Luận án tiến sĩ sinh học nghiên cứu đa dạng của họ bọ cánh cứng ăn lá (chrysomelidae) và mối quan hệ của chúng với thực vật trong điều kiện môi trường của vườn quốc

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ --- NGUYỄN THỊ ĐỊNH NGHIÊN CỨU ĐA DẠNG CỦA HỌ BỌ CÁNH CỨNG ĂN LÁ CHRYSOMELIDAE VÀ MỐ

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC

VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM

HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ

-

NGUYỄN THỊ ĐỊNH

NGHIÊN CỨU ĐA DẠNG CỦA HỌ BỌ CÁNH CỨNG ĂN LÁ (CHRYSOMELIDAE) VÀ MỐI QUAN HỆ CỦA CHÚNG VỚI THỰC VẬT TRONG ĐIỀU KIỆN MÔI TRƯỜNG CỦA VƯỜN QUỐC GIA NÚI CHÚA, TỈNH NINH THUẬN, VIỆT NAM

BẰNG PHƯƠNG PHÁP SINH HỌC PHÂN TỬ

LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC

HÀ NỘI -2018

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC

VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM

HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ

-

NGUYỄN THỊ ĐỊNH

NGHIÊN CỨU ĐA DẠNG CỦA HỌ BỌ CÁNH CỨNG ĂN LÁ (CHRYSOMELIDAE) VÀ MỐI QUAN HỆ CỦA CHÚNG VỚI THỰC VẬT TRONG ĐIỀU KIỆN MÔI TRƯỜNG CỦA VƯỜN QUỐC GIA NÚI CHÚA, TỈNH NINH THUẬN, VIỆT NAM

BẰNG PHƯƠNG PHÁP SINH HỌC PHÂN TỬ

Chuyên ngành: Sinh thái học

Mã số: 9 42 01 20 LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC:

1 PGS.TS NGUYỄN VĂN SINH

2 TS JESÚS GÓMEZ-ZURITA

HÀ NỘI - 2018

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi Các số liệu trình bày trong luận án là trung thực Một số kết quả nghiên cứu đã được tôi công bố riêng hoặc đồng tác giả, phần còn lại chưa được ai công bố trong bất kỳ công trình nào khác

Tôi xin cam đoan rằng mọi sự giúp đỡ cho việc thực hiện luận án đã được cám

ơn, các thông tin trích dẫn trong luận án này đều được chỉ rõ nguồn gốc

Hà Nội, ngày tháng năm 2018

Tác giả luận án Nguyễn Thị Định

LỜI CẢM ƠN

Trong quá trình thực hiện đề tài “Nghiên cứu đa dạng của họ Bọ cánh cứng ăn lá (Chrysomelidae) và mối quan hệ của chúng với thực vật trong điều kiện môi trường của Vườn quốc gia Núi Chúa, tỉnh Ninh Thuận, Việt Nam bằng phương pháp sinh học phân tử”, Tôi đã nhận được rất nhiều sự giúp đỡ, tạo điều kiện của Ban lãnh đạo, các nhà khoa học, cán bộ, chuyên viên của Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật (IEBR), Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam; Ban lãnh đạo Viện Nghiên cứu de Biologia Evolutiva (IBE) ở Tây Ban Nha; Ban Giám hiệu Học viện Khoa học và Công nghệ Tôi xin bày tỏ lòng cảm ơn chân thành về sự giúp đỡ đó

Tôi xin chân thành cảm ơn chương trình hợp tác khoa học giữa Viện Hàn Lâm Khoa học và Công Nghệ Việt Nam và Hội đồng nghiên cứu Quốc Gia Tây Ban Nha, giai đoạn 2011-2014 đã tài trợ học bổng và kinh phí cho tôi trong quá trình học tập ở Tây Ban Nha

Tôi xin chân thành cảm ơn tới Tổng cục Lâm nghiệp Việt Nam đã cho phép tôi được làm việc trong VQG Núi Chúa

Tôi xin chân thành cảm ơn tới Ban Quản lý VQG Núi Chúa đã giúp đỡ, tạo điều kiện cho tôi trong quá trình thu mẫu ở VQG Núi Chúa

Tôi xin chân thành cảm ơn các cán bộ nghiên cứu trong phòng Sinh thái môi trường đất (IEBR), Annabela Cardoso và các bạn bè sinh viên trong phòng thí nghiệm

Đa dạng và Tiến hóa côn trùng ăn lá (IBE) đã tạo điều kiện và giúp đỡ tôi trong quá trình thực hiện luận án

Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới PGS.TS Nguyễn Văn Sinh (Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật), Tiến sĩ Jesús Gómez-Zurita (de Biologia Evolutiva, Tây

Ban Nha) – những người thầy trực tiếp hướng dẫn và chỉ bảo cho tôi hoàn thành luận

án này

Cuối cùng tôi chân thành cảm ơn tới chồng tôi là Trịnh Đình Cường, con gái Trịnh Nguyễn Thu Thủy, con trai Trịnh Bình Minh và gia đình đã động viên, khích lệ, tạo điều kiện và giúp đỡ tôi trong suốt quá trình thực hiện và hoàn thành luận án này

NCS: Nguyễn Thị Định

MỤC LỤC

LỜI CAM ĐOAN i

LỜI CẢM ƠN ii

MỤC LỤC iii

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT vi

DANH LỤC CÁC BẢNG viii

DANH LỤC CÁC HÌNH ix

MỞ ĐẦU 1

1.1 Lý do chọn đề tài 1

1.2 Mục tiêu của đề tài 1

1.3 Nội dung nghiên cứu 2

1.4 Đối tượng nghiên cứu 2

1.5 Phạm vi nghiên cứu 2

1.6 Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài 2

1.6.1 Ý nghĩa khoa học 2

1.6.2 Ý nghĩa thực tiễn của đề tài 2

Chương 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

1.1 Các vấn đề liên quan đến luận án 3

1.1.1 Sử dụng công cụ sinh học phân tử để đánh giá đa dạng sinh học .3

1.1.1.1 Đa dạng sinh học và những vấn đề liên quan 3

1.1.1.2 Sử dụng công cụ sinh học phân tử để tăng tốc độ đánh giá đa dạng sinh học 6

1.1.2 Sự không đồng nhất của môi trường và ảnh hưởng của nó đến đa dạng sinh học 11

1.1.3 Chrysomelidae là đối tượng thích hợp để áp dụng công cụ sinh học phân tử trong đánh giá đa dạng sinh học và nghiên cứu sự phụ thuộc lẫn nhau trong hệ sinh thái .12

1.1.3.1 Tình hình nghiên cứu Chrysomelidae ở Việt Nam 14

1.1.3.2 Tình hình nghiên cứu Chrysomelidae trên thế giới 15

1.2 Khái quát về điều kiện tự nhiên – kinh tế xã hội của khu vực nghiên cứu 16

1.2.1 Vị trí địa lý 17

1.2.2 Địa hình 17

1.2.3 Khí hậu, thủy văn 18

1.2.4 Đặc điểm sinh thái thảm thực vật 20

1.2.5 Hệ động, thực vật 21

Chương 2: PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 23

2.1 Phương pháp thu mẫu và phân chia sinh cảnh ở VQG Núi Chúa 23

2.1.1 Thiết kế và thu thập mẫu vật 23

2.1.2 Phân chia sinh cảnh trong khu vực thu mẫu ở VQG Núi Chúa 27

2.2. Phương pháp sinh học phân tử: 27

2.3 Phương pháp xác định loài Chrysomelidae 29

2.4 Phương pháp xác định thức ăn của các loài Chrysomelidae ở VQG Núi Chúa 31

2.5 Đánh giá độ giàu loài tiềm năng của Chrysomelidae ở VQG Núi Chúa 31

2.6 Nhóm các phương pháp xác định mối liên quan của Chrysomelidae với điều kiện môi trường 31

2.6.1 Phân tích biến động của quần xã Chrysomelidae theo không gian 31

2.6.2.Phân tích sự sắp xếp hợp quy chuẩn (CCA) để tìm ra nhân tố tác động tới mối liên hệ giữa Chrysomelidae và thực vật chủ của chúng 31

2.6.3 Đánh giá đa dạng beta của mối tương tác giữa các loài Chrysomelidae và thực vật chủ của chúng theo độ cao (sinh cảnh) 32

2.6.4 Phân tích mô hình của mạng lưới tương tác giữa các loài Chrysomelidae và thực vật chủ của chúng 33

Chương 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 34

3.1 Phân định vùng chuyển tiếp sinh thái 34

3.2 Đa dạng loài Chrysomelidae thu được ở VQG Núi Chúa 35

3.2.1 Đa dạng loài Chrysomelidae thu được ở VQG Núi Chúa dựa trên đặc điểm hình thái 35

3.2.2 Đa dạng loài Chrysomelidae thu được ở VQG Núi Chúa dựa trên dữ liệu ADN 43

3.2.3 Tiềm năng đa dạng loài Chrysomelidae đạt được ở VQG Núi Chúa 49

3.2.4 Đánh giá độ giàu loài của Chrysomelidae ở VQG Núi Chúa 50

3.3 Thực vật chủ của Chrysomelidae 52

3.4 Sự biến đổi của quần xã Chrysomelidae và thức ăn của chúng theo sự thay đổi độ cao ở VQG Núi Chúa 62

3.4.1 Cấu trúc của quần xã Chrysomelidae xuyên qua không gian và độ cao ở VQG Núi Chúa .62

3.4.1.1 Ảnh hưởng của mô hình “mid-domain” (sự chiếm cứ giữa lãnh thổ) tới Chrysomelidae ở VQG Núi Chúa 62

3.4.1.2 Sự biến động của quần xã Chrysomelidae theo không gian 64

3.4.2 Sự thay đổi của tương tác giữa Chrysomelidae và thực vật chủ theo sự thay đổi của độ cao 71

3.4.2.1 Sự sắp xếp phù hợp với quy chuẩn 71

3.4.2.2 Đa dạng beta của tương tác Galerucinae và thực vật chủ theo sự thay đổi độ cao ở

VQG Núi Chúa 73

3.4.3 Hoạt động bảo tồn ở VQG Núi Chúa cần chú ý đến sự mất môi trường sống của quần xã Chrysomelidae 79

KẾT LUẬN 80

KIẾN NGHỊ 81

DANH SÁCH TÀI LIỆU TRÍCH DẪN 82

DANH SÁCH CÁC CÔNG BỐ 103

PHỤ LỤC 104

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT

ADN: Acid deoxyribonucleic

AFLP: Đa hình chiều dài đoạn cắt khuếch đại

ARN: Acid Ribonucleic

bPTP: Mô hình Poisson Tree Processes

Cây “ultrametric”: Cây quan hệ họ hàng mà tất cả chiều dài từ rễ tới đỉnh là bằng nhau Cây ML: Cây quan hệ họ hàng có khả năng xảy ra nhất

CCA: Phân tích sự sắp xếp hợp quy chuẩn

Chi-sq: Giá trị phân phối khi bình phương

COI: Gen Cytochrome c oxidase subunit I

cpDNA: ADN lục lạp

GenBank: Ngân hàng gen

GMYC: Mô hình Generalized Mixed Yule-Coalescent

Haplotype: Dạng đơn bội

ITS: Vùng sao chép bên trong Ribosome nhân

Loài singleton: Loài chỉ thu được một cá thể

Mmid-domain: Sự chiếm cứ giữa lãnh thổ

p- distance: Khoảng cách cặp so sánh

PCR: Phản ứng khuếch đại gen

RFLP: Đa hình chiều dài đoạn cắt giới hạn

RAPD: Đa hình khuếch đại ngẫu nhiên

SC: Mô hình tiến hóa đồng hồ nghiêm ngặt (Strict clock)

