KHOÁ LUẬN TỐT NGHIỆP NGÀNH NGHIÊN CỨU SINH HỌC

Nguy n Th Nga – Tr ng i h c Khoa h c t nhiên K53B-CNSH M U Cá tra hi n đóng vai trị quan tr ng xu t kh u th y s n c a Vi t Nam N m 2011, có h n 230 doanh nghi p xu t kh u cá tra đ n h n 130 th tr ng th gi i, đ t 1,8 t USD, t ng g n 26,5%, v i kh i l ng 600 nghìn t n, t ng 3% so v i n m 2010 [3] Tuy nhiên, vi c m r ng di n tích thâm canh ni tr ng cá tra v i m t đ cao mà ch a có bi n pháp qu n lý phù h p làm cho d ch b nh bùng n gây thi t h i không nh cho ng i dân M t nh ng b nh đ c đánh giá nguy hi m cá tra b nh gan th n m tác nhân vi khu n Edwardsiella ictaluri gây nên gây ch t cá v i s l ng l n Tr c đây, th i k cao m c a d ch b nh th ng vào tháng đ n tháng 12, nh ng hi n nay, d ch b nh x y quanh n m T c đ lây lan t l thu n v i m c đ thâm canh, m t đ nuôi cá m t đ n v di n tích ao ni T l cá ch t có th lên t i 90% cá tra gi ng, 50% cá tra th ng ph m [4] Hi n nay, vi khu n E ictaluri đ kháng v i nhi u lo i kháng sinh, m t khác ch a có vaccine phịng b nh gan th n m m t cách hi u qu nên vi c xác đ nh s m tác nhân gây b nh đóng vai trị quan tr ng vi c phịng ch ng, ki m sốt u tr b nh cho cá Thông th ng, đ phát hi n m t tác nhân gây b nh b ng ph ng pháp vi sinh v t phịng thí nghi m m t kho ng ngày v i đ tin c y không cao Ph ng pháp PCR c n 5-6 ti ng v i k thu t ph c t p, đòi h i máy gia nhi t t đ ng, n di, thu c nhu m hu nh quang đ c h i, địi h i ngu n nhân l c có tay ngh v n c n ph i làm giàu m u Do v y, m t yêu c u c p thi t phát tri n m t ph ng pháp phát hi n tác nhân gây b nh chi phí th p, hi u qu , d s d ng, khơng đ c h i, có th ph bi n nhi u l nh v c LAMP- Loop mediated isothermal amplification m t ph ng pháp khu ch đ i DNA đ t đ c nh ng u ki n Tuy nhiên, kh i l ng s n ph m khu ch đ i t o r t l n nên vi c gây nhi m khơng gian phịng thí nghi m v i s n ph m khu ch đ i c a ph n ng m t v n đ nghiêm tr ng, ch có th kh c ph c b ng cách không m ng sau ph n ng k t thúc Vì v y ti n hành đ tài “Nghiên c u s d ng Calcein ch th màu phát hi n s Edwardsiella ictaluri b ng ph khu ch đ i gen eip18 c a vi khu n ng pháp LAMP” nh m xác đ nh nhanh, xác, an toàn tác nhân gây b nh gan th n m cá tra đ t có nh ng bi n pháp ki m soát u tr d ch b nh k p th i Khóa lu n t t nghi p Nguy n Th Nga – Tr ng i h c Khoa h c t nhiên CH K53B-CNSH NG 1: T NG QUAN TẨI LI U 1.1 VI KHU N Edwardsiella ictaluri 1.1.1 c m sinh h c vƠ đ c m h gen Edwardsiella m t nh ng chi m i c a h Enterobacteriaceae đ c đ t tên theo tên nhà bác h c ng i M P.R Edwards (1901–1966) ng i đ u tiên phân l p phân lo i đ c vi khu n Chi Edwardsiella g m loài: Edwardsiella tarda, Edwardsiella ictaluri, Edwardsiella hoshinae E.tarda E ictaluri đ c xem nh ng đ i