sàng, hình ảnh nội soi, mô bệnh học với các dấu ấn P53, Ki67, BRAF V600E ở bệnh nhân polyp đại trực tràng được cắt qua nội soi

3

Chương 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Đại cương về polyp đại trực tràng

1.1.1 Khái niệm

Polyp là một thuật ngữ bắt nguồn từ từ “polypous” trong tiếng Hy Lạp,

có nghĩa là khối bệnh giả u Nói chung, thuật ngữ này mô tả bất kỳ một khối nào đó nhô vào trong lòng rỗng Khối u được hình thành do sự tăng sinh quá mức của niêm mạc đại trực tràng, bề mặt polyp có lớp niêm mạc đại tràng che phủ Trên thực tế, có nhiều khối u nhìn bề ngoài rất giống polyp nhưng không phải polyp ví như u cơ, u mỡ polyp là một thuật ngữ chung, không đặc hiệu cho bất cứ khối u nào nằm lồi trên bề mặt ĐTT [111]

Polyp ĐTT có thể được phân loại theo mô học là khối tân sinh (neoplastic), quá sản (hyperplastic), dạng u máu (hamartomatous) hoặc viêm Các polyp tân sinh quan trọng nhất vì chúng có khả năng thành ác tính Do

đó, rất quan trọng để xác định các polyp này ở giai đoạn đủ sớm, lúc đó một thủ thuật đơn giản để loại bỏ chúng để phòng ngừa ung thư hóa [128]

Cấu tạo chung của polyp kinh điển gồm trục liên kết - mạch máu được phủ bởi niêm mạc tuyến tăng sản, các tuyến dài ra, tế bào tuyến thường biệt hóa, nhân các tế bào bình thường Khi các polyp thoái triển, loạn sản thì các tuyến bắt màu kiềm hơn, có nhiều tế bào không biệt hóa, nhân tế bào to không đồng đều, có nhiều nhân chia nhưng cơ niêm còn nguyên vẹn, khác hẳn với polyp bị UT hóa Trong trường hợp UT hóa, màng đáy của biểu mô bị phá vỡ, nhân các tế bào biểu mô bất thường với mức độ không điển hình khác nhau [123], [128]

1.1.2 Dịch tễ học

Các nghiên cứu khác nhau báo cáo tỷ lệ hiện mắc khác nhau của PLĐTT dao động từ 30-50% [111], [123] Tỷ lệ hiện mắc của polyp có liên quan mật

1.1.3 Sơ lược về giải phẫu - mô học của đại trực tràng

1.1.3.1 Giải phẫu liên quan đến nội soi

Hình 1.1 Hình thể ngoài của đại trực tràng[134]

Đại trực tràng (ĐTT) còn gọi là kết tràng hay ruột già là phần cuối của ống tiêu hóa, nối từ góc hồi manh tràng đến hậu môn ĐTT sắp xếp gần như hình một cái khung gọi là khung đại tràng (ĐT) Toàn bộ khung ĐT có dạng hình chữ U ngược, được chia thành 6 đoạn: manh tràng, đại tràng lên, đại tràng ngang, đại tràng xuống, đại tràng sigma, trực tràng và ống hậu môn Ở người Việt Nam, ĐTT có độ dài trung bình khoảng 148,2 cm Có ba chỗ gấp

5

khúc là: đại tràng góc gan, đại tràng góc lách và đại tràng sigma, những vị trí này thường khó khăn trong việc đưa đèn soi đi qua Trên bề mặt đại tràng có

ba dải cơ dọc, các bướu đại tràng, các bờm mạc nối [134]

1.1.3.2 Cấu tạo mô học của đại trực tràng

Thành của ĐTT đựơc cấu tạo bởi 4 lớp, từ ngoài vào trong gồm có [134]:

bề mặt của đại tràng có thể quan sát rất rõ bằng nội soi ống mềm

- Lớp đệm: nằm dưới lớp biểu mô phủ, lớp này được tạo thành bởi các

mô liên kết có nhiều tương bào và lympho bào Những nang lympho nhiều khi vượt quá lớp cơ niêm xuống lớp dưới niêm mạc Trong lớp đệm còn chứa

6

các tuyến Lieberkuhn, đó là tuyến ống đơn thẳng ít khi phân đôi, thành ống tuyến là biểu mô trụ đơn gồm có các loại tế bào: tế bào mâm khía, tế bào hình đài, tế bào ưa crom và ưa bạc

- Lớp cơ niêm: được tạo thành bởi những bó cơ trơn vòng và cơ trơn dọc

1.1.4 Chẩn đoán

*Thăm khám lâm sàng

Hỏi tiền sử:

- Tiền sử gia đình:

+ Tiền sử gia đình có người bị PLĐTT hoặc UTĐTT là những thông tin

có giá trị định hướng gợi ý cho chẩn đoán

+ Trong bệnh polyp gia đình yếu tố di truyền thể hiện rất rõ: tần số di truyền bệnh cho con ở các gia đình này đến 50% [39], [73]

- Tiền sử bản thân: ngoài các triệu chứng lâm sàng hiện tại, bệnh nhân có thể

có một số dấu hiệu trong tiền sử như đi ngoài phân lẫn máu, rối loạn tiêu hóa, đau bụng không rõ nguyên nhân…

* Chẩn đoán bằng nội soi

Đây là phương pháp thăm khám để chẩn đoán u ĐTT và PLĐTT rất tốt, qua nội soi còn có thể làm được các thủ thuật như cắt polyp (Polypectomy), cắt khối u dưới niêm mạc (Mucosectomy) và sinh thiết để làm MBH Trong nội soi ĐTT ngoài phương pháp nội soi thông thường còn có nhiều phương pháp được ứng dụng như: nội soi ĐTT có nhuộm màu, nội soi với dải tần ánh sáng hẹp (Narrow Binding Imaging -NBI), ứng dụng công nghệ Laser (confocal endomicroscopy - CEM) tất cả đều có chung mục đích là chẩn đoán được sớm

và chính xác tổn thương [10], [11], [62]