SSR: Lặp lại trình tự đơn giản

ULN: Mô hình tiến hóa đồng hồ tự do thông thường (Unstrict lognomal clock)

VIF: Yếu tố làm tăng sự khác nhau

VQG: Vườn Quốc Gia

βOS: Sự không giống nhau của tương tác hình thành giữa các loài chia sẻ

βrepl: Đa dạng beta của các loài thay thế

βrich: Đa dạng beta của các loài mất đi/tăng lên

βS: Sự không giống nhau trong thành phần loài của quần xã

βsim: Đa dạng beta của thành phần các loài thay thế

βsne: Đa dạng beta của thành phần các loài tạo ổ

βST: Sự không giống nhau của các tương tác do các loài thay thế

βtotal: Đa dạng beta tổng phản ánh cả loài thay thế và loài mất đi/tăng thêm

βWN: Sự không giống nhau của các tương tác trong hai sinh cảnh

GIẢI THÍCH THUẬT NGỮ Loài thay thế: Là những loài xuất hiện ở vị trí mới và thay thế loài mất đi ở vị trí

cũ (số loài thay thế bằng số loài mất đi)

Loài tạo ổ: Là những loài là tập hợp con của những loài thu được ở vị trí có nhiều loài hơn

Loài mất đi: Là loài xuất hiện ở vị trí cũ nhưng lại không xuất hiện ở vị trí mới Loài tăng thêm: Là loài xuất hiện ở vị trí mới mà vị trí khác không có

Loài chia sẻ: Là loài giống nhau giữa các vị trí so sánh

Loài bPTP: Là loài xác định được bằng phương pháp Mô hình Poisson Tree Processes (bPTP)

Bộ ba mã vạch: Là một phương pháp phân loại sử dụng một đoạn gen ngắn trong ADN của sinh vật để xác định sinh vật đó là thuộc về một loài riêng biệt

DANH LỤC CÁC BẢNG

Bảng 2.1: Tọa độ các vị trí thu mẫu ở VQG Núi Chúa……….25 Bảng 3.1: Đa dạng loài Chrysomelidae trong các tuyến điều tra và theo độ cao ở VQG Núi Chúa………43 Bảng 3.2: Kết quả phân định loài dựa trên trình tự ADN gen cox1 của Chrysomelidae ở VQG Núi Chúa theo các thuật toán và mô hình khác nhau ……… 44 Bảng 3.3: Sự không đồng thuận giữa loài hình thái và loài bPTP của Chrysomelidae ở VQG Núi Chúa ……… 45 Bảng 3.4: Dự đoán đa dạng loài Chryromelidae đạt được trong các tuyến thu mẫu, trong các sinh cảnh và trong toàn bộ khu vực nghiên cứu ở VQG Núi Chúa …… 50 Bảng 3.5: Nhận dạng phân loại học của các trình tự ADN lục lạp psbA-TrnH của thực vật chủ của các cá thể thuộc phân họ Galerucinae đạt được từ chương trình BAGpipe 54 Bảng 3.6: Số cá thể, số trình tự ADN vùng psbA-trnH và số họ thực vật chủ của các

loài thuộc phân họ Galerucinae ở khu vực nghiên cứu ……… 59

Bảng 3.7: So sánh cấu trúc của quần xã Chrysomelidae giữa các tuyến thu mẫu ở VQG Núi Chúa……… 65 Bảng 3.8: Kết quả phân tích CCA của riêng từng biến số đến tương tác giữa các loài Galerucinae và thực vật chủ ở khu vực nghiên cứu……… 73 Bảng 3.9: Sự không giống nhau của quần xã Galerucinae và quần xã thực vật chủ giữa rừng khô và rừng ẩm ở khu vực nghiên cứu……… 73 Bảng 3.10: So sánh đặc điểm cấu trúc của mạng lưới tương tác giữa các loài Galerucinae và thực vật chủ trong hai sinh cảnh khô và ẩm ở khu vực nghiên cứu… 78

DANH LỤC CÁC HÌNH

Hình 1.1: Vị trí của gen COXI trong gen ty thể……… 8

Hình 1.2: Sơ đồ VQG Núi Chúa………19

Hình 2.1: Thu mẫu ở khu vực nghiên cứu……….24

Hình 2.2: Sơ đồ thu mẫu Chrysomelidae ở VQG Núi Chúa ……….26

Hình 3.1: Mô hình phân bố nhiệt trung bình/năm theo độ cao ở khu vực Núi Chúa….34 Hình 3.2: Mô hình phân bố loài giống nhau và loài đơn nhất dọc theo độ cao ở khu vực nghiên cứu ……….35

Hình 3 3: Xác định loài dựa trên cây mtADN của Chrysomelidae (loài từ 001 đến 069) ở VQG Núi Chúa………47

Hình 3.4: Xác định loài dựa trên mtADN của Chrysomelidae (các loài từ 070-155) ở VQG Núi Chúa……… 49

Hình 3.5: Sự sắp xếp phân loại học của trình tự ADN thức ăn của Galerucinae (loài số 87) theo chương trình BAGpipe……….53

Hình 3.6: Tương tác giữa Galerucinae và thực vật chủ của chúng ở khu vực nghiên cứu ………60

Hình 3.7: Mạng lưới tương tác giữa Galerucinae và thực vật chủ ở khu vực nghiên cứu ……… 62

Hình 3.8: Sự thay đổi đa dạng loài alpha của Chrysomelidae dọc theo độ cao ở VQG Núi Chúa ……… 64

Hình 3.9: So sánh đa dạng beta của Chrysomelidae theo không gian ở VQG Núi Chúa .69

Hình 3.10: Phân tích sự sắp xếp hợp quy chuẩn của các biến số tới tương tác giữa các loài Galerucinae và thực vật chủ ở trong khu vực nghiên cứu……… 72

Hình 3.11a: Mạng lưới tương tác giữa các loài Galerucinae và thực vật chủ trong hai sinh cảnh ở VQG Núi Chúa ……… 76

Hình 3.11b: Đồ thị tương tác giữa Galerucinae và thực vật chủ trong hai sinh cảnh ở VQG Núi Chúa……… 77

MỞ ĐẦU 1.1 Lý do chọn đề tài

Các quần xã sinh vật không phải là các đơn vị độc lập, mà là những mảnh ghép của bức tranh môi trường tự nhiên, và có sự phụ thuộc lẫn nhau Trong đó, quần xã thực vật có liên quan chặt chẽ đến tính chất vật lý của môi trường như nhiệt độ, độ ẩm, bức

xạ mặt trời…Các nhân tố vật lý này thay đổi theo độ cao, sẽ kéo theo sự thay đổi trong cấu trúc của quần xã thực vật Về phần mình, thực vật là thức ăn của nhiều loại côn trùng, có vai trò quyết định trong sự đa dạng cũng như sự phân bố của chúng Nghiên cứu về phản ứng của côn trùng ăn thực vật với sự thay đổi của quần xã thực vật theo độ cao sẽ giúp chúng ta hiểu biết rõ hơn về mối quan hệ phụ thuộc lẫn nhau trong hệ sinh thái

Bọ cánh cứng ăn lá (Chrysomelidae) là một họ lớn nhất trong bộ cánh cứng (Coleoptera) Thức ăn của Chrysomelidae là thực vật, vì vậy chúng có liên kết chặt chẽ với thực vật trong toàn bộ đời sống và việc thu bắt mẫu của chúng tương đối đơn giản

Do đó, Chrysomelidae là nhóm côn trùng phù hợp làm đối tượng cho việc nghiên cứu sự phụ thuộc của các quần xã sinh vật trong hệ sinh thái

Vườn Quốc Gia (VQG) Núi Chúa bao gồm diện tích rừng bán khô hạn độc đáo nhất Việt Nam và quần xã thực vật ở đây có sự thay đổi rõ rệt theo độ cao từ rừng khô trên đất thấp, qua rừng chuyển tiếp (rừng bán ẩm) tới rừng ẩm thường xanh trên núi cao

Vì vậy, VQG Núi Chúa là địa điểm lý tưởng để thực hiện nghiên cứu của luận án

Vì tất cả các lý do trên tôi chọn đề tài “Nghiên cứu đa dạng của họ bọ cánh

cứng ăn lá (Chrysomelidae) và mối quan hệ của chúng với thực vật trong điều kiện môi trường của vườn quốc gia Núi Chúa, tỉnh Ninh Thuận, Việt Nam bằng phương pháp sinh học phân tử”

1.2 Mục tiêu của đề tài

Đánh giá sự đa dạng loài và sự biến động theo không gian của họ Chrysomelidae ở VQG Núi Chúa

Xác định thức ăn của các loài họ Chrysomelidae và đánh giá sự thay đổi thức ăn của chúng theo không gian

1.3 Nội dung nghiên cứu

Sử dụng bộ ba mã vạch ADN để đánh giá sự đa dạng loài của họ Chrysomelidae

1.4 Đối tượng nghiên cứu

Đối tượng nghiên cứu là các loài trong họ Chrysomelidae thuộc bộ cánh cứng (Coleoptera) và thức ăn của chúng

1.5 Phạm vi nghiên cứu

Đề tài đánh giá đa dạng loài và tương tác loài của Chrysomelidae theo không gian thay đổi từ rừng khô trên đất thấp tới rừng ẩm ở độ cao trên 300 m so với mức nước biển, trong khu vực khoảng 10 km2 của Vườn Quốc Gia Núi Chúa, nằm trên địa bàn 02 huyện Ninh Hải và Thuận Bắc, tỉnh Ninh Thuận, phía Nam Việt Nam

1.6 Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài

1.6.1 Ý nghĩa khoa học

Đây là nghiên cứu đầu tiên về quần xã Chrysomelidae ở VQG Núi Chúa Kết quả của nghiên cứu cho phép đánh giá sự đa dạng quần xã Chrysomelidae ở VQG Núi Chúa, khám phá một số loài mới cho khoa học và ghi nhận thực vật chủ của một số nhóm loài của họ Chrysomelidae

1.6.2 Ý nghĩa thực tiễn của đề tài

Kết quả của luận án cung cấp thông tin để hiểu rõ hơn về cấu trúc của đa dạng sinh học và nguy cơ làm mất đa dạng sinh học ở vùng nhiệt đới, từ

đó có thể rút ra những nhận thức có liên quan đến bảo tồn

Chương 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 Các vấn đề liên quan đến luận án

1.1.1 Sử dụng công cụ sinh học phân tử để đánh giá đa dạng sinh học

1.1.1.1 Đa dạng sinh học và những vấn đề liên quan

Định nghĩa đa dạng sinh học: Theo Luật Đa dạng sinh học (2008) thì “Đa dạng

sinh học là sự phong phú về gen, loài sinh vật và hệ sinh thái trong tự nhiên” Ba cấp

độ này làm việc cùng nhau để tạo ra sự phức tạp của sự sống trên Trái đất [1]

