Thực tập hóa sinh: 1. ĐỊNH LƯỢNG ĐEXTRIN BẰNG PHƯƠNG PHÁP KẾT TỦA VỚI CỒN 2. ĐỊNH LƯỢNG PECTIN BẰNG PHƯƠNG PHÁP CANXI PECTAT 3. ĐỊNH LƯỢNG XENLULOZO 4. XÁC ĐỊNH HÀM LƯƠNG PROTEIN BẰNG PHƯƠNG PHÁP LOWRY 5. ĐỊNH LƯỢNG ĐƯỜNG KHỬ THEO PHƯƠNG PHÁP BERTRAND 6. ĐỊNH LƯỢNG SACCAROZO THEO PHƯƠNG PHÁP THỦY PHÂN BẰNG AXIT
Thực tập lớn hóa sinh Bài 1: ĐỊNH LƯỢNG ĐEXTRIN BẰNG PHƯƠNG PHÁP KẾT TỦA VỚI CỒN 1.1 Mục đích, yêu cầu: - Mục đích: giúp sinh viên nắm phương pháp định lượng ddexxtrin phương pháp kết tủa cồn - Yêu cầu: nắm vững kiến thức lý thuyết ddextrin, chuẩn bị đầy đủ hóa chất dụng cụ cho thí nghiệm 1.2.Nguyên tắc: Phương pháp dựa vào tính chất đextrin kết tủa hoàn toàn cồn nồng độ cao, đường glucozo, mantozo tan cồn Hàm lượng đextrin xác định theo công thức sau: X= Trong đó: X: % đextrin mẫu a : khối lượng giấy lọc kết tủa sau sấy (gam) b : khối lượng giấy lọc (gam) V : thể tích định mức (ml) V1: thể tích lấy xác định (ml) W: khối lượng mẫu phân tích (gam) 1.3.Hóa chất, dụng cụ - Hóa chât: Cồn tuyệt đối - Dụng cụ: + Cốc thủy tinh, đũa thủy tinh, bình định mức, pipet, giấy lọc… 1.4.Tiến hành: - Căn 5g mẫu cho vào cốc Cho thêm 50ml nước cất Khuấy kĩ cho tan - Lọc qua giấy lọc cho vào bình định mức Rửa vài lần nước cất định mức đến vạch lắc - Dùng pipet lấy 100ml dung dịch bình định mức cho vào cốc Thêm từ từ vào cốc 30ml cồn tuyệt đối, lắc Để yên cốc khoảng 30 phút cho kết tủa đextrin màu trắng lắng xuống - Lọc lấy kết tủa qua lớp giấy lọc ( biết khối lượng ) Rửa kết tủa vài lần cồn tuyệt đối Sấy giáy lọc có chứa kêt tủa 105 0C đến có khối lượng khơng đổi - Hàm lượng % đextrin mẫu hiệu số giấy lọc có chứa đextrin giấy lọc khơng chứa đextrin 1.5 Kết quả, nhận xét Qua thí nghiệm ta thu kết sau: a = 0.578g, b = 0.532g, w = 5g, V = 250ml, V1 = 100ml Đoàn Thị Tám Thực tập lớn hóa sinh Đồn Thị Tám Thực tập lớn hóa sinh Áp dụng cơng thức ta có: (a – b)*V*100 (0.578 – 0.532)*250*100 X= = = 2.3% V1*W 100*5 Vậy qua thí nghiệm cho thấy hàm lượng đextrin bí đỏ tương đối cao, đạt 2.3% Qua thí nghiệm giúp sinh viên nắm phương pháp xác định dextrin phương pháp kết tủa cồn Qua giúp sinh viên rèn luyện kỹ tiến hành thí nghiệm, đặc biệt thí nghiệm phức tạp Đồn Thị Tám Thực tập lớn hóa sinh Bài ĐỊNH LƯỢNG PECTIN BẰNG PHƯƠNG PHÁP CANXI PECTAT 2.1 Mục đích, yêu cầu: Mục đích: Giúp sinh viên nắm vững nguyên tắc thao tác tiến hành định lượng pectin theo phương pháp canxi pectat Yêu cầu: phải chuẩn bị đầy đủ hóa chất thí nghiệm, lúc tiến hành thí nghiệm thao tác phải nhẹ nhàng cẩn thận 2.2 Nguyên tắc: Phương pháp dựa sở thu nhận muối canxi pectat dạng kết tủa Kết tính sau: Lượng pectin lấy để xà phòng hóa (B) tính theo cơng thức sau: B= Trong đó: W: khối lượng pectin lấy để pha thành dung dịch (gam) V1: thể tích dung dịch pectin ban đầu (ml) V2: thể tích dung dịch pectin lấy để xà phòng hóa (ml) Hàm lượng canxi pectat hiệu khối lượng giấy lọc có kết tủa giấy lọc khơng có kết tủa Hàm lượng pectin (P) tính theo cơng thức sau: P= Trong đó: W: khối lượng kết tủa canxi pectat (g) B : Lượng pectin lấy đem xà phòng hóa (g) 0,92: hệ số tính chuyển trừ hàm lượng canxi kết tủa (nghĩa