7

1.2 Đặc điểm lâm sàng và một số yếu tố nguy cơ của polyp đại trực tràng

1.2.1 Đặc điểm lâm sàng

* Triệu chứng lâm sàng

- Đau bụng: dấu hiệu này xuất hiện không thường xuyên và với các mức

độ rất khác nhau tùy thuộc vào từng bệnh nhân, có thể gặp đau bụng mơ hồ không rõ vị trí, đau bụng âm ỉ, đau quặn, thậm chí có tác giả còn phát hiện được trường hợp polyp quá lớn gây triệu chứng bán tắc và tắc ruột và khi đó

có biểu hiện đau điển hình của cơn đau bán tắc ruột

- Đại tiện phân lỏng: đôi khi có dấu hiệu đi ngoài phân lỏng thất thường,

số lần đi ngoài trong ngày không nhiều, có thể tự hết mà không cần điều trị gì Những polyp nằm ở TT đoạn thấp gần hậu môn khi kích thước polyp lớn hoặc

có viêm, loét có thể gây ra các triệu chứng kích thích như đi ngoài nhiều lần,

có khi xuất hiện đau quặn, mót rặn nên dễ nhầm với hội chứng lỵ [39]

- Phân lẫn máu: là triệu chứng hay gặp nhất, có thể thấy máu tươi thành vệt trên phân hoặc máu tươi loang trong phân, có thể phân có nhầy lẫn máu màu nâu, đen hoặc máu cá Chảy máu có thể ở nhiều mức độ khác nhau: chảy máu đại thể hoặc vi thể Tuy nhiên đi ngoài ra máu không phải là triệu chứng đặc hiệu của PLĐTT mà còn gặp trong rất nhiều bệnh lý khác như hội chứng lỵ, bệnh trĩ, UTĐTT, viêm loét ĐTT chảy máu , vì vậy triệu chứng này chỉ có giá trị gợi ý, định hướng chẩn đoán [73]

- Thăm trực tràng: có thể phát hiện được những polyp cách hậu môn dưới 7cm, đây là phương pháp đơn giản, rẻ tiền nhưng hiệu quả chung thấp nên chỉ được áp dụng trong thăm khám ban đầu

- Dấu hiệu polyp lồi ra ngoài hậu môn: những polyp TT ở thấp, loại có cuống có thể bị lồi ra ngoài hậu môn nhất là sau khi đi ngoài, đây cũng là một dấu hiệu giúp cho chẩn đoán bước đầu

8

- Những trường hợp không có triệu chứng lâm sàng: có nhiều trường hợp bệnh nhân không có triệu chứng lâm sàng nhưng vẫn có PLĐTT, do vậy cần chú ý khai thác yếu tố tiền sử gia đình, bệnh nhân trên 50 tuổi được khuyến cáo nội soi ĐT toàn bộ để phát hiện sớm PLĐTT

- Nhìn chung triệu chứng lâm sàng của BN có PLĐTT thường rất nghèo nàn, các triệu chứng thường gặp là: đau bụng, phân có nhầy máu hoặc đại tiện ra máu tươi, rối loạn phân kéo dài, mệt mỏi gầy sút cân, thiếu máu… [69], [108], [124]

1.2.2 Một số yếu tố nguy cơ của polyp đại trực tràng

* Hút thuốc lá:

Thuốc lá có chứa chất gây ung thư gây ra hủy hoại về di truyền không thể đảo ngược được đối với niêm mạc ĐTT, bắt đầu bằng sự hình thành PLĐTT [99] Sự liên quan giữa hút thuốc lá và nguy cơ hình thành khối u khá rõ ràng không phân biệt giới tính, loại polyp, vị trí và mức độ nghiêm trọng của bệnh, hầu hết các nghiên cứu cho thấy ít nhất 2-3 lần tăng nguy cơ polyp ở người hút thuốc [30]

* Lạm dụng rượu:

Dữ liệu từ nghiên cứu thuần tập của Mostofsky E và cộng sự thực hiện

từ năm 1984-2012, cho thấy phụ nữ tiêu thụ nhiều hơn 30gram rượu mỗi ngày

có tỷ lệ PLĐTT cao hơn 1,8 lần so với người tiêu thụ ít hơn [105] Một phân tích gộp của Cho E tổng hợp từ 8 nghiên cứu cũng cho thấy nguy cơ gia tăng UTĐTT ở những người tiêu thụ nhiều hơn 30gram rượu mỗi ngày [54] Nghiên cứu của tác giả Shrubsole và cộng sự không thấy có sự khác biệt có ý nghĩa thống kê về nguy cơ u tuyến hoặc polyp tăng sinh giữa những người không bao giờ uống rượu và những người đã và đang sử dụng [127]

* Gia tăng chỉ số BMI:

Nhiều nghiên cứu chỉ ra mối liên quan giữa chỉ số BMI và UTĐTT [109]

và polyp tuyến [91] Phân tích gộp của tác giả Ben Q, năm 2012 kết luận rằng

9

sự gia tăng chỉ số BMI 5 đơn vị cho thấy có sự tăng lên 19% về polyp tuyến ở

cả nam và nữ [38] Sự liên quan giữa polyp răng cưa và BMI ít nghiên cứu hơn và do đó ít rõ ràng hơn, tuy nhiên, trong phân tích gộp gần đây từ 20 nghiên cứu của tác giả Bailie cho thấy tăng nguy cơ polyp răng cưa khi so sánh BMI thấp nhất và cao nhất [33]

* Chế độ ăn uống:

Nghiên cứu của tác giả Davenport J.R cho thấy mối tương quan giữa lượng chất béo và nguy cơ PLĐTT [55], có báo cáo khác lại không thấy có liên quan [120] Trong nghiên cứu của Passarelli M.N và cộng sự phân tích tổng hợp từ 17 nghiên cứu về nội soi đại tràng với hơn 40.000 người cho thấy, những người có một hoặc nhiều u nhỏ ở ĐTT thường gặp ở đối tượng uống ít nước, có rối loạn chuyển hóa lipid máu, đặc biệt là những người có tăng triglycerid máu [115]