Sự đa dạng di truyền ở cấp độ cơ bản nhất của nó được thể hiện bởi sự khác biệt trong trình tự của các nucleotide (adenine: A, cytosine: C, guanine: G, thymine: T…) hình thành nên ADN trong các tế bào của sinh vật ADN được chứa trong các nhiễm sắc thể có mặt trong tế bào; một số nhiễm sắc thể được chứa trong các bào quan của tế bào (ví dụ, các nhiễm sắc thể của ty thể và lục lạp) Mỗi một gen là một đoạn của ADN nằm trên nhiễm sắc thể và quy định một đặc tính cụ thể của một sinh vật

Whittaker (1972) đưa ra 3 khái niệm đa dạng trong sinh thái học: đa dạng alpha,

đa dạng bê ta và đa dạng gamma Đa dạng alpha đánh giá đa dạng cho tập hợp mẫu từ một quần xã nhất định Đa dạng beta đánh giá sự thay thế loài hay sự thay đổi thành phần sinh vật khi chuyển từ quần xã này sang quần xã khác Đa dạng gamma đánh giá

sự phong phú loài của một loạt sinh cảnh (một cảnh quan, một khu vực địa lý hoặc một hòn đảo), nó là hệ quả của đa dạng alpha của các quần xã thành phần và của đa dạng beta giữa chúng [2]

Mora et al (2011) dự đoán có khoảng 8,7 triệu (± 1,3 triệu) loài có nhân trên toàn cầu; trong đó có khoảng 2,2 triệu (± 0,18 triệu) là sống dưới biển Họ cho rằng khoảng 86% các loài đang tồn tại trên trái đất và 91% các loài trong đại dương vẫn đang chờ đợi mô tả [3] Đến nay, tổng số loài mô tả được chấp nhận trên thế giới được ước tính là gần 1.900.000 loài và có khoảng 18.000 loài mới được miêu tả mỗi năm (năm 2007) (Chapman 2009) [4] Nhiều loài đã tuyệt chủng trong lịch sử địa chất của trái đất Lý do chính cho những sự tuyệt chủng là sự thay đổi môi trường hoặc sự cạnh tranh sinh học Tỷ lệ tuyệt chủng gây ra bởi con người lớn hơn tỷ lệ tuyệt chủng tự nhiên của chúng khoảng từ 1.000 đến 10.000 lần Hiện nay, sự tác động của con người

gây ra sự tuyệt chủng của các loài sinh vật trên trái đất là một trong những vấn đề môi trường lớn nhất đối với nhân loại (Pidwirny, 2015) [5]

Đánh giá đa dạng sinh học: Trong ba cấp độ đa dạng sinh học, cấp độ đa dạng

loài gần như được áp dụng chủ yếu trong nghiên cứu sinh thái và bảo tồn sinh học, mặc

dù các mức độ đa dạng của bậc phân loại cao hơn (chi, họ, bộ) hoặc mô hình đa dạng tiến hóa đôi khi cũng được coi là đặc biệt hữu ích trong nghiên cứu cổ sinh vật học (Foote 1997; Roy et al 1996; Raup và Sepkoski 1984) [6, 7, 8] Do đó, các nhà sinh vật học thường đánh giá đa dạng sinh học thông qua đánh giá độ giàu loài Có hai phương pháp chính để đánh giá độ giàu loài: (1) phương pháp đánh giá mang tính định tính bao gồm đa dạng loài alpha là tổng số loài trong một quần xã có trong một hệ sinh thái cụ thể Tính đa dạng beta mô tả mức độ dao động thành phần loài khi các yếu tố môi trường thay đổi Tính đa dạng gamma áp dụng cho những khu vực rộng lớn hơn về mặt địa lý Trong thực tế, ba chỉ số đa dạng này thường liên quan chặt chẽ với nhau (2) Phương pháp đánh giá mang tính định lượng bao gồm đánh giá số lượng cá thể hay sinh khối của một loài, hay mật độ loài, đó là số lượng mỗi loài trong khu vực hay đơn

vị thu mẫu, ví dụ như số lượng các loài trên một mét vuông (Magurran 2013) [9] và các chỉ số sinh thái Độ giàu loài (số lượng các loài trong một khu nghiên cứu) đại diện cho một thước đo duy nhất nhưng quan trọng, nó có giá trị như sự phổ biến chung của đa dạng sự sống nhưng nó phải được tích hợp với các số liệu khác để nắm bắt đầy đủ các mặt của đa dạng sinh học Chỉ số sinh thái sử dụng số liệu định lượng để đo lường các khía cạnh của đa dạng sinh học, điều kiện sinh thái, sự có lợi, hoặc sự điều khiển các thay đổi, nhưng không có chỉ số sinh thái đơn lẻ để nắm bắt tất cả các mặt của đa dạng sinh học Lý tưởng nhất, để đánh giá các điều kiện và xu hướng của đa dạng sinh học trên toàn cầu hoặc phần nhỏ hơn là đo lường sự phong phú của tất cả các sinh vật theo không gian và thời gian, sử dụng phân loại (chẳng hạn như số lượng các loài), đặc điểm chức năng (ví dụ cây cố định nitơ như đậu so với cây không cố định nitơ), và sự tương tác giữa các loài có ảnh hưởng đến động lực và chức năng của chúng (ví dụ ăn thịt, ký sinh, cạnh tranh, giúp thụ phấn, và ảnh hưởng của những tương tác này đến hệ sinh thái như thế nào) Thậm chí quan trọng hơn sẽ là đánh giá sự dịch chuyển của đa

dạng sinh học trong không gian hoặc thời gian Hiện nay, chúng ta không thể làm được điều này với độ chính xác cao bởi vì các số liệu còn thiếu

Khủng hoảng đa dạng sinh học: là sự mất đi của gen, các loài và các hệ sinh

thái Mooney (2010) cho thấy ví dụ về các tổn thất to lớn về sự mất đa dạng sinh học ở tất cả các cấp của sinh vật từ gen, các loài đến hệ sinh thái và toàn bộ cảnh quan [10]

Từ thế kỷ 17, có ít nhất 717 loài động vật và 87 loài thực vật đã mất đi Ngày nay, hơn 17.000 loài thực vật và động vật có nguy cơ cùng số phận (Danh sách đỏ IUCN) Vos

et al (2015) ước tính rằng sự mất đi trong tự nhiên có thể gần với tỷ lệ 0,1 loài trên một triệu loài trên một năm và do đó tỷ lệ tuyệt chủng hiện nay là cao hơn 1000 lần so với tỷ lệ tự nhiên và trong tương lai có thể sẽ cao hơn 10.000 lần [11] Levin (2002) cho thấy rằng trung bình cứ 20 phút có một loài trên trái đất bị mất đi Sinh thái học ước tính rằng một nửa của tất cả các loài chim đang sống và động vật có vú sẽ biến mất trong vòng 200 hoặc 300 năm [12] Nhân tố chính cho sự thay đổi đa dạng sinh học trong tương lai bao gồm sự thay đổi trong sử dụng đất, biến đổi khí hậu, lắng đọng Ni

tơ, trao đổi sinh học và hấp thụ khí CO2 (Sala et al., 1997) [13]

Hậu quả của sự tuyệt chủng có thể phá vỡ quá trình sinh thái quan trọng như thụ phấn và phát tán hạt giống, dẫn đến sự mất mắt xích trong lưới và chuỗi thức ăn dẫn đến sự sụp đổ của hệ sinh thái và làm cho tăng tỷ lệ tuyệt chủng tổng thể (Sodhi et al 2009) [14] Sau khi hiện tượng tuyệt chủng bùng phát này kết thúc, số lượng loài cũng

có thể trở lại như mức trước nhưng chắc chắn sẽ có ít hơn nhóm phân loại bậc cao hơn

so với hiện tại Một sự thay đổi quy mô như vậy trong hệ sinh vật của trái đất sẽ làm nghèo đa dạng sinh học trên hành tinh trong nhiều triệu năm tới (Levin 2002) [12]

Trở ngại phân loại trong nghiên cứu đa dạng sinh học: Phân loại thường được

nhắc đến là sự mô tả lý thuyết và thực hành, đặt tên và sắp xếp có hệ thống các sinh vật sống Công việc này là cần thiết cho sự hiểu biết cơ bản về đa dạng sinh học và bảo tồn Việc thiếu tên khoa học và những khó khăn trong việc xác định loài trong nghiên cứu sinh thái là "trở ngại phân loại" (New, 1984) [15] Điều này đang có ảnh hưởng rất lớn cho khoa học bảo tồn Nhiều loài sẽ bị tuyệt chủng trước khi chúng được mô tả và chúng ta vẫn tiếp tục không biết chính xác có bao nhiêu loài trên hành tinh của chúng

ta Các "trở ngại phân loại" đã dẫn tới sự hiểu biết không đầy đủ về phần lớn đa dạng sinh học toàn cầu

Như vậy, với sự đa dạng loài rất cao trên hành tinh của chúng ta, có rất nhiều loài đang chờ được mô tả trong khi có nhiều trở ngại trong việc định danh loài, nhiều loài có nguy cơ bị tuyệt chủng trước khi được mô tả Điều này dẫn đến chúng ta sẽ đánh giá đa dạng sinh học không được chính xác và các nhà khoa học đã tìm ra công

cụ hữu dụng giúp đánh giá đa dạng sinh học nhanh và chính xác, đó là công cụ sinh học phân tử

1.1.1.2 Sử dụng công cụ sinh học phân tử để tăng tốc độ đánh giá đa dạng sinh học

Sử dụng công cụ sinh học phân tử để đánh giá đa dạng loài

Như đã đề cập ở trên, có ba cấp độ đa dạng sinh học: Đa dạng loài, đa dạng di truyền và đa dạng hệ sinh thái Sinh học phân tử là một lĩnh vực của sinh học liên quan đến quá trình phiên mã gen cho sản phẩm acid Ribonucleic (ARN), sự dịch mã của ARN thành protein và vai trò của những protein thể hiện trong chức năng tế bào (https://www.news-medical.net/life-sciences/Molecular-Biology-Techniques.aspx#)

Mục đích chính của những kỹ thuật sinh học phân tử là có được trình tự ADN của gen mục tiêu Những bước chính là: (1) tách triết ADN mục tiêu, (2) khuếch đại đoạn ADN mục tiêu (PCR) và (3) giải trình tự ADN: là việc xác định thứ tự của các nucleotide A, G, C và T có trong một phân đoạn của ADN mục tiêu Hiện nay, kỹ thuật giải trình tự nhuộm màu là phương pháp chuẩn trong phân tích trình tự ADN Đến nay, kỹ thuật giải trình tự thế hệ tiếp theo (NGS) đã được áp dụng trong một loạt các trường hợp, bao gồm cả trình tự cả hệ gen, các trình tự mục tiêu, phát hiện vị trí ràng buộc của các yếu tố phiên mã và sự biểu hiện sao chép đa hình của ARN không

mã hóa Tùy thuộc vào mục tiêu của nhà khoa học nhưng mục đích cuối cùng là nhận được trình tự của ADN để so sánh giữa chúng với nhau