pectin chiếm 92% khối lượng canxi pectat) 100: Hệ số chuyển để biểu thị kết theo phần % 2.3 Hóa chất dụng cụ Hóa chất: - Dung dịch canxi clorua 2N: Hòa tan 230-250g canxi clorua ( CaCl 2) bình dung tích 1000ml, thêm nước cất tới vạch ngấn Dung tích phải có tỷ khối 1,09g/cm3, khơng cần xác định nồng đọ chuẩn - Dung dịch NaOH 0,1N: Hòa tan 4g NaOH bình định mức có dung tích 1000ml, thêm nước cất tới vạch ngấn Đoàn Thị Tám Thực tập lớn hóa sinh - Dung dịch axit axetic ( CH 3COOH) 1N: Pha loãng 60,03ml axit axetic đặc nước cất 1000ml Dụng cụ: bình tam giác, pipet, bình định mức, giấy lọc, bếp điện, xoong… 2.4 Tiến hành Cho 0,15g pectin mẫu nghiên cứu vào bình Cho thêm 100ml NaOH 1N Để hỗn hợp qua đêm để xà phòng hóa hoàn toàn pectin thành axit pectic Thêm 50ml dung dịch axit axetic 0,1N Sau phút thêm 50ml CaCl2 2N giữ Đun sôi phút lọc qua giấy lọc không tan sấy khô tới khối lượng không đổi Rửa kết tủa canxi pectat nước cất nóng khơng ion clo ( thử rửa với dung dịch bạc nitrat 1% khơng có kết tủa trắng) Sau rửa xong, đặt giấy lọc có kết tủa vào chén cân sấy khô 105 0C khối lượng khơng đổi 2.5.Kết nhận xét Qua thí nghiệm ta thu được kết sau: V1 = 200ml, V2 = 100ml, W = 0.15g, W = 0.012g Lượng pectin lấy để xà phòng hóa (B) tính theo cơng thức sau: B= Trong đó: W: khối lượng pectin lấy để pha thành dung dịch (gam) V1: thể tích dung dịch pectin ban đầu (ml) V2: thể tích dung dịch pectin lấy để xà phòng hóa (ml) Áp dụng cơng thức ta có: B = 0.15*100/200 = 0.075g Hàm lượng pectin (P) tính theo cơng thức sau: P= Trong đó: W: khối lượng kết tủa canxi pectat (g) B : Lượng pectin lấy đem xà phòng hóa (g) 0,92: hệ số tính chuyển trừ hàm lượng canxi kết tủa (nghĩa pectin chiếm 92% khối lượng canxi pectat) 100: Hệ số chuyển để biểu thị kết theo phần % P = 0.012*0.92*100/0.075 = 14.72 % Đồn Thị Tám Thực tập lớn hóa sinh - Nhận xét: Qua kết thí nghiệm ta thấy hàm lượng pectin bí đỏ tương đối cao (14.72%) Qua giúp sinh viên nắm phương pháp xác đinh hàm lương pectin mẫu, rèn luyện kỹ thí nghiệm Đồn Thị Tám Thực tập lớn hóa sinh Bài 3: ĐỊNH LƯỢNG XENLULOZO 3.1 Mục đích, yêu cầu: - Mục địch: giúp sinh nắm phương pháp định lượng xenlulozo - Yêu cầu: chuẩn bị đầy đủ hóa chất dụng cụ thí nghiệm, thao tác phải cẩn thận nhẹ nhành 3.2.Nguyên tắc: Phương pháp định lượng xenlulozo dựa vào tính chất hợp chất bền tác dụng acid mạnh kiềm mạnh, không bị phân hủy tác dụng acid yếu, chất khác thường kèm với xenlulozo hemiluloza, lignin… bền tác dụng acid kiềm nên bị oxy hóa, phân giải tan xử lý nguyên liệu dung dịch kiềm hỗn hợp acid nitric với acid axetic Hàm lượng xenlulozo tính cơng thức sau: X= Trong đó: X - hàm lượng xenlulozo tính % a - khối lượng xenlulozo (gam) W - khối lượng mẫu thí nghiệm (gam) 100 - hệ số chuyển thành % Hóa chất, dụng cụ - Dung dịch acid nitric (HNO3) đặc (d=1,4) - Dung dịch acid axetic (CH3COOH) đặc - Rượu etylic 96% 3.3 Tiến hành - Cân 0,5-1g mẫu nghiền nhỏ(sấy khô đến khối lượng không đổi nhiệt độ 100-1050C), cho vào bình nón dung tích 250ml Nếu hàm lượng xenlulozo mẫu khoảng 10-20% cân 1,5-2g, hàm lượng khoảng 40-50% cân 1-1,5g, nhỏ 10% cân 2,5-5g - Thêm