Các phân tích gộp từ các nghiên cứu quan sát chỉ ra tác động của thịt đỏ

và thịt chế biến trên UTĐTT và polyp tuyến [32], [52] và đã có hướng dẫn lâm sàng giảm lượng tiêu thụ thịt đỏ để giảm nguy cơ ung thư [147] Đặc biệt cho thấy tăng 22% nguy cơ tương đối đối với polyp tuyến ở những người thường xuyên tiêu thụ thịt đỏ và thịt đã chế biến cao [32] và nguy cơ này cũng ước tính tương tự đối với polyp răng cưa [33]

* Hoạt động thể chất:

Có bằng chứng thuyết phục về mức độ hoạt động thể chất cao hơn có thể làm giảm nguy cơ UTĐTT [136]

Phân tích gộp của Wolin K.Y cũng cho thấy một mối liên hệ ngược đáng

kể giữa hoạt động thể chất và sự xuất hiện các polyp tuyến, giảm nguy cơ tương đối 16% khi so sánh những người có hoạt động thể lchất thường xuyên và người

ít hoạt động [148]

1.3 Đặc điểm hình ảnh đại thể và mô bệnh học của polyp đại trực tràng

1.3.1 Phân loại polyp đại trực tràng trên hình ảnh nội soi

* Phân loại polyp theo hình dạng

Quy ước phần polyp dính vào thành ĐTT gọi là chân hoặc cuống polyp, phần ở xa nhất so với chân hay cuống gọi là đỉnh polyp, phần còn lại giữa đỉnh với cuống polyp là đầu polyp Theo hình thái, phân PLĐTT làm 3 loại [128]:

- Polyp có cuống (stalked): khi đầu polyp rộng hơn cuống polyp, giữa

đầu và cuống có ranh giới rõ rệt

- Polyp nửa cuống (pedunculated): khi chân polyp rộng hơn đầu polyp

- Polyp không có cuống (sessile): khi mà phần cuống polyp chỉ nhỏ hơn

phần đầu một chút và ranh giới không rõ giữa đầu với cuống polyp

- Polyp dạng dẹt: khi mà phần đỉnh polyp bằng phẳng, to bè, có khi rộng gần như phần chân, có tác giả còn gọi dạng này là polyp có hình tấm thảm

Hình 1.2 Polyp dạng dẹt [46] Hình 1.3 Polyp không cuống [46]

11

Hình 1.4 Polyp có cuống [46] Hình 1.5 Polyp nửa cuống [46]

* Phân loại polyp đại trực tràng theo kích thước

Kích thước polyp thường được tính ở chỗ polyp to nhất Với polyp có cuống thì tính đường kính ở đầu polyp Với polyp không cuống tính đường kính chân polyp Để giúp cho điều trị, tiên lượng và nghiên cứu người ta phân loại như sau:

Hình 1.6 Hình dạng polyp [128]

A: Polyp có cuống; B: Polyp không cuống: C: Polyp nửa cuống

- Polyp nhỏ: khi đường kính polyp dưới 10mm

- Polyp vừa: khi đường kính polyp từ 10mm đến 20mm

- Polyp to: khi đường kính polyp từ 20mm trở lên

* Phân loại polyp đại trực tràng theo vị trí

Polyp có thể gặp ở bất cứ vị trí nào của đại trực tràng ĐTT có 6 đoạn thì

có 6 vị trí tương ứng là trực tràng, ĐT sigma, ĐT xuống, ĐT ngang, ĐT lên

và manh tràng

12

Tác giả Iravani (2014) qua nghiên cứu 167 BN PLĐTT thấy: TT/ ĐT sigma hay gặp nhất (63,1%), tiếp theo là 19,6% ở ĐT xuống; 7,6% ở ĐT ngang; 5,8%

ở ĐT lên và 3,1% ở manh tràng, dữ liệu bị thiếu trong hai trường hợp [84]

Theo Đỗ Nguyệt Ánh (2011) nghiên cứu 86 BN PLĐTT thấy: ĐT trái là

vị trí có tỷ lệ polyp cao, trong đó nhiều nhất ở ĐT sigma 43,0%, sau đó ở TT chiếm 17,4% [1]

* Phân loại theo số lượng polyp

Theo số lượng polyp, chia làm 3 loại [128]:

- Polyp đơn độc (Single polyps): trong lòng ĐT chỉ có một polyp ở bất kỳ vị trí nào, polyp đơn độc có hai dạng:

+ Polyp đơn độc thiếu niên (Juvenile solitaire polyps): thường to, có cuống, ít thấy UT hóa

+ Polyp đơn độc ở người lớn (Adenomatous solitaire polyps): thường không có cuống, đáy cứng và hay UT hóa

- Đa polyp (Multiple polyps): khi trong lòng đại tràng có từ 2 – 99 polyp

- Bệnh Polyposis: khi trong lòng ĐT có từ 100 polyp trở lên Bệnh có liên quan đến tính di truyền và được chia thành 2 loại: hội chứng bệnh polyp mang tính chất gia đình và hội chứng bệnh polyp không mang tính chất gia đình

* Phân loại theo bề mặt polyp

Chia bề mặt polyp theo 4 loại hình thái sau [128]:

+ Bề mặt nhẵn: bề mặt polyp giống niêm mạc trực tràng

+ Bề mặt sần sùi: bề mặt polyp giống hình súp lơ

+ Bề mặt xung huyết: bề mặt xung huyết đỏ

+ Bề mặt loét: trên bề mặt có ổ loét có thể có giả mạc hoặc không

1.3.2 Mô bệnh học polyp đại trực tràng

Phân loại vi thể của polyp dựa trên phân loại của WHO năm 2000 được Rubio [123] tổng hợp cụ thể như sau:

13

* Nhóm polyp u (Neoplastic polyps):

- Polyp u tuyến (Adenomatous polyps):

+ Polyp u tuyến ống (Tubular adenoma)

+ Polyp u tuyến ống - nhung mao (Tubulovillous adenoma)

+ Polyp u tuyến nhung mao (Villous adenoma)

- Polyp ung thư hóa (Polypoid carcinoma)

- Các khối u không biểu mô (Nonepithelial tumors: lipoma, leiomyoma)

* Nhóm polyp không u (Non-neoplastic polyps):

- Polyp Peutz-Jeghers

- Polyp thiếu niên (Juvenile polyps) Nhóm này phân ra 3 loại: polyp thiếu niên đơn thuần, polyp thiếu niên có viêm và polyp thiếu niên có u tuyến