Mã vạch ADN dựa trên gen ty thể (thường xuyên nhất gen Cytochrome oxidase subunit I: COI) đã nổi lên như một công cụ hữu ích để xác định các loài động vật Mã vạch ADN được sử dụng như một công cụ hiệu quả cho cả việc xác định các loài đã biết và phát hiện ra những loài mới (Hebert et al 2003, 2010, Savolainen et al 2005) [16, 17, 18] Ban đầu, mã vạch ADN đã được đề xuất cho giới động vật vào năm 2003,

khi Hebert và các đồng nghiệp đã thử nghiệm một mã vạch gen đơn để xác định loài và đặt ra thuật ngữ "mã vạch ADN" (Hebert et al 2003) [16] Kể từ thời điểm đó trình tự gen COI đã được sử dụng như là tác nhân định danh trong phần lớn các ngành động vật bao gồm động vật có xương sống (Hebert et al 2004, Ward et al 2005, Kerr et al

2007, Smith et al 2005, Nijman và Aliabadian 2010) [19, 20, 21, 22, 23] và động vật không xương (Hajibabaei et al 2006, Bucklin et al 2011, Hausmann et al 2011) [24,

25, 26] Trong những năm gần đây, các tiện ích thiết thực của mã vạch ADN chứng tỏ

là một công cụ hấp dẫn để giúp giải quyết sự mơ hồ trong phân loại (Hebert et al 2004, 2010) [17, 19], đánh giá đa dạng sinh học (Plaisance et al 2009, Naro-Maciel et al

2009, Grant et al 2011) [27, 28, 29], và trong nghiên cứu sinh học bảo tồn (Neigel et

al 2007, Rubinoff 2006, Dalton và Kotze 2011) [30, 31, 32] Mã vạch ADN có thể cung cấp thêm cơ sở dữ liệu giúp phân loại loài được chính xác hơn (Thompson et al 2012) [33] Thứ hai, mã vạch ADN có thể giúp xác định loài trong những trường hợp việc định loại chỉ được thực hiện tới mức chi hoặc họ Thứ ba, dữ liệu di truyền thu thập cho mã vạch ADN thường bao gồm các biến đổi trong một loài, chúng cho phép phân tích theo hướng mức độ thấp của quần thể bao gồm cả việc phát hiện các cấu trúc

di truyền, và trong một số trường hợp là theo dõi biến động quần thể (Nagy et al 2013) [34] Mã vạch ADN cũng có thể được áp dụng như là công cụ để giải quyết các câu hỏi

cơ bản về sinh thái, tiến hóa và sinh học bảo tồn (Kress et al 2014) [35]

Mã vạch ADN là một hoặc vài chuỗi gen tương đối ngắn lấy từ một phần của bộ gen tiêu chuẩn và được sử dụng để xác định loài Một gen được sử dụng làm gen mã vạch ADN phải thỏa mãn ba tiêu chuẩn: (1) Có sự khác nhau và sự biến đổi gen có ý nghĩa ở cấp độ loài; (2) có vị trí sườn (flanking) bảo tồn để phát triển mồi PCR chung

áp dụng cho số lượng phân loại học lớn; (3) có độ dài tương đối ngắn để dễ dàng tách chiết và khuếch đại ADN (Kress và Erickson 2008) [36] Một trình tự ADN ngắn của

600 cặp bazơ trong gen mã hóa ty thể COI đã được chấp nhận như là chuẩn, mã vạch ADN cấp độ loài thiết thực cho nhiều nhóm động vật (Hebert et al 2003) [16]

Hình 1.1: Vị trí của gen COXI trong gen ty thể (nguồn www.slideshare.net/GullFatima/dna-barcoding-in-animals-71007134)

Mã vạch ADN trên nhiễm sắc thể hiện nay thường được sử dụng nhiều nhất cho thực vật Hai vùng ADN được định nghĩa là 'mã vạch lõi' gồm rbcLa và matK đã được chuẩn hóa như mã vạch ADN cho thực vật trên cạn (CBOL Plant Working Group 2009) Ngoài các mã vạch lõi, hai khu vực khác, trnH-psbA và nrITS đã được đề xuất như mã vạch ADN bổ sung cho thực vật (Hollingsworth et al 2011, Li et al 2011) [37, 38] Lý do cho việc áp dụng hai vùng này (rbcLa và matK) là mức độ cao của khả năng thu được các trình tự có chất lượng cao và mức độ cho phép phân biệt loài (Burgess et

al 2011) [39] Gere et al (2013) kết hợp trnH-psbA với mã vạch ADN nhân đã cải thiện đáng kể phân biệt loài trong họ Bàng (Combretaceae) ở miền nam châu Phi, kết quả của họ cũng cho thấy sự thành công của mã vạch ADN trong phân biệt các loài có quan hệ gần [40] Ballardini et al (2013) đề nghị các gen ADN ở lục lạp psbZ-trnfM

như một dấu hiệu mã vạch tiềm năng ở chi Phoenix [41] Gen 16S rRNA, COI, và

cpn60 bình thường có thể được sử dụng như là dấu hiệu cho việc phát triển mã vạch ADN của vi khuẩn (Purty và Chatterjee 2016) [42] ITS có thể đưa ra một sự khác biệt quan trọng trong sự hoàn thành của nó như là một mã vạch cho nấm (Dentinger et.al., 2011) [43]

Mã vạch ADN sẽ có nhiều ứng dụng cho sự sống ở biển: nhận dạng các ấu trùng, các loài xâm lấn, loài bí ẩn, các loài mới, sự buôn bán trái phép của loài được bảo vệ, quản lý vật nuôi, đánh giá đa dạng sinh học, giám sát hệ sinh thái, tu chỉnh lại các loài đã biết, suy luận của các mối quan hệ phát sinh loài, phát sinh địa lý và mô hình hình thành loài (Radulovici, Archambault và Dufresne 2010) [44] Smith et al (2005) chứng minh mã vạch ADN giúp giải quyết sự thất bại của phương pháp kiểm kê hiện tại để nhanh chóng đáp ứng nhu cầu cấp bách đánh giá đa dạng sinh học, đặc biệt trong việc đánh giá sự phong phú và sự thay thế khi chuyển đổi cảnh quan với đơn vị phân loại đa dạng cao và sử dụng mã vạch ADN trong sự hợp tác với các nhà phân loại

sẽ cung cấp các bản đồ quy mô thiết yếu để đánh giá đa dạng sinh học ở quy mô mà quyết định bảo tồn được thực hiện [22]

Đối với các mẫu trong bộ sưu tập lịch sử tự nhiên, mã vạch ADN có một vai trò quan trọng, nó cung cấp một cách đơn giản để xác minh, một phương pháp để định danh mẫu vật và phát hiện các mục cơ sở dữ liệu không chính xác Ngoài ra, mã vạch ADN cung cấp một phương pháp đơn giản ở thực địa, trong đó một miếng gạc hoặc mẫu sinh thiết, kết hợp với dữ liệu địa phương và những hình ảnh chính xác, sẽ là đủ

để nhận dạng sơ bộ các loài (Chambers và Hebert 2016) [45] Mã vạch ADN có thể sử dụng như một công cụ phân tử quan trọng để đánh giá đa dạng sinh học và bảo tồn các loài bò sát (Trivedi et al.2016) [46]

Do đó, các cơ sở dữ liệu trình tự của axit Nucleotide quốc tế (như GenBank…)

đã thông qua từ khóa nhận dạng duy nhất (Barcode) để nhận ra các chuỗi mã vạch tiêu chuẩn theo quy định của cộng đồng khoa học (ví dụ Consortium for the Barcode of Life (CBOL)) Sự ra đời của mã vạch ADN là một sự bổ sung tự nhiên với thời kỳ hậu

di truyền, trong đó trình tự của toàn bộ gen đã cung cấp một số lượng lớn các thông tin trình tự từ một số lượng loài hạn chế Mã vạch ADN có thể giúp mở rộng kiến thức của chúng ta bằng cách khám phá nhanh chóng nhiều loài hơn và không tốn kém Các kết

quả thu được từ các nghiên cứu mã vạch ADN sau đó có thể giúp chúng ta xác định loài là những mục tiêu tốt cho phân tích di truyền chi tiết hơn (Hajibabaei et al 2007) [47]

Sử dụng công cụ sinh học phân tử trong nghiên cứu tương tác sinh thái

Các phương pháp phổ biến nhất xác định thức ăn của côn trùng bao gồm: 1) quan sát trực tiếp côn trùng ăn thực vật tại thực địa; 2) thử nghiệm cho ăn (Barone 1998) [48]; 3) phân tích thành phần thức ăn trong ruột; và 4) kỹ thuật đồng vị ổn định (Joern và Parker, 1978; Otte và Joern, 1976) [49, 50] Tuy nhiên, việc xác định thức ăn của các loài côn trùng bằng việc sử dụng các phương pháp này gặp nhiều khó khăn Quan sát hiện trường sẽ khó thực hiện nếu khu vực nghiên cứu hiểm trở, chẳng hạn như rừng ở núi dốc và cao Quan sát trực tiếp cũng bị giới hạn bởi khả năng của nhà nghiên cứu để xác định chính xác các loài liên quan đến các tương tác (Hebert et al

2004) [19] Trong các thử nghiệm cho ăn, côn trùng thường ăn các loại thức ăn khác

với thức ăn khi chúng sống trong tự nhiên, và do đó mức độ tiêu thụ của côn trùng có thể bị đánh giá quá cao (Barone, 1998) [48] Đối với các phương pháp phân tích thành phần thức ăn trong ruột và đồng vị ổn định, việc xác định thông tin về phân loại và /

hoặc sinh thái thường rất hạn chế

Gần đây nhiều nhà khoa học đã sử dụng phương pháp khác để xác định thức ăn của côn trùng, đó là sử dụng trình tự ADN thực vật trong ruột của côn trùng (Jurado-

Rivera et al., 2009; Navarro et al., 2010) [51, 52] Phương pháp này tách chiết ADN từ

mô của thực vật bị tiêu hóa bởi côn trùng ăn thực vật Một phần của ADN này sẽ được khuếch đại và giải trình tự, sau đó các trình tự gen này được dùng để xác định tên ở các bậc phân loại bằng cách so sánh với cơ sở dữ liệu tham khảo hiện tại như GenBank hoặc thư viện mã vạch ADN Kỹ thuật dựa trên ADN này cho phép chúng ta xác định thức ăn của côn trùng ăn cỏ mà không quan sát trực tiếp Hơn nữa, bởi vì kỹ thuật này nhắm vào ít mục tiêu, nó làm giảm khả năng bỏ qua mối quan hệ dinh dưỡng của côn trùng ăn thực vật Có nhiều nghiên cứu đã áp dụng phương pháp này để xác định thực vật chủ của những côn trùng ăn thực vật khi mà thực vật chủ của chúng hoàn toàn không được biết như García-Robledo et al 2013; Kishimoto-Yamada et al., 2013; Liu J

et al 2014 [53, 54, 55]

Như vậy sinh học phân tử là một công cụ hữu dụng trong việc đánh giá đa dạng sinh học, đặc biệt trong đánh giá đa dạng loài – cấp độ đa dạng được sử dụng nhiều nhất trong nghiên cứu sinh học, và tương tác loài (sinh thái học) Nó giúp đánh giá nhanh được đa dạng của một nhóm quần xã sinh vật trước khi chúng được mô tả dựa vào đặc điểm hình thái, giúp giải quyết sự thất bại của phương pháp kiểm kê hiện tại để nhanh chóng đáp ứng nhu cầu cấp bách đánh giá đa dạng sinh học Những điều này giúp cho dự đoán số loài trong tự nhiên nhanh và chính xác hơn