vào 16,5ml hỗn hợp gồm 15ml acid nitric đặc 1,5ml acid axetic đặc lắp ống làm lạnh hồi lưu vào bình đun sơi hỗn hợp 30 phút Để nguội pha loãng hỗn hợp nước nong Lọc qua giấy lọc biết trước khối lượng - Rửa kết tủa xenlulozo nhiều lần nước cất nóng (mỗi lần 10-15ml) - Rửa rượu etylic (96%) 1-2 lần - Rửa ete etylic - Sấy giấy lọc có chứa xenlulozo nhiệt độ 100-105 0C đến khối lượng không đổi Tùy theo nồng độ thuốc thử đem dùng, với xenlulozo thường lại lượng nhỏ hemixenlulozo, chủ yếu pentozo lignon v.v Do xenlulozo xác định gọi xenlulozo “thơ” Đồn Thị Tám Thực tập lớn hóa sinh 3.4 Kết nhận xét Qua thí nghiệm ta kết sau: w = 1g (khối lượng mẫu), a = 0.021g Dựa vào cơng thức ta có: X = a*100/W = 0.021*100/1 = 2.1% - Nhận xét: Qua kết thí nghiệm ta thấy hàm lượng xenlulozo bí đỏ tương đối cao đạt 2.1% Kết chưa xác q trình thí nghiệm có nhiều sai sót, song qua thí nghiệm giúp sinh viên nắm phương pháp xác định hàm lương xenlulozo mẫu Đồn Thị Tám Thực tập lớn hóa sinh BÀI 4: XÁC ĐỊNH HÀM LƯƠNG PROTEIN BẰNG PHƯƠNG PHÁP LOWRY 4.1.Mục đích yêu cầu - Mục đích: Giúp sinh viên nắm phương pháp xây dưng đồ thị chuẩn protein phương pháp xác định hàm lượng potein mẫu - Yêu cầu: nắm vững kiên thức lý thuyết, q trình tiến hành thí nghiệm phải cẩn thận 4.2 Nguyên tắc Dựa vào phản ứng màu protein với thuốc thử Folin Do môi trường kiềm với có mặt lượng nhỏ Cu 2+ protein sẽ tạo thành phức chất màu xanh Cường độ màu dung dịch tỷ lệ thuận với hàm lượng protein có mẫu (có nghĩa hàm lượng protein mẫu cao thi phức chất bắt màu đậm) Sau dùng máy so màu để xây dựng đồ thị chuẩn, thơng qua đồ thị chuẩn ta tính hàm lượng protein có mẫu 4.3 Dụng cụ hóa chất - Dụng cụ: Máy so màu, ống nghiệm, pipet, Micropiet, bình định mức - Hóa chất: Albumin + Dung dịch đệm phosphat 0.1M, pH = + Dung dịch Na2CO3 2% tan NaOH 0.1N (dung dịch A) + Dung dịch CuSO4 1% (dung dịch B1) + Dung dịch Seignett 2% (dung dịch B2) + Dung dịch C: hỗn hợp 0.5ml dung dịch B 1, 0.5ml dung dịch B2 50ml dung dịch A (dung dịch C chuẩn bị trước dùng 30 phút) + Thuốc thử Folin 0.5N Chú ý thuốc thử Folin đựng chai màu bảo quản lạnh, thuốc thử có màu vàng, dùng thấy có màu xanh cho vài giọt brom đun 15 phút sẽ có màu vàng trở lại dùng 4.4 Tiến hành thí nghiệm 4.4.1 Cách xây dựng đờ thị ch̉n protein - Pha dung dịch chuẩn Albumin (1%): cân xác 1g albumin hòa tan nước cất định mức đến 100ml - Chuẩn bị dãy gồm ống nghiệm khơ sạch, sau cho vào ống nghiệm chất bảng sau: Đoàn Thị Tám Thực tập lớn hóa sinh TT Hóa chất Nước cất (ml) Albumin (ml) Dung dịch C (ml) Folin (ml) Hàm lượng albumin (µg/ml) MT 0.5 0.995 0.005 0.5 0.99 0.01 0.5 0.98 0.02 0.5 0.97 0.03 0.5 0.96 0.04 0.5 0.05 0.1 0.2 0.3 0.4 Khi cho dung dịch C vào ống nghiệm ta lắc để 10 phút, sau cho vào ống nghiệm 0.5ml dung dịch Folin để yên 30 phút Sau đem so màu bước sóng 620nm ta thu kết sau: Hàm lượng Albumin(µg/ml) OD 0.05 0.1 0.2 0.3 0.4 0.175 0.29 0.40 0.515 0.623 Sử dụng phần mềm oringin 6.0 xây dựng đồ thị chuẩn protein: Linear Regression for Data1_B: Y = A + B * X = 0.0643 + 1.121X Parameter Value Error -A 0.0643 0.00219 B 1.121 0.00661 -R SD N P -0.99995 0.00209