- Polyp tăng sản (Hyperplastic polyps)

- Polyp viêm (Inflammatory polyps)

* Nhóm polyp biến thể của polyp tuyến:

- U tuyến dẹt: là một nhóm dưới của u tuyến do Muto và cs đặt tên do

tiềm năng ác tính của nó Về đại thể, u tuyến dẹt có thể dẹt hoàn toàn hoặc hơi nhô lên ở trung tâm u Theo định nghĩa của Hội UTĐTT Nhật Bản, đường kính của polyp này lớn gấp 2 lần chiều dày của nó Khi tổn thương nhỏ hơn 10mm

có thể sẽ rất dễ bỏ qua khi nội soi Các nhà tiêu hóa Nhật Bản đã sử dụng cách phun phẩm màu trong nội soi nhằm dễ dàng phát hiện loại u tuyến này Khi không sử dụng kỹ thuật soi phun màu, tỷ lệ u tuyến dẹt được phát hiện vào khoảng 8,5-12% Trái lại, nếu sử dụng kỹ thuật đó, tỷ lệ phát hiện vào khoảng 8,8-36% So với các tổn thương dạng polyp, typ polyp dẹt thường nhỏ hơn nhưng có tỷ lệ cao đối với tổn thương loạn sản độ cao và ung thư [134]

- U tuyến răng cưa: u tuyến răng cưa cũng là một nhóm dưới của u

tuyến, đã có những báo cáo và bằng chứng chứng minh tiềm năng ác tính của của loại u tuyến răng cưa này mặc dù lịch sử tự nhiên và sự tiến triển vẫn

14

chưa được xác định rõ ràng và nó được bổ sung vào nhóm u tuyến trong phân loại của WHO năm 2000 Phân tích gộp của Bailie (2017) về nguy cơ polyp răng cưa đã kết luận: một số yếu tố lối sống, đáng chú ý nhất là hút thuốc lá

và rượu có liên quan đến nguy cơ hình thành polyp răng cưa [33]

U tuyến răng cưa được đặc trưng bởi những thay đổi trong cấu trúc răng cưa mà chủ yếu tập trung ở phần dưới của khe tuyến với đặc điểm khe tuyến chia nhánh, tạo hình chữ T hay chữ L ngược, giảm số lượng tế bào hình đài hoặc tế bào hình đài không điển hình với chất nhầy chỉ thấy ở phần đỉnh của bào tương, kèm theo đa số là loạn sản mức độ thấp với những thay đổi hình thái nhân tế bào không điển hình, tuy nhiên vẫn có thể gặp những hình thái của loạn sản độ cao với tỷ lệ thấp U tuyến răng cưa được chia thành 3 loại gồm u tuyến răng cưa truyền thống, polyp hỗn hợp và u tuyến không cuống

có răng cưa

Tác giả Mikhaleva và cs (2017) đã công bố: các phân typ của u tuyến răng cưa rất khác nhau theo giới tính, tuổi, vị trí tổn thương và đặc điểm di truyền phân tử [104] Qua phân tích đa biến Lebwohl (2012) cho thấy người

da đen có 76% và người gốc Tây Ban Nha tăng 37% nguy cơ u tuyến so với người da trắng [95].Trái với nguy cơ u tuyến, người Mỹ gốc châu Phi và người Mỹ gốc Tây Ban Nha dường như có nguy cơ bị polyp răng cưa thấp hơn người da trắng, với tỷ lệ tương ứng giảm 35% và 67%, theo Wallace (2009) [142] Nghiên cứu của Yamane trên 342 polyp lấy từ 155 bệnh nhân thấy tỷ lệ u tuyến là 70,2%, tổn thương răng cưa là 29,8%, trong đó nhóm tăng sản là 24,5%, polyp răng cưa không cuống là 3,8% [149]

1.4 Hóa mô miễn dịch

1.4.1 Lịch sử phát triển

Năm 1941, kỹ thuật miễn dịch huỳnh quang được Cooms lần đầu tiên công

bố, được coi là khởi đầu của hóa mô miễn dịch (Immunohistochemistry) Tuy

15 nhiên kỹ thuật chỉ giới hạn trong việc phát hiện các vi khuẩn trong bệnh nhiễm trùng

Kỹ thuật HMMD là một chuyên ngành được ra đời bởi sự kết hợp của 2 chuyên ngành: miễn dịch học và mô học Kỹ thuật đã ứng dụng các nguyên lý

và kỹ thuật của miễn dịch học để nghiên cứu các tế bào và mô Đây là một phương pháp nhuộm đặc biệt trong đó các kháng thể được sử dụng nhằm xác định sự hiện diện của các kháng nguyên đặc hiệu trong và/hoặc trên bề mặt tế bào [12], [47]

1.4.2 Nguyên lý của HMMD

HMMD là sự kết hợp giữa mô học và miễn dịch học, áp dụng một

phương pháp nhuộm đặc biệt, trên cơ sở sử dụng các kháng thể để xác định kháng nguyên trong tổ chức, đó là một phương pháp hỗ trợ quan trọng cho chẩn đoán mô học Mục đích chính của HMMD là xác định chính xác hơn bản chất của tế bào, các đại phân tử có mặt trong tổ chức so với kỹ thuật nhuộm hoá mô, qua đó giúp các bác sỹ lâm sàng có lựa phương pháp điều trị phù hợp và tiên lượng bệnh chính xác cũng như tiên lượng khả năng tái phát

sau điều trị phẫu thuật cắt bỏ khối u

Kỹ thuật nhuộm HMMD dựa trên phản ứng miễn dịch của sự kết hợp giữa kháng nguyên - kháng thể và các hoá chất để làm rõ phức hợp này dưới kính hiển vi quang học Các kháng nguyên có thể hiện diện trong bào tương, màng tế bào hoặc nhân, kháng thể chủ yếu là IgG

Kháng thể có sự kết hợp trực tiếp với kháng nguyên gọi là kháng thể thứ nhất, có 2 loại là kháng thể đa dòng và kháng thể đơn dòng