1.1.2 Sự không đồng nhất của môi trường và ảnh hưởng của nó đến đa dạng sinh học

Haller et al (2013) cho rằng, có hai loại mô hình không gian trên hành tinh của chúng ta: mô hình siêu quần thể, trong đó các cá thể sinh sống ở hai hoặc nhiều mảnh rời rạc khác nhau và mô hình không gian liên tục của dải biến đổi môi trường Theo tác giả, sự không đồng nhất về môi trường xuất phát từ hai yếu tố: đầu tiên là sự thay đổi của môi trường, tiếp đến là sự phân mảnh liên tục trong không gian, được mô

tả bởi biên độ và quy mô không gian của nó Cùng với nhau, các thành phần này tạo lên một loạt các cảnh quan với mô hình không đồng nhất Họ kết luận rằng tính không đồng nhất không gian, bằng cách tạo ra các chế độ lựa chọn khác nhau đã thúc đẩy sự

đa dạng, là một động lực quan trọng của sự hình thành loài [56]

Pausas và Austin (2001) xem xét lại mô hình giàu loài dọc theo dải biến đổi môi trường bằng các nghiên cứu trước đây Họ kết luận rằng hầu hết các nghiên cứu cho thấy một xu hướng tăng sự phong phú loài với nhiệt độ và nguồn nước, cũng như với

sự gia tăng không đồng nhất về môi trường Ngoài ra, hầu hết các nghiên cứu cho thấy

sự làm giàu dinh dưỡng dẫn đến giảm sự phong phú các loài Tuy nhiên, phản ứng khác nhau có thể quan sát được do sự tương tác giữa các tham số, bao gồm cả các yếu

tố nhiễu loạn và dao động quanh sự giới hạn nguồn tài nguyên dọc theo dải biến đổi môi trường [57] Jill et al (2009) điều tra mô hình phân bố của các loài chim ở vùng núi Tilaran của Costa Rica ở độ cao giữa 1.000 m và 1.700 m, nơi có một sự thay đổi

độ ẩm rõ nét Đa dạng beta cao đã được tìm thấy cho thấy sự thay đổi gần như hoàn toàn trong thành phần của quần xã sinh vật trong vài km trên sườn hướng về Thái Bình Dương Và sự thay đổi trong thành phần loài có liên quan với sự thay đổi về độ ẩm (và

liên quan tới sự bao phủ của thực vật bì sinh) ở những khoảng cách khác nhau trên sườn Thái Bình Dương [58] Yang et al, (2015) đã chứng minh rằng tác động của sự không đồng nhất môi trường lên sự phong phú các loài phụ thuộc vào vị trí của quần xã dọc theo dải biến đổi môi trường: ở hai đầu của dải biến đổi môi trường có một mối tương quan dương giữa tính đa dạng với sự không đồng nhất của môi trường, trong khi

đó ở giữa của dải biến đổi môi trường, không tồn tại một mối quan hệ như vậy [59] Arnan et al (2015) nhận thấy cả biến môi trường và biến không gian đóng góp đáng kể vào sự thay đổi tính đa dạng ở các bậc phân loại, phát sinh loài và chức năng ở cả quy

mô alpha và beta; trong đó cấu trúc không gian có ảnh hưởng rộng hơn [60]

Phân mảnh môi trường sống thường được định nghĩa như một quá trình ở quy

mô cảnh quan bao gồm cả môi trường sống bị mất đi và môi trường sống bị chia cắt Nghiên cứu thực nghiệm ngày nay cho thấy mất môi trường sống có ảnh hưởng xấu rộng và liên tục tới đa dạng sinh học Còn bản thân phân mảnh môi trường sống có ảnh hưởng ít hơn tới đa dạng sinh học (Fahrig 2003) [61]

Có nhiều nghiên cứu về sự thay đổi loài theo độ cao, nhưng hầu hết các nghiên cứu được thực hiện trong khu vực Nam và Trung Mỹ Các nghiên cứu này tập trung vào nhóm chân khớp giàu loài, cụ thể là côn trùng (24,5%), hầu hết là những nghiên cứu về cánh cứng và bướm (Brehm G & Fiedluk, 2004; Novotny et al 2005, Escobar et al 2006, García-López et al 2012 ) [62, 63, 64, 65], chỉ có một vài nghiên cứu về Chrysomelidae dọc theo độ cao (Sánchez-Reyes et al 2016, Bouzan et al 2015) [66, 67] Hầu hết các nghiên cứu đều cho kết quả rằng đa dạng loài thay đổi với độ cao

1.1.3 Chrysomelidae là đối tượng thích hợp để áp dụng công cụ sinh học phân tử trong đánh giá đa dạng sinh học và nghiên cứu sự phụ thuộc lẫn nhau trong hệ sinh thái

Trong lĩnh vực sinh học người ta dựa vào các sinh vật chỉ thị để đánh giá chất

lượng của môi trường (Noss 1990, Caro và O'Doherty 1999) [68, 69] Nhóm sinh vật được sử dụng như sinh vật chỉ thị môi trường đòi hỏi phải có sự đa dạng loài cao và có

sự đa dạng tương tác sinh thái Thông qua đánh giá đa dạng sinh học của nhóm sinh vật này (bao gồm đánh giá đa dạng loài và tương tác loài) sẽ giúp chúng ta mô tả được sự phụ thuộc lẫn nhau của các quần xã sinh vật trong hệ sinh thái Về đặc điểm này, đối

với các hệ sinh thái cạn, các loài côn trùng ăn cỏ là một nhóm thích hợp để tiến hành cuộc điều tra quy mô lớn về đa dạng sinh học và tương tác sinh thái (Stork and Habel 2014) [70] Trong đó Chrysomelidae là đối tượng thích hợp nhất trong bộ cánh cứng Coleoptera khi đánh giá đa dạng sinh học và chứng minh sự phụ thuộc lẫn nhau trong

hệ sinh thái Bởi vì, chúng đại diện cho một số lượng loài lớn, dễ thấy và rất đa dạng trong hoạt động ăn thực vật trong hệ sinh thái nhiệt đới và ôn đới Chrysomelidae là họ đa dạng nhất trong bộ cánh cứng với hơn 37.000 loài được mô tả, hầu hết các mô tả này là của các loài ở vùng Trung và Nam Mỹ (Bouchard et al 2009) [71] Nghiên cứu ở quy mô nhỏ trong rừng nhiệt đới cho thấy Chrysomelidae có tính

đa dạng cao, ví dụ: Thormann et al (2016) sử dụng mã vạch ADN khám phá 266 loài Chrysomelidae trong núi rừng của Vườn Quốc gia Podocarpus và khu dự trữ Reserva Biologica San Francisco liền kề ở phía nam Ecuador [72]; 157 loài Chrysomelidae được khám phá trong rừng rụng lá nhiệt đới ở Peregrina Canyon của bang Tamaulipas

ở đông bắc Mexico (Sancher- Reyes et al., 2014) [73]; 60 loài thuộc phân họ Alticinae được ghi nhận ở Antalya và 57 loài thuộc phân họ Alticinae được ghi nhận ở Isparta của Thổ Nhĩ Kỳ (Aslan, 2010; Aslan và Ayvaz, 2009) [74, 75]; 253 loài Chrysomelidae được ghi nhận trong 0,8 ha rừng nhiệt đới ở Panama (Charles và Bassett, 2005) [76] hoặc 1.073 loài trên toàn bộ lãnh thổ của Malaysia (Mohamedsaid 2004) [77] Thêm vào đó, chúng cho thấy một sự đa dạng đáng chú ý của việc ăn thực vật (từ lá đến gốc) cũng như mức độ chuyên môn hóa khác nhau, từ loài ăn một loại thức ăn đến loài ăn nhiều loại thức ăn khác nhau, và khả năng phát tán (từ loài không thể bay xa đến có thể bay xa) Sự đa dạng phân loại và thức ăn của chúng có thể gây kinh ngạc trong bất kỳ môi trường nhiệt đới cụ thể nào (Erwin 1982; Wagner 1999; Novotny và Miller 2014) [78, 79, 80], chúng có mối quan hệ sinh thái chặt chẽ với thực vật ở tất cả các giai đoạn của chu kỳ sống và có tỷ lệ đặc hữu cao, cả hai yếu tố đó cho thấy chúng có mối quan hệ chặt chẽ với môi trường Do vậy chúng là đối tượng thích hợp trong nghiên cứu các phương diện của đa dạng sinh học: nghiên cứu đa dạng loài

và tương tác sinh thái (Price 2002) [81]

1.1.3.1 Tình hình nghiên cứu Chrysomelidae ở Việt Nam

Từ năm 1975 đến năm 2008, côn trùng cánh cứng ăn lá (Chrysomelidae) ở Việt Nam đã được tập trung nghiên cứu nhiều về đa dạng loài và đặc điểm phân bố Đặc biệt khu hệ Chrysomelidae ở khu vực phía Bắc Việt Nam (Tam Đảo, Hòa Bình, Hà Nam, Ninh Bình ), khu vực ba tỉnh miền trung (Quảng Bình, Quảng Trị và Thừa Thiên Huế) và một số tỉnh Tây Nguyên đã được nghiên cứu kỹ (Đặng Thị Đáp và Medvedev,

1982, 1983, 1989 [82, 83, 84] và Trần Thiếu Dư và cs 2005, 2006, 2007, 2008 [85-89]

Và các kết quả nghiên cứu này cho thấy Chrysomelidae có sự đa dạng loài cao và một

số nhóm (Monolepties) có sự phân bố theo vùng miền (chúng được ghi nhận nhiều ở các tỉnh miền trung và Tây Nguyên, trong khi chúng ít xuất hiện ở các tỉnh phía Bắc)

Phân loại học của Chrysomelidae ở Việt Nam được một số tác giả trong nước quan tâm như Đặng Thị Đáp và Trần Thiếu Dư (2005) [90, 91, 92] và nhiều tác giả nước ngoài quan tâm nghiên cứu và công bố như Medvedev (1985, 1987, 1988, 1992,

2001, 2004, 2009, 2010, 2011, 2012, 2013, 2014, 2015) [93-109], Delobel et al (2011) [110], Shu-Yong et al (2010) [111], Warchalowski (2010) [112], Lopatin (2003, 2008) [113, 114], Moseyko (2005, 2006) [115, 116], Bezdek (2005) [117] và Kimoto (1997,

1998, 2000) [118, 119, 120] Theo ghi nhận của các tác giả này, có khoảng 700 loài Chrysomelidae ở Việt Nam đã được mô tả và công bố trên các tạp chí khoa học, và ước tính số loài Chrysomelidae ở Việt Nam có thể vượt 1.000 loài Điều này cho thấy sự đa dạng rất cao của quần xã Chrysomelidae ở Việt Nam và nhiều loài đang chờ phát hiện

và mô tả mới cho khoa học

Những ghi nhận về thực vật chủ của các loài Chrysomelidae ở Việt Nam còn rất hạn chế Medvedev và Đặng Thị Đáp (1982, 1983) [82, 83] đã đưa ra danh sách thực vật chủ của 212 loài Chrysomelidae, tuy nhiên danh sách này chưa đầy đủ và theo tác giả phương pháp nghiên cứu của các tác giả còn nhiều hạn chế Tác giả ghi nhận thực vật chủ của Chrysomelidae dựa vào quan sát trực tiếp ngoài thực địa, khi bắt gặp chúng trên thực vật nào thì kết luận thực vật đó là thức ăn của chúng Kết luận này nhiều khi không chính xác, bởi vì Chrysomelidae là côn trùng biết bay và chúng có thể bay xa, nhiều loài ăn trên nhiều loại thức vật khác nhau

Năm 1993 Đặng Thị Đáp đã có nghiên cứu và kết luận ban đầu về ảnh hưởng của cảnh quan tới sự phân bố của phân họ Cassidinae Trong họ Chryrsomelidae, hai phân họ Galerucinae và Eumophinae có số loài hơn các phân họ khác, Cassidinae là phân họ nhỏ, có số loài ít, do vậy nếu sử dụng phân họ Cassidinae cho nghiên cứu sinh thái học sẽ cho kết quả thiếu chính xác Ở Việt Nam, chưa có nghiên cứu sâu về sinh thái học và đặc biệt nghiên cứu về ảnh hưởng của dải biến động môi trường tới quần xã Chrysomelidae [121]

Dữ liệu về đa dạng côn trùng ở VQG Núi Chúa đã được Tạ Huy Thịnh và cộng

sự nghiên cứu trong năm 2005, tuy nhiên nhóm tác giả không nghiên cứu về quần xã Chrysomelidae ở khu vực này [122] Kết quả của nhóm tác giả chỉ thống kê sự đa dạng của một số họ côn trùng ở VQG Núi Chúa (có bộ Coleoptera, nhưng không có họ Chrysomelidae) Do vậy, kết quả nghiên cứu của luận án là kết quả nghiên cứu đầu tiên

về quần xã Chrysomelidae ở VQG Núi Chúa

Tóm lại, các nghiên cứu trước đây về Chrysomelidae ở Việt Nam chủ yếu về phân loại học hình thái và những điều tra đa dạng loài ở một số Vườn quốc gia, chưa

có nghiên cứu về sinh thái học của quần xã Chrysomelidae trong điều kiện môi trường

cụ thể và đặc biệt chưa có ghi nhận dữ liệu về sinh học phân tử của Chrysomelidae ở Việt Nam

1.1.3.2 Tình hình nghiên cứu Chrysomelidae trên thế giới

Chrysomelidae là một nhóm cánh cứng lớn nhất trong bộ cánh cứng, có khoảng 37.000 loài Chrysomelidae đã được mô tả, thuộc hơn 2000 giống (Jolivet, Petitpierre,

và Hsiao (1988) [123] Chúng được nghiên cứu khá đầy đủ về thực vật chủ (Jolivet

và Hawkeswood 1995) [124], về sinh học: nhận dạng, phát sinh loài, di truyền, sinh thái ….(Jolivet và Cox , 1996) [125] Các nhà khoa học ngày nay đã sử dụng sinh học phân tử để nghiên cứu sâu hơn về phát sinh loài của Chrysomelidae (Nadein, 2015; Matsumura et al 2014; Montelongo và Gómez-Zurita, 2014; …) [126, 127, 128] cũng như đánh giá đa dạng của Chrysomelidae (Thormann et al., 2016; Papadopoulou, Cardoso và Gómez-Zurita, 2013) [72, 129] và tìm kiếm thực vật chủ của chúng (Jurado-Rivera et al 2009, Kishimoto-Yamada et al 2013; De la Cadena et al 2017; ) [51, 54, 130]

Cùng với xu hướng nghiên cứu trên thế giới đang áp dụng, luận án sử dụng phương pháp sinh học phân tử để đánh giá đa dạng loài và thức ăn của Chrysomelidae trong điều kiện môi trường ở VQG Núi Chúa: sự thay đổi môi trường ở phạm vi nhỏ nhưng liên tục, thay đổi từ rừng khô ở độ cao thấp tới rừng ẩm ở độ cao cao hơn Độ cao trong nghiên cứu này chưa tới 1.000 m, trong khi các nghiên cứu trước đây đa số ở

độ cao trên 1.000 m và được nghiên cứu ở khu vực Nam và Trung Mỹ Do đó, nghiên cứu của đề tài là không trùng lặp với các nghiên cứu trước đây

Như vậy, sinh vật có sự đa dạng lớn trong mọi bậc phân loại, sự thiếu hụt nghiêm trọng các chuyên gia trong nghiên cứu phân loại học các loài, cùng với tốc độ

sự tuyệt chủng của các loài trong tự nhiên cao là trở ngại trong nghiên cứu đa dạng sinh học, sinh thái học và sự phát sinh loài Sinh học phân tử có thể được sử dụng như

là công cụ hỗ trợ đắc lực để giải quyết vấn đề trở ngại trong nghiên cứu đa dạng sinh học, là công cụ giúp đánh giá nhanh đa dạng sinh học (đa dạng loài và tương tác sinh thái của các loài) Chrysomelidae với số lượng loài lớn trên thế giới, nhiều loài chưa được khám phá, phân bố rộng và có tương tác sinh thái loài phức tạp, chúng ít được nghiên cứu ở trong rừng nhiệt đới nên là đối tượng thích hợp để áp dụng công cụ sinh học phân tử trong đánh giá đa dạng của chúng (đa dạng và tương tác loài) trong sự biến động môi trường ở Vườn Quốc Gia Núi Chúa để chứng minh sự phụ thuộc lẫn nhau của các quần xã trong hệ sinh thái

1.2 Khái quát về điều kiện tự nhiên – kinh tế xã hội của khu vực nghiên cứu

VQG Núi Chúa được thành lập trên cơ sở:

 Quyết định số 194/QĐ - HĐBT ngày 9 tháng 8 năm 1986 của Hội đồng Bộ trưởng (nay là Chính phủ) về việc thành lập Khu Bảo tồn Thiên nhiên Núi Chúa

 Công văn số 200/NN và PTNT ngày 17 tháng 1 năm 1997 của Bộ Nông nghiệp

và Phát triển Nông thôn gửi Uỷ ban nhân dân Tỉnh Ninh Thuận đồng ý với chủ trương

về quy hoạch ổn định đối với các loại rừng, đồng thời xây dựng các dự án trong đó có rừng đặc dụng khô hạn Núi Chúa

 Quyết định số 134/2003/QĐ - TTg ngày 7 tháng 9 năm 2003 của Thủ tướng Chính phủ về việc thành lập VQG Núi Chúa

1.2.1 Vị trí địa lý

VQG Núi Chúa thuộc huyện Ninh Hải, tỉnh Ninh Thuận, giáp với tỉnh Khánh Hòa Ở vị trí cực đông của Nam Trung Bộ, nơi tiếp giáp giữa vùng Đông Nam Bộ và Nam Trung Bộ, có toạ độ từ 11°35'25" đến 11°48'38" vĩ bắc và 109°4'5" đến 109°14'15" kinh đông, diện tích: 29.865 ha trong đó phần đất liền là 22.513ha và phần biển là 7.352 ha, vùng đệm có diện tích 7.350 ha Giới hạn phía bắc là ranh giới giáp tỉnh Khánh Hòa Khu vực Núi Chúa có ba mặt giáp biển Ngay phía bắc là phần dưới của vịnh Cam Ranh thuộc xã Cam Lập thành phố Cam Ranh tỉnh Khánh Hòa, Phía đông và nam là biển Đông với các xã Vĩnh Hải và Nhơn Hải thuộc huyện Ninh Hải Phía nam là đầm Nại, phía tây giới hạn bằng chính quốc lộ 1A

1.2.2 Địa hình

Khu vực Núi Chúa là một khối núi khá liền nhau, nhìn từ ảnh vệ tinh thì Núi Chúa có hình dạng như một con rùa có đầu quay về phía Nam, đuôi là phần nhô ra mũi Xốp Khối núi này có nhiều đỉnh ở các độ cao khác nhau, mà đỉnh cao nhất là đỉnh núi

Cô Tuy có độ cao 1.039 m

Địa hình thấp dần từ trung tâm ra, phần phía bắc và tây có độ dốc lớn hơn phía Nam và phía Đông Phía Tây và Tây nam địa hình bị chia cắt do có các khối núi nhỏ tạo thành các thung lũng sườn núi theo hướng Đông Bắc-Tây Nam; còn phía Bắc, Đông và Đông nam địa hình ít bị chia cắt, thấp dần từ đỉnh núi ra biển

Địa hình có độ cao dưới 300 m: phân bố phía Đông và Nam và các khu vực ở phía Bắc giáp biển, địa hình ít bị chia cắt, độ dốc dưới 200

Địa hình có độ cao từ 300-700 m: phân bố phía Tây và Tây Nam, địa hình bị chia cắt mạnh, hình thành các thung lũng và sườn vách dốc trên 200, cho đến 350

Địa hình có độ cao trên 700 m: phân bố ở phần trung tâm, có nhiều đỉnh núi ở các độ cao khác nhau, bị ngăn cắt bởi các thung lũng, có độ dốc từ 200 đến 400

Xa hơn về phía Tây Nam là đồng bằng nhỏ Phan Rang, bao bọc xung quanh bởi các khối núi cao Cả khu vực Núi Chúa-Phan Rang gần như hình thành dạng địa hình lòng chảo, ngăn cách ở phía Bắc, Tây và Nam là các khối núi có địa hình cao trên 500

m cho đến trên 1.000 m Ở hai đầu phía Bắc và Nam bị chặn lại bởi các khối núi ăn lan

ra biển có cao độ trung bình 500-700 m

1.2.3 Khí hậu, thủy văn

Khu vực VQG Núi Chúa nằm lọt hoàn toàn trong khu vực khí hậu ven biển miền trung thuộc vùng khí hậu Nam Trung Bộ với đặc điểm là khô hạn, đặc điểm này liên quan đến vị trí bị che khuất của vùng này bởi các núi vòng cung bao bọc phía Bắc, Tây và Nam với hai luồng gió mùa chính Trong vùng khí hậu khô hạn này thì khu vực Phan Rang được coi là trung tâm khô hạn nhất nước, với lượng mưa trung bình năm dưới 700 mm, có những năm dưới 500 mm

Mùa mưa ở khu vực này đến muộn so với các vùng khác và kết thúc cũng sớm hơn, bắt đầu khoảng tháng 9 - 10 và kết thúc khoảng tháng 12 Gió mùa Đông Bắc không ảnh hưởng nhiều đến khu vực nên không cung cấp thêm lượng ẩm vào mùa gió mùa Đông Bắc, còn gió mùa Tây Nam vào mùa mưa thì lại bị các khối địa hình cao hơn ở vị trí bên trong hứng gần hết lượng ẩm mà gió mùa Tây Nam mang lại Do vị trí tiếp giáp như vậy lượng mưa tại khu vực Núi Chúa có thể đạt xấp xỉ 1000 mm hoặc hơn so với trung tâm khô hạn Phan Rang-Mũi Dinh chỉ đạt 650-750 mm/năm