Vì phức hợp kháng nguyên kháng thể này không thể thấy được dưới kính hiển vi quang học nên cần có một hệ thống để hiển thị vị trí có phản ứng KN- KT, gồm 2 phần là kháng thể thứ 2 (cầu nối kháng thể thứ nhất với hệ thống phóng đại dấu hiệu nhận biết) và hệ thống phóng đại dấu hiệu nhận biết

16

gồm một men, chất màu, chất nền Khi gen P53 bị đột biến (đặc biệt trong các trường hợp ung thư), thì nồng độ protein này tại mô có thể tăng cao và được phát hiện nhờ kỹ thuật HMMD, kỹ thuật khuếch đại gen PCR hoặc kỹ thuật SSCP (Single strand conformation polymorphism) để phát hiện khuếch đại gen [10] [47]

1.4.3 Ứng dụng của hóa mô miễn dịch trong chẩn đoán

1.4.3.1 Xác định nguồn gốc của những u không biệt hóa

Các loại ung thư (UT) khác nhau có tiên lượng và cách điều trị khác nhau, do đó việc xác định nguồn gốc tế bào ung thư giúp phân loại chính xác các UT giúp ích rất nhiều cho việc điều trị bệnh này Chẩn đoán giải phẫu bệnh cơ bản dựa vào hình thái tế bào và cấu trúc mô học của tế bào Các u có nguồn gốc thượng mô thường xếp thành mảng, các u có nguồn gốc trung mô thường xếp rời rạc

Nhưng có nhiều loại u có nguồn gốc khác nhau nhưng có biểu hiện hình thái giống nhau như u tế bào sáng có thể có nguồn gốc trung mô, thượng mô hoặc mô lympho Do đó các nhà bệnh học cần phải nhờ đến một công cụ khác ngoài hình thái học để xác định nguồn gốc tế bào u Ðó là dùng các kỹ thuật HMMD để xác định kháng nguyên đặc hiệu hiện diện trên tế bào u [10], [12], [47]

1.4.3.2 Xác định ung thư biểu mô vi xâm nhập và thâm nhiễm giả

Ung thư biểu mô vi xâm nhập thường được xác định bằng sự thấm nhập qua khỏi màng đáy Kháng thể chống màng đáy được dùng là collagen typ IV hoặc laminin Màng đáy có thể bị gián đoạn một ít trong mô lành tính, còn trong UTBM vi xâm nhập màng đáy bị mất hay bị phá hủy

Các tổn thương lành tính thâm nhiễm giả rất khó phân biệt với UTBM xâm nhập, đặc biệt là ở vú và tuyến tiền liệt Màng đáy còn nguyên vẹn, rõ ràng bao quanh đám tế bào nghi ngờ gợi ý tổn thương lành tính hoặc UTBM

17

tại chỗ Trong mô vú màng đáy bao gồm cả tế bào cơ biểu mô, được xác định bằng kháng thể chống actin Sự hiện diện của tế bào cơ biểu mô quanh các ống tuyến "xâm nhập" gợi ý tổn thương lành tính Tuy nhiên nếu không có tế bào cơ biểu mô cũng không đủ để chẩn đoán ác tính vì tế bào cơ biểu mô phân bố không đều, có thể không bắt gặp trên lát cắt [12], [47]

1.4.3.3 Xác định ung thư biểu mô di căn thầm lặng

Di căn hạch vùng là yếu tố tiên lượng quan trọng nhất đối với hầu hết các loại u Hóa mô miễn dịch có thể xác định vi di căn thầm lặng (occult) đến tủy xương, khoảng 25 - 30% BN UTBM tuyến vú giai đoạn đầu (giai đoạn còn khả năng phẫu thuật)

- Xác định yếu tố tiên lượng trong ung thư:

Các KN liên quan đến sự tăng sinh tế bào gồm: Ki67-kháng nguyên được xác định bằng kháng thể đơn dòng Ki67 và proliferating cell nuclear antigen (PCNA) - kháng nguyên nhân tế bào tăng sinh

Ki67 là KN ở nhân tế bào, hiện diện ở kỳ hoạt động của tế bào (G1, S, G2 và phân bào), không có ở kỳ nghỉ ngơi (G0) PCNA cũng phân bố trong chu kỳ hoạt động của tế bào như Ki67 nhưng khác ở mức độ biểu hiện

Ki67 và PCNA liên quan mật thiết với hình thái tăng trưởng tế bào, đặc biệt là chỉ số phân bào và độ mô học của u Trong ung thư vú, sự biểu hiện của Ki67 và PCNA liên quan đến các marker khác của sự biệt hóa và tiên lượng như estrogen-progesteron, P53 Những bệnh nhân có thời gian sống thêm ngắn, thường có tỷ lệ Ki67 và PCNA cao [12]

1.4.3.4 Chẩn đoán phân biệt u lành và ung thư

Phương pháp HMMD có lợi thế trong việc xác định nguồn gốc tế bào nhưng bị hạn chế trong việc xác định u lành hay u ác tính, ngoại trừ một số trường hợp đặc biệt như:

18

+ Trong chẩn đoán phân biệt phản ứng lành tính của mô lympho và lymphoma nhờ dựa vào nhuộm đồng thởi cả 2 kháng thể chống chuỗi nhẹ Kappa và Lambda Nếu cả hai đều dương tính là phản ứng lành tính, còn chỉ một trong hai dương tính hay cả hai đều âm tính là lymphoma

+ Kháng nguyên CEA không hiện diện hoặc hiện diện rất ít ở mặt trên của tế bào tuyến niêm mạc dạ dày, nhưng hiện diện rất nhiều trong bào tương cũng như trên màng tế bào tuyến ác tính, do đó có thể áp dụng để chẩn đoán carcinom tuyến giai đoạn sớm chỉ ở lớp niêm mạc và các trường hợp không rõ ràng khác Tuy nhiên cần phải cân nhắc cẩn thận và loại trừ cả yếu tố âm tính giả và dương tính giả trước khi kết luận [12]

1.4.3.5 Dự đoán đáp ứng điều trị

Xác định thụ thể estrogen, progesteron Sự biểu hiện của cả hai thụ thể progesteron và estrogen trên ung thư biểu mô (UTBM) tuyến vú có liên quan mật thiết đến tiên lượng của bệnh nhân và cũng liên quan đến các yếu tố tiên lượng khác như độ mô học và giai đoạn bệnh Các u biệt hóa cao và ở giai đoạn thấp thường có thụ thể estrogen và progesteron dương tính

Sự khuếch đại gen mã hóa Her-2/neu được mô tả ở vú, buồng trứng, tuyến tiền liệt, tuyến nước bọt, phổi, đại tràng và UTBM tế bào gai Khoảng

25 - 30% BN ung thư vú và 1/3 BN ung thư buồng trứng có biểu hiện khuếch đại gen này Các BN này thường có tỷ lệ tái phát cao và thời gian sống thêm ngắn hơn các ung thư không có gen Her-2/neu [12]

1.4.3.6 Xác định tế bào nhiễm khuẩn

Kỹ thuật HMMD có thể phát hiện được sớm, nhanh chóng và chính xác

các vi sinh vật khó phát triển trong môi trường cấy như Helicobacter pylori, Histoplasmacapsulatum, Pneumocystic carinii So với các phương pháp

khác như dùng kỹ thuật lai tại chỗ thì kỹ thuật HMMD nhanh và đặc hiệu hơn Có khoảng hơn 60 loại vi khuẩn và virus có thể phát hiện bằng HMMD

bỏ nhờ hiện tượng thực bào Ngoài ra, P53 còn trở thành một gen sinh UT với khả năng tạo u và hoạt hóa các gen gây UT khác

P53 còn được gọi là TP53 là gen mã hóa protein điều hòa chu kỳ tế bào

và do đó nó có chức năng như một chất ức chế khối u P53 được mô tả là “kẻ bảo vệ bộ gen” đề cập đến vai trò của nó trong sự ổn định bảo tồn bằng cách ngăn chặn đột biến hệ gen Gen nằm trên nhánh ngắn NST số 17 (17p13), có vai trò kiểm soát chu kỳ tế bào ở giai đoạn G1 Sản phẩm của gen P53 là protein p53 [37]

Gen ức chế khối u được mô tả đầu tiên trong nghiên cứu của Knudson về dịch tễ của u nguyên bào võng mạc ở trẻ em Đó là những gen hoạt động theo tính lặn, chức năng của nó chỉ mất đi khi cả hai alen bị bất hoạt Đến khi, một gen ức chế u di truyền đột biến dòng tế bào mầm thì cá thể mang đột biến này chỉ cần thêm một đột biến nữa trên alen còn lại sẽ gây mất chức năng của gen Khi một gen ức chế u có hai alen bình thường, thì phải

có hai đột biến sinh dưỡng xảy ra trên hai alen mới gây mất chức năng của gen Giả thuyết hai cú hích của Knudson giải thích tại sao các bệnh di

20

truyền thường thấy ở tuổi sớm hơn các bệnh không do di truyền và giải thích khái niệm gen ức chế hoạt động theo kiểu gen lặn [48]

1.5.1.2 Cấu trúc, cơ chế, vai trò

* Cấu trúc: protein P53 là một phosphoprotein có 393 axít amin Nó gồm

4 đơn vị:

+ Một domain kích hoạt yếu tố phiên mã

+ Một domain nhận biết trình tự DNA chuyên biệt

+ Một domain chịu trách nhiệm cho protein tetramerization

+ Một domain nhận biết DNA tổn thương, như là các cặp base sai lệch hoặc DNA sợi đơn

P53 type hoang dại là một protein bất ổn định, bao gồm vùng gấp và không có cấu trúc chức năng hiệp đồng

- Cơ chế: nó đóng một vai trò quan trọng trong kiểm soát chu kỳ tế bào

và apoptosis Khiếm khuyết P53 có thể cho phép tăng sinh các tế bào bất thường, dẫn đến ung thư

Trong tế bào bình thường, mức độ protein P53 thấp Khi tổn thương DNA và có tín hiệu stress có thể làm tăng protein p53, trong đó có 3 chức năng chính: kìm hãm sự phát triển, sửa chữa DNA và tế bào chết theo chương trình Kìm hãm sự phát triển làm dừng sự tiến triển chu kỳ tế bào, ngăn chặn

sự sao chép của DNA đã tổn thương Trong suốt thời kỳ kìm hãm sự phát triển, P53 có thể kích hoạt sự phiên mã các protein liên quan đến việc sửa chữa DNA Chết theo chương trình là phương án cuối cùng để tránh tăng sinh

tế bào bất thường DNA

Khi gen P53 bị đột biến (đặc biệt trong các trường hợp ung thư), thì nồng

độ protein này tại mô có thể tăng cao và được phát hiện nhờ kỹ thuật hóa mô miễn dịch, hoặc kỹ thuật SSCP (Single strand conformation polymorphism)

để phát hiện khuếch đại gen [37]

21

* Cơ chế điều hòa P53:

Hình 1.7 Cơ chế điều hòa P53 [37], [71]

(a) Sự bộc lộ Mdm2 được hoạt hóa bởi P53

(b) P53 gắn với Mdm2 có thể làm giáng hóa P53 thông qua hệ thống ubiquitin

(c) P53 được phosphoryl hóa ở Ser15, Thr18, Ser20 sẽ phá vỡ sự gắn kết với Mdm2

(d) DNA tổn thương có thể hoạt hóa protein kinase (như ATM, PK,CHK2), phosphoryl hóa P53 gây tăng P53

DNA-22

* Vai trò của P53:

Hình 1.8 Sơ đồ kiểm soát chết tế bào theo chương trình [37] [71]

a Kiểm soát chu kỳ tế bào; b Sự chết tế bào theo chương trình

- Nếu P53 bị hư hại, sự ức chế khối u giảm

- P53 liên tục được sinh ra và xuống cấp trong tế bào Sự thoái giáng P53 liên quan đến việc gắn Mdm2 (Mouse double minute 2 homolog-là gen điều hòa ngược âm tính của gen ức chế khối u P53) Tuy nhiên đột biến P53 thường không sinh Mdm2 và vì vậy có thể tích lũy ở nồng độ cao Tệ hơn nữa, đột biến P53 có thể ức chế P53 bình thường