Chế độ nhiệt của khu vực mang những nét đặc trưng của chế độ nhiệt miền Nam, không có mùa đông lạnh, nhiệt độ trung bình năm xấp xỉ 260 C, nhiệt độ tháng lạnh nhất không xuống thấp hơn 230 C (cho địa hình thấp, đồng bằng), nền nhiệt độ các tháng trong năm khá ổn định theo kiểu chuyển tiếp khí hậu xích đạo – nhiệt đới Các yếu tố cực trị về nhiệt có thể thấy qua các trị số cực tiểu như nhiệt độ tối thấp tuyệt đối

có thể đạt 14-150 C ở đồng bằng và giảm thêm theo độ cao

Độ ẩm không khí liên quan đến chế độ nhiệt và mưa như trên nên độ ẩm trung bình chỉ khoảng 80%, trong các tháng mùa mưa cũng chỉ đạt khoảng 85%, trong các tháng mùa khô độ ẩm tối thấp tuyệt đối có thể xuống dưới 20-25%

Theo Luận chứng Khoa học của VQG Núi Chúa, tính toán các chỉ số nhiệt và mưa hàng tháng thì khu vực này có 9 tháng khô, 4 tháng hạn và 2 tháng kiệt và được xếp vào loại khô hạn nhất ở Việt Nam Chỉ số khô hạn X = 9 4 2

Hệ thống dòng chảy – thủy văn: Với địa hình là một khối núi nhỏ độc lập như vậy nên hệ thống thủy văn sông suối trong khu vực này có đặc trưng là dòng chảy ngắn, nhỏ và lưu lượng thay đổi theo mùa, diện tích lưu vực cho từng dòng chảy không lớn

Nhìn chung khu vực VQG Núi Chúa không có suối lớn, chỉ có một số suối nhỏ, ngắn đến mùa khô gần như không có nước Các suối có dòng chảy đáng kể như suối Nước ngọt, Suối Nước giếng, Suối Kiền Kiền, suối Đông Nha, suối Lồ ồ, suối Đá Các suối trên đều bắt nguồn từ trên núi cao chảy ra biển đông [131]

Hình 1.2: Sơ đồ VQG Núi Chúa (nguồn: Sinh vật rừng Việt Nam: http://www.vncreatures.net/all_vqg/mapnc.php)

1.2.4 Đặc điểm sinh thái thảm thực vật

Theo ghi nhận ban đầu của Phân Viện Điều Tra Quy Hoạch Rừng II, VQG Núi Chúa

VQG Núi Chúa có 6 kiểu thảm thực vật chính là:

- Kiểu Trảng cỏ thứ sinh trên đất cát ven biển

- Kiểu Trảng cây bụi thường xanh trên đất cát ven biển

- Kiểu Rừng thưa cây lá rộng hơi khô nhiệt đới

- Kiểu Trảng cây bụi gai chịu hạn rụng lá nhiệt đới

- Kiểu Trảng cây bụi thường xanh hơi khô nhiệt đới

- Kiểu Rừng kín thường xanh hơi ẩm nhiệt đới núi thấp

Cũng theo tác giả trên, ở VQG Núi Chúa có các sinh cảnh thực vật như:

- Thực vật trên đồi cát ven biển

- Thực vật khô hạn trên vùng núi đá lộ đầu

- Thực vật truông bụi gai thưa cây rụng lá trên nền đất pha cát

- Thực vật cây lá rộng thường xanh từ khô hạn tới hơi ẩm

- Thực vật lá rộng xen lá kim hơi ẩm vùng núi

- Một số sinh cảnh hẹp như thực vật hồ nước trên núi, thực vật trên thác nước, thực vật ven khe nước trên núi

Khu vực VQG Núi Chúa có kiểu hệ sinh thái bán khô hạn được biết đến như là kiểu

hệ sinh thái tiêu biểu cho khu vực nhưng ngoài ra còn có kiểu hệ sinh thái khác làm cho khu vực khác với các vùng khác, đó là hệ sinh thái rừng thường xanh với hệ thực vật và thành phần loài khác với hệ thực vật của hệ sinh thái bán khô hạn Hệ thực vật trong khu vực này còn có cả thành phần loài thuộc vùng khí hậu không phải là nóng và khô hạn tiêu biểu thường gặp, đó là các loài thực vật thuộc vùng khí hậu á nhiệt đới và

ôn đới với các loài cây lá kim đặc trưng như Kim Giao (Podocarpus spp.) và Thanh tùng (Taxus baccata) Sự xuất hiện các loài thực vật á nhiệt đới và ôn đới này đã tạo

nên những nét đặc trưng riêng và tính đa dạng về sinh thái, cảnh quan và sinh học nói chung cho cả khu vực Núi Chúa [132]

1.2.5 Hệ động, thực vật

Đã ghi nhận 350 loài san hô, trong đó có 307 loài san hô cứng tạo rạn thuộc 59 giống, 15 họ, trong đó đặc biệt có 46 loài san hô được ghi nhận là phân loại mới tại Việt Nam VQG Núi Chúa còn được ghi nhận là nơi có một số quần thể rùa biển đến

sinh sản gồm 03 loài là Đồi mồi (Eretmochelys imbricata), Rùa xanh (Chelonia mydas), Đồi mồi dứa (Lepidochelys Olivacea)

Trong sáu kiểu thảm thực vật nêu trên các nhà khoa học nghiên cứu, điều tra đã ghi nhận được 1.504 loài thực vật bậc cao có mạch trên cạn nằm trong 85 bộ, 147 họ và

596 chi thuộc 7 ngành thực vật khác nhau ở Việt Nam có 08 ngành thực vật bậc cao có mạch hiện đang sống thì ở VQG Núi Chúa đã có đại diện của 07 ngành chiếm 87%, chỉ thiếu ngành Cỏ tháp bút Những loài thực vật đã được ghi nhận có những giá trị khác nhau Trong đó có 30 loài quý hiếm có tên trong Sách đỏ Thế giới

Đã ghi nhận 330 loài động vật có xương sống trên cạn với 84 loài thú, 163 loài chim và 83 loài bò sát – lưỡng cư, trong số đó có 46 loài là loài nguy cấp quý hiếm có tên trong Sách đỏ Việt Nam, Sách đỏ thế giới và các phụ lục của Nghị định 32/2006/NĐ-CP [133] Trong đợt điều tra khảo sát 6/2004, từ 3 tuyến điều tra đã thu thập được 10 bộ, 95 họ Côn trùng gồm 361 loài và dạng loài Số loài đã định tên khoa học chiếm 53,7% trong số đó (Tạ Huy Thịnh et al., 2005) [122] Khu hệ động vật ở VQG Núi Chúa chưa được điều tra, nghiên cứu đầy đủ nhưng theo một số nhà khoa

học nơi đây vẫn tồn tại nhiều loài động vật quý hiếm như: Chà và chân đen (Pygathrix nigripes), Gấu ngựa (Ursus thibetanus), Rùa da (Dermochelys coriacea), Đồi mồi dứa (Chelonia mydas), Vích (Caretta caretta) Nhiều loài chim quý hiếm vẫn còn hiện diện như: Cốc biển bụng trắng (Fregata andrewsi), Gà lôi (Lophura nythemera), Phướn đất (Carpococcyx renauldi), công (Pavo muticus) chứng tỏ mức

độ đa dạng nơi đây vẫn còn khá cao [133]

Như vậy, VQG Núi Chúa bao gồm diện tích rừng bán khô hạn độc đáo nhất Việt Nam và quần xã thực vật ở đây có sự thay đổi rõ rệt theo độ cao từ rừng khô trên đất

thấp, qua rừng chuyển tiếp (rừng bán ẩm) tới rừng ẩm thường xanh trên núi cao Vì vậy, VQG Núi Chúa là địa điểm lý tưởng để thực hiện nghiên cứu của luận án

Chương 2: PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Phương pháp thu mẫu và phân chia sinh cảnh ở VQG Núi Chúa

2.1.1 Thiết kế và thu thập mẫu vật

Để xác định được các tuyến đường thu mẫu, nghiên cứu sinh đã giành 1 tuần khảo sát khu vực nghiên cứu ở VQG Núi Chúa trong lần thu mẫu đầu tiên (5/2012), sau đó trong các đợt thu mẫu tiếp theo, nghiên cứu sinh chọn được các tuyến đường thu mẫu lan tỏa theo các hướng khác nhau của VQG Núi Chúa, đảm bảo thu được mẫu vật đại diện cho toàn bộ VQG Núi Chúa

Năm con đường rừng ở Vườn Quốc Gia Núi Chúa được chọn để tiến hành thu mẫu trong các đợt điều tra có tên là Mái Nhà, Đá Đỏ, Ao Hồ, Núi Ông và Suối Trục (tên các con đường theo người dân địa phương đặt) Trong mỗi đợt thu mẫu, mỗi tuyến được thu mẫu từ độ cao ở mức nước biển (tương ứng với vùng sinh thái khô) theo độ cao tăng dần lên đến 449m (tương ứng với vùng sinh thái chuyển tiếp và một phần của vùng sinh thái ẩm) (Bảng 2.1, Hình 2.2),

Mỗi con đường rừng cố định được thu mẫu 10 lần: thu mẫu một lần/tháng trong các tháng 6, tháng 7 và tháng 9 (năm 2012) và tháng 1 (năm 2013) và hai lần/tháng trong các tháng 2 đến 4 (năm 2013) Tuyến Đá Hang chỉ được thu mẫu một lần tháng 5 năm 2012 trong lần khảo sát đầu tiên Các mẫu vật họ Chrysomelidae được thu thập quanh những điểm cố định dọc theo các tuyến đường rừng trong mỗi lần thu mẫu Do luận án nghiên cứu về sinh thái học của quần xã Chrysomelidae (sự biến đổi theo độ cao), do vậy cần có phương pháp thu mẫu nhất quán để đảm bảo sự phân tích được chính xác nhất Do vậy, chúng tôi chỉ thu mẫu bằng phương pháp đập (thời gian và chiều cao tán đập là nhất quán tại mỗi điểm thu mẫu) Cụ thể, tại mỗi điểm thu mẫu việc thu thập mẫu vật được thực hiện trong 10 phút bằng cách đập từ thảm cỏ, cây bụi

và các cành cây thấp tới cao đến khi nào không thể với được thì dừng (khoảng 2,5 m) (hình 2.1) Các mẫu vật thu được được lưu trữ ngay lập tức trong các lọ có chứa ethanol tuyệt đối (96%) cho bảo quản ADN, các lọ được đánh nhãn thời gian vị trí địa

lý và tuyến đường thu mẫu

Hình 2.1: Thu mẫu ở khu vực nghiên cứu

Bảng 2.1: Tọa độ các vị trí thu mẫu ở VQG Núi Chúa

TĐ Vĩ độ Kinh độ E N TĐ Vĩ độ Kinh độ E N

DH1 11,6956389 109,162736 109 11 NO1 11,7334444 109,184389 122 15 DH2 11,7021667 109,148444 233 15 NO2 11,7341111 109,182472 174 7 DH3 11,7096528 109,141736 506 2 NO3 11,7345556 109,181222 204 5 DH4 11,7156111 109,136944 661 13 NO4 11,7349583 109,180056 238 8 DH5 11,7221667 109,136111 714 9 NO5 11,7353889 109,179111 271 3 NO6 11,7356667 109,177750 340 9 AH1 11,7279722 109,202944 50 3 NO7 11,7355000 109,176889 382 11 AH2 11,7266389 109,20475 82 6 NO8 11,7362778 109,175861 411 11 AH3 11,7310278 109,209889 142 2 NO9 11,7371667 109,175958 418 6 AH4 11,7322222 109,211278 173 2 NO10 11,7379861 109,175972 428 6 AH5 11,7352778 109,212972 200 4 NO11 11,7385556 109,175861 441 9 AH6 11,7363889 109,215111 208 6 NO12 11,7402639 109,175389 486 7 AH7 11,7358333 109,21625 236 4 NO13 11,7424444 109,175250 484 4 AH8 11,7354444 109,217264 258 7 NO14 11,7456944 109,175028 474 1 AH9 11,7349167 109,218861 260 2 AH10 11,7352222 109,2195 265 2 MN1 11,7279830 109,189704 38 2