- Chức năng: điều chỉnh và kiểm tra sự phân chia của tế bào, giữ gìn sự toàn vẹn của bộ gen tế bào Thể hiện:

+ Làm dừng chu kỳ tế bào ở pha G1: P53 kích thích hoạt tính của các gen

ức chế khối u khác được coi là gen đích của P53 như p21 mà protein của p21

ức chế CDK (cyclin dependent kinase-là kinase phụ thuộc cyclin) làm CDK4 không hoạt động, dẫn tới pRb không bị bất hoạt bởi CDK4 làm tế bào dừng lại

ở pha G1 Do tế bào dừng ở trước pha S nên tế bào có thời gian sửa chữa những sai sót của DNA trước khi DNA được nhân lên

23

+ Chết tế bào theo chương trình (apoptosis): khi tế bào có DNA bị tổn thương không được sửa chữa sẽ được P53 điều khiển đi đến chết tế bào theo chương trình

Do vậy khi P53 bị đột biến, những tế bào với tổn thương DNA có thể vừa không được sửa chữa, vừa không chết và tiếp tục nhân lên với những DNA tổn thương có thể dẫn tới hình thành khối u [42]

Những hiểu biết từ các nghiên cứu về P53 trong những năm qua đã cải thiện chẩn đoán, độ chính xác của tiên lượng và điều trị ung thư Vì khoảng một nửa số khối u ở người có P53 bất thường Điều này có thể xảy ra sớm trong quá trình gây ung thư và vì các sửa đổi sau chuyển thể của P53 có thể phản ánh loại và mức độ động lực (stress) của tế bào [31] Tích lũy protein P53 đột biến và các hậu quả sửa đổi tế bào cũng có thể chứng minh hữu ích trong nghiên cứu hiệu quả của các tác nhân hóa trị liệu [81]

Khoảng 50% số ung thư của người liên quan đến thiếu P53 hoặc P53 bị biến đổi Biểu lộ gen P53 thấy ở 70% những trường hợp ung thư trực tràng Trong điều trị, người ta nhận thấy các u mang P53 bình thường đáp ứng với xạ trị liệu hoặc hóa trị liệu tốt hơn các u mang P53 đột biến Người ta cũng có thể điều trị bằng cách gắn những gen P53 bình thường vào những tế bào u, kết quả giảm một cách đáng kể khối u [42] Liệu pháp gen dựa trên sự ra đời của P53

24

hoang dại đã được trải qua thử nghiệm lâm sàng và một số kết quả đầy hứa hẹn, chẳng hạn như trong UT phổi và UT buồng trứng [146]

1.5.2 Ki67

1.5.2.1 Khái niệm, vai trò

Gen Ki67 được biết đến từ năm 1983 và ngày càng phổ biến Vì nó cho biết khả năng sinh sản của các tế bào ung thư nên Ki67 cung cấp một phương tiện đánh giá mức độ tăng trưởng của u khá chính xác Protein Ki67 là một thành phần trong chất cơ bản của nhân tế bào có trọng lượng phân tử là 360 kDa Gen mã hóa protein Ki67 nằm trên nhiễm sắc thể 10 chứa 15 exon [98]

Ki67 là một protein nhân không histon, có vai trò quan trọng trong tăng sinh tế bào, khi càng cao chứng tỏ ác tính càng mạnh nên có giá trị tiên lượng bệnh Ki67 nằm ở nhánh dài nhiễm sắc thể số 10 (10q25) Thời gian bán hủy của Ki67 khoảng 60 đến 90 phút Ki67 là kháng nguyên nhân tế bào, nó biểu

nghỉ, hoặc im lặng, “gián đoạn”)

Ki67 là protein phosphoryl hóa resin và threonin (acid amin cần thiết)

có vai trò quan trọng trong phân chia tế bào Nó bộc lộ cực đại ở tiền kỳ, trung kỳ, sau đó giảm sự bộc lộ ở hậu kỳ và không có ở gian kỳ Do đó, Ki67 được coi là chất chỉ thị của hoạt động nhân chia Sự biểu lộ Ki67 tăng lên cho thấy tăng hoạt động nhân chia và tăng sinh tế bào

Phản ứng miễn dịch Ki67 liên quan chặt chẽ với những đặc điểm hình thái tăng sinh tế bào, đặc biệt chỉ số nhân chia và độ mô học của u, và trong u

vú, sự biểu lộ Ki67 có liên quan với các marker khác của sự biệt hóa và tiên lượng [42]

25

1.5.2.2 Đánh giá và ứng dụng lâm sàng

Sự biểu lộ Ki67 được đánh giá qua chỉ số Ki67 Chỉ số Ki67 là tỷ

lệ phần trăm tế bào dương tính với Ki67 xác định trên 1000 tế bào u

Sự biến mất ở pha nghỉ G0 của Ki67, cho phép ước lượng đoạn tăng sinh sau khi một số lượng tương đối nhỏ các tế bào được đếm qua pha S và pha G2 Các phương pháp này bao gồm việc đo nồng độ của thymidine đánh dấu bằng hydro phóng xạ và deoxyuridine kết hợp với DNA của tế bào u, đến tỷ

lệ các tế bào ở pha S bằng đếm tế bào dòng chảy, các phương pháp này cần

kỹ thuật và trang thiết bị phức tạp Phương pháp HMMD được sử dụng phổ biến nhất để phát hiện Ki67 dựa vào việc phát hiện các protein nhân có liên quan đến sao chép DNA của tế bào Phương pháp HMMD thuận lợi hơn so với phương pháp đếm dòng chảy là nó cho phép đánh giá tỷ lệ tế bào tăng sinh, đồng thời với việc đánh giá về hình thái của mô u Dấu ấn liên quan đến tăng sinh tế bào được nghiên cứu nhiều nhất là Ki67, có liên quan chặt chẽ giữa sự bộc lộ Thymidine và tỷ lệ các tế bào dương tính với Ki67

Ki67 có giá trị trong tiên lượng sống còn và tái phát trong một số ung thư Trong UTĐTT chỉ số Ki67 dao động từ 1-8%o [75], mỗi nghiên cứu có cách đánh giá riêng Có nghiên cứu đánh giá Ki67 dương tính khi chỉ số Ki67