DD1 11,7226667 109,181306 111 3 MN3 11,7246806 109,182014 107 10 DD2 11,7193889 109,179361 158 3 MN4 11,7245556 109,180417 140 4 DD3 11,7177778 109,178333 188 4 MN5 11,7246944 109,179403 166 12 DD4 11,7165556 109,174611 243 3 MN6 11,7226944 109,179417 162 2 DD5 11,7145278 109,175083 230 2 MN7 11,7251667 109,177236 180 9 DD6 11,7150556 109,181528 212 4 MN8 11,7251806 109,175125 224 15 DD1' 11,7205833 109,182944 157 2 MN9 11,7238611 109,174472 244 14 DD2' 11,7165694 109,180903 211 2 MN10 11,7216528 109,174681 258 9 DD3' 11,7151944 109,179236 230 4 MN11 11,7207500 109,173917 269 3 DD4' 11,7152222 109,176625 224 2 MN12 11,7192361 109,174944 284 15 DD5' 11,7164167 109,177278 219 3 MN13 11,7182222 109,172222 324 3 MN14 11,7196667 109,171222 358 3 ST1 11,7346667 109,190583 101 4 MN15 11,7192500 109,170222 364 4 ST2 11,7368333 109,190222 171 11 ST3 11,7391667 109,190653 251 11 ST4 11,7411250 109,191597 287 1 ST5 11,7436528 109,192681 326 21 ST6 11,7446806 109,1925 351 18 ST7 11,7461667 109,192167 378 13 ST8 11,7485000 109,192833 405 15 ST9 11,7511528 109,192319 392 18 ST10 11,7534444 109,192875 376 21

Chú thích: (TĐ) tuyến đường thu mẫu; (E) độ cao: m; (N.) số lần thu mẫu; (DH) tuyến Đá Hang; (AH) tuyến Ao

Hồ; (NO) tuyến Núi Ông; (DD) tuyến Đá Đỏ; (MN) tuyến Mái Nhà; (ST) tuyến Suối Trục

Hình 2.2: Sơ đồ thu mẫu Chrysomelidae ở VQG Núi Chúa (a) Vị trí VQG Núi Chúa trong bản đồ Việt Nam (b) Phác họa hình dáng VQG Núi Chúa và các tuyến thu mẫu (c) Các vị trí thu mẫu trong các tuyến thu mẫu ở VQG Núi Chúa,

với vùng màu xám là vùng chuyển tiếp được giả định

2.1.2 Phân chia sinh cảnh trong khu vực thu mẫu ở VQG Núi Chúa

Sự phân chia sinh cảnh trong khu vực nghiên cứu dựa trên kết quả nghiên cứu trước đây về VQG Núi Chúa [132] kết hợp với việc phân tích một số tham số của quần

xã Chrysomelidae như chỉ số tương đồng (chỉ số SØrensen – Dice) bằng việc sử dụng phương pháp cửa sổ trượt (sliding window) (Barton et al 2013) [134] Mẫu vật đã được xác định loài được phân chia cho các khoảng 40 m độ cao liền kề và tính toán số loài giống nhau giữa các khoảng độ cao liền kề đó và loài chỉ có ở trên/dưới mỗi khoảng độ cao đó Cơ sở của phương pháp này là vùng thu mẫu của chúng tôi sẽ bao trùm một khu vực là môi trường sống chung của những loài ưa thích môi trường khô nhưng có thể mở rộng phạm vi sống đến môi trường ẩm hơn và những loài ưa thích môi trường ẩm nhưng có thể mở rộng phạm vi sống tới môi trường khô hơn Vùng này

là vùng chuyển tiếp sinh thái và có sự đa dạng cao hơn hai vùng sinh thái khô và ẩm (ảnh hưởng của sự chiếm cứ giữa lãnh thổ như Colwell và Lees 2000) [135]

2.2 Phương pháp sinh học phân tử:

Toàn bộ phần mềm của mỗi mẫu vật bọ cánh cứng ăn lá được dùng làm đối tượng để tách chiết ADN tiêu chuẩn, sử dụng bộ công cụ DNeasy Blood và Tissue (Qiagen Iberia, Madrid, Spain) để tách triết ADN theo protocol trong phòng thí nghiệm Toàn bộ cơ thể mẫu vật đã được sử dụng cho tách triết ADN, phần xác còn lại của những mẫu vật này sau khi tách triết ADN được giữ lại, làm khô, gắn lại làm tiêu bản với các thông tin thời gian, địa điểm và người thu thập mẫu vật để làm tài liệu tham khảo cho các nghiên cứu sau này

Để xác định loài họ Chrysomelidae, các ADN của từng cá thể được dùng làm khuôn cho sự khuếch đại PCR của gen ty thể cytochrome c oxidase subunit 1 (cox1) có chiều dài 830bp, sử dụng cặp mồi TL-N-3014 (Simon et al 1994) [136] C1-J-2183 được sửa đổi (Gómez-zurita et al 2012) [137] Khi các mồi này kết hợp lỗi, locus tương tự trong hai mảnh ngắn hơn không chồng nhau được khuếch đại, sử dụng mồi ở trong phù hợp hay bổ sung ngược lại với nó (Gómez-zurita et al 2012) [137] Các hóa chất sử dụng cho phản ứng PCR gen cox1 gồm: 1µl AND, 2.5µl của Buffer 10X, 1.5 µl MgCl2 50mM, 0.25µl dNTPs 20mM, 0.5µl primers (cả hai chiều) 10µM, 0.1µl Taq

polymerase và 18.65µl nước tinh khiết Điều kiện tiêu chuẩn của phản ứng PCR là 30 giây biến tính ở 94° C, 30 giây ủ ở 50° C và kéo dài 1 phút tại 72° C Các sản phẩm PCR được làm sạch bằng cách sử dụng ammonium acetate và isopropanol lạnh, kiểm tra gel điện di agarose 1.5% và được giải trình tự theo cả hai chiều bằng cách sử dụng cùng mồi PCR và bộ giải trình tự theo chu kỳ BigDye Terminator v3.1 (Applied Biosystems, Foster City CA, USA) Các trình tự bổ sung được lắp ráp thành các chuỗi ADN được nhân bản nằm liền kề nhau và chỉnh sửa bằng phần mềm Geneious Pro 5.3.6 (Biomatters Ltd, Auckland, New Zealand) và những trình tự không rõ ràng được sắp xếp lại bằng tay Các trình tự tạo ra trong nghiên cứu này đã được lưu giữ trong cơ

sở dữ liệu lưu trữ Nucleotide Châu Âu (EMBL-EBI, Hinxton) với số gia nhập LT160095-LT160588

Để nghiên cứu thức ăn trong ruột của Chrysomelidae, chúng tôi khuếch đại vùng Intergenic spacer của locus cpADN PsbA-TrnH Chúng tôi sử dụng cặp mồi Psba

(5’CAYCGGTTCACCTAGTTCCG3’) với điều kiện phản ứng là 20 chu trình trong 30 giây biến tính ở 94o, ủ trong 30 giây ở 60o và kéo dài ở 72o trong một phút Sản phẩm PCR được kiểm tra trong gel điện di agarose 1.5 % Các sản phẩm PCR cho thấy nhiều dải sẽ được cắt và được đánh nhãn và cất trữ trong các lọ riêng biệt, chúng được sử dụng làm khuôn cho phản ứng PCR lại Các sản phẩm PCR được làm sạch bằng ammonium acetate và isopropanol Các DNA được giải trình tự cả hai chiều sử dụng cùng mồi PCR và bộ kit giải trình tự BigDye Terminator v3.1 Cycle Sequencing (Applied Biosystems, Foster City CA, USA) Sử dụng phần mềm Geneious Pro 5.3.6

để nhóm các cặp ADN có trình tự bổ sung với nhau, chỉnh sửa chúng và sắp xếp chúng trong một ma trận trình tự đơn

2.3 Phương pháp xác định loài Chrysomelidae

Xác định loài Chrysomelidae theo dữ liệu sinh học phân tử

Việc xác định các loài đã sử dụng một số phương pháp dựa trên cây phát sinh loài, hiệu quả của từng phương pháp được đánh giá bằng cách so sánh sự phù hợp của chúng với các loài hình thái Chúng tôi sử dụng hai phương pháp tiếp cận loài dựa trên cây: mô hình Generalized Mixed Yule-Coalescent (GMYC) xem xét cả đơn và đa ngưỡng (Pons et al 2006, Fujisawa and Barraclough 2013) [138, 139], và mô hình Poisson Tree Processes (bPTP) (Zhang j-J et al 2013) [140] Trước khi phân tích phát sinh loài, tất cả dữ liệu được xếp lại thành loại đơn (không có các trình tự ADN của các

cá thể giống nhau cùng tồn tại)

Phương pháp GMYC yêu cầu cây ultrametric (là cây phát sinh loài mà các chiều dài từ gốc tới đỉnh bằng nhau) Để có được cây “ultrametric” đầu tiên xác định mô hình tiến hoá phù hợp nhất với biến thể quan sát thấy trong ma trận dữ liệu gen cox1 được đánh giá dựa trên một số thông tin tiêu chuẩn được thực hiện trong jModelTest 2.1.5 (Darriba et al 2012) [141] Mô hình được chọn là GTR + I + G trong mọi trường hợp Sau đó sử dụng một vài cách để thu được cây “ultrametric”:

Cách đầu tiên là thiết lập cài đặt mô hình tiến hóa phù hợp cho ma trận gen cox1 trong RAxML 7.2.6 (Stamatakis 2006) [142] để thu được cây có khả năng xảy ra nhất (cây ML) Các cây ML tối ưu đã thu được với bước đầu khám phá cài đặt sắp xếp lại ban đầu tốt nhất từ bộ sưu tập của 100 cây bắt đầu ngẫu nhiên, và bước thứ hai sử dụng những cài đặt tối ưu trong tìm kiếm suy luận phức tạp cho cây có khả năng xảy ra được biết tốt nhất sử dụng 500 bản sao Cây ML thu được, được tạo rễ từ giữa điểm của con đường nhánh dài nhất giữa hai điểm đầu cuối và đã được thực hiện chuyển thành cây ultrametric với (1) các thuật toán PATHd8, mà chuyển đổi chiều dài nhánh bằng cách làm nhẵn tỷ lệ cục bộ để thích ứng độ lệch với đồng hồ phân tử (Britton et al 2007) [143]; hoặc (2) phương pháp làm nhẵn tỷ lệ tham số được thực hiện trong r8s 1.8 (Sanderson 2003) [144] Theo đó, chúng tôi đã thu được thông số làm nhẵn tối ưu bằng