Ki67 và các đặc điểm giải phẫu bệnh của UTBM tuyến ĐTT, nhưng một số nghiên cứu lại cho thấy có liên quan đến mô học và yếu tố tiên lượng [112] Ki67 liên quan mật thiết với hình thái tăng trưởng tế bào, đặc biệt là chỉ

số phân bào và độ biệt hóa của u Những bệnh nhân UT có thời gian sống thêm ngắn thường có tỷ lệ Ki67 cao [98]

Biểu hiện dương tính mạnh của Ki67 là một yếu tố nguy cơ cho thấy khả năng tái phát cao, tiên lượng xấu Tuy nhiên định lượng tăng sinh tế bào dựa vào đếm số lượng nhân chia là một việc không dễ và thường cho kết quả khác nhau giữa các nhà giải phẫu bệnh Những khối u có biểu lộ Ki67 cao sẽ tiến

26

triển nhanh, làm tăng nguy cơ tái phát ở bệnh nhân UT da, có ý nghĩa cao trong đánh giá tiên lượng của nhiều loại u Một vài nghiên cứu cho thấy giá trị tiên lượng của sự biểu lộ Ki67 trong UT tế bào đáy vẫn còn đưa ra các kết quả khác nhau [86]

1.5.3 BRAF

1.5.3.1 Khái niệm

BRAF là một trong các gen của hệ gen người, nằm trên nhánh dài nhiễm sắc thể số 7 ở vị trí 34 (7q34), gồm 18 exon, với 190284 cặp base, chúng sản xuất ra một loại protein bào tương có tên là B-Raf Khi phiên mã tạo ra mRNA

có 2478 base Có 1 gen giả BRAF2 nằm trên nhiễm sắc thể giới tính X

(Xq13.3) không hoạt động chức năng như BRAF [88]

Protein BRAF có tên đầy đủ là serine/threonine-protein kinase B-raf,

bao gồm 766 acid amin, trọng lượng 84436 Dalton Nó là một trong ba loại Raf kinase (ARAF, BRAF, CRAF còn được gọi là RAF1) Trong đó protein BRAF hiện diện trong hầu hết các loại tế bào trong cơ thể người và biểu hiện nhiều trong mô thần kinh Nó có 3 domain chính bao gồm: vùng gắn kết vớiprotein RAS (RBP-Ras Binding Domain); vùng giàu Cystein (CRD-Cysteine

1.5.3.2 Vai trò, cơ chế

Gen BRAF cũng thuộc gen tiền ung thư Protein do gen này sản xuất ra có tên protein serine/threonine kinase B-Raf Protein B-Raf liên quan đến việc truyền tín hiệu nội bào và tăng trưởng tế bào Vào năm 2002, các nhà khoa học

đã phát hiện hiện tượng đột biến của gen này ở một số ung thư ở người Khi gen bị đột biến sẽ gây ra những biến đổi trong protein B-Raf, dẫn đến sinh sản

và lan tràn nhanh các tế bào u Biểu lộ gen BRAF được coi là đột biến khởi đầu

và thường tìm thấy ở những u có KRAS hoặc NRAS typ hoang dại [61], [92]

27

Hình 1.9 Đột biến BRAF [92]

B-Raf gồm 766 acid amin có vai trò điều hòa việc chuyển tín hiệu protein kinase đặc hiệu serine/threonine Có 3 vùng bảo tồn đặc tính của họ Raf kinase: vùng 1 (CR1) là vùng tự điều hòa gắn với Ras - GTP, vùng 2 (CR2) là vùng khớp nối giàu serine, vùng 3 (CR3) là vùng protein thủy phân kinase có vai trò phosphoryl hóa chuỗi protein liên tiếp Ở dạng cấu tạo hoạt động, B-Raf tạo ra dạng nhị trùng hợp (dimers) thông qua các cầu nối hydro

và tương tác tĩnh điện tại vùng kinase

Vùng CR1: vùng CR1 kiềm chế một cách tự động vùng B-Raf kinase

(CR3) sao cho tín hiệu B-Raf được điều hòa hơn Khoảng 155 – 277 acid amin còn lại tạo ra vùng gắn Ras, chúng gắn với vùng Ras – GTP phản ứng

để giải phóng CR1 và ngừng tạm thời việc ức chế kinase 234 – 280 acid amin khác gồm este phorbol/gắn diglycerid (DAG) của các protein có trọng lượng phân tử nhỏ (chúng kết nối nhờ ion kẽm giúp duy trì các nếp gấp của phân tử), tham gia vào hiện tượng B- Raf áp sát cấu trúc màng sau khi gắn Ras

Vùng CR2: vùng CR2 cung cấp các kết nối khá mềm dẻo để kết nối CR1

với CR3 và vùng này hoạt động như một khớp nối

28

Vùng CR3: vùng CR3 gồm 457 – 717 acid amin hình thành vùng enzym

kinase của B-Raf Đây là một cấu trúc có kích thước lớn với 2 thùy được nối với nhau bởi khớp nối ngắn Thùy nhỏ N (có 457 – 530 acid amin) có vai trò chính gắn kết với ATP trong khi thùy C lớn hơn (535 – 717 acid amin) gắn với protein cơ chất Vị trí hoạt động của CR3 nằm ở phần khe giữa 2 thùy và vùng thủy phân acid aspartic gồm 576 acid amin khu trú ở thùy C phía mặt trong của khe này [61], [92]

1.5.3.3 Ứng dụng trong lâm sàng

Phần lớn các biểu lộ gen BRAF xảy ra ở axit amin V600, với những biểu

lộ gen V600E là phổ biến nhất Các BRAF V600E biểu lộ là do đảo chuyển thymine được thay thế bằng adenine (T → A) tại nucleotide 1799 (T1799A), kết quả dẫn đến sự thay thế valine (V) thành glutamate (E) ở vị trí 600 của chuỗi axit amin Hơn 70 biểu lộ gen khác nhau trong gen BRAF đã được xác định, các biểu lộ gen khác như V600K, V600M, V600R, V600D và V600G ít phổ biến

Hình 1.10 Sơ đồ điều hòa việc chuyển tín hiệu protein kinase [92]