t ng gây b nh ch y u cá da tr n Khác v i E tarda có kh n ng gây b nh c đ ng v t ng i vi khu n E ictaluri ch tìm th y loài đ ng v t máu l nh đ c bi t môi tr ng n c ng t Các đ c m sinh hóa c a vi khu n E ictaluri sai khác v i E tarda m t s đ c tính nh không sinh H2S, không sinh indole, di đ ng 25ºC không di đ ng 37ºC Vi khu n thu c chi Edwardsiella mang đ c m n hình c a h Enterobacteriaceae: vi khu n Gram âm, hình que th ng, nh , kích th c 1ì2-3 àm, khụng hỡnh thnh bo t v di đ ng b ng tiên mao, hô h p k khí tùy ti n Kích th c khu n l c môi tr ng c s sau 24 gi nuôi c y r t nh (0,5-1 mm) [8] A B Hình 1: Vi khu n Edwardsiella ictaluri soi d i kính hi n vi n t (A) nhu m Gram (B) [33] Trong phịng thí nghi m, nhi t đ t i u cho t ng tr ng c a E ictaluri nuôi c y ng nghi m t 25 - 30ºC nhi t đ cho b nh b t đ u xu t hi n ngồi mơi tr ng kho ng 22 - 28ºC ph n ánh s thích ng c a chúng v t ch bi n nhi t Trong E tarda E hoshinae sinh tr ng phát tri n nhi t đ cao h n, kho ng 37ºC M t khác bi t n a so v i hai ch ng l i, E ictaluri sinh tr ng r t ch m môi tr ng th ch đ a, thông th ng sau 2-3 ngày Khóa lu n t t nghi p Nguy n Th Nga – Tr ng i h c Khoa h c t nhiên nuôi c y K53B-CNSH 30ºC m i t o thành khu n l c kích th c mm V m t sinh hóa, E ictaluri c ng ho t tính h n so v i loài Edwardsiella khác [8] Genome c a E ictaluri m t nhi m s c th đ n d ng vịng, có kích th c kho ng 2,15 Mb Nghiên c u DNA ch r ng E ictaluri liên quan ch t ch nh t đ n E tarda Trong h gen c a E ictaluri h gen eip đ c tr ng ch có lồi E ictaluri H gen bao g m 11 gen gen xác đ nh mã hóa cho protein Trong s có gen l n l t eip18, eip19, eip20 mã hóa cho s n ph m protein v i tr ng l ng kho ng 18, 19 20 kDa Theo Moore c ng s (2002) gen eip18 đ c bi u hi n trình nhi m b nh đóng vai trị kháng nguyên gây đáp ng mi n d ch [17] Do h gen mang tính đ c tr ng cho lồi nên có th s d ng m t s gen đ phân l p đ n loài b ng ph ng pháp sinh h c phân t Hi n nay, gen eip18 gen đ c dùng nhi u nghiên c u đ phát hi n, đ nh danh vi khu n E ictaluri, tác nhân gây b nh nhi m trùng huy t cá da tr n M [31] 1.1.2 Tình hình b nh d ch E ictaluri đ c phát hi n tác nhân gây b nh gan th n m cá da tr n (Ictalurus punctatus) nuôi bang ông nam M b i Hawke n m 1981[10] Cá th ng b nhi m b nh vào tháng cu i n m nhi t đ n c h th p (kho ng t tháng đ n tháng n m sau) Tuy nhiên, hi n m r ng di n tích ni tr ng ki m sốt d ch khơng t t d n đ n vi c d ch b nh di n quanh n m Vi t Nam, nh ng n m g n cá tra loài cá n c ng t đ c nuôi xu t kh u nhi u nh t so v i đ i t ng th y s n khác N m 2011 xu t kh u cá tra đ t 1,806 t USD, kh i l ng xu t kh u 600 nghìn t n [3] i t ng đ c nuôi v i quy mô công nghi p m t s t nh đ ng b ng Sông C u Long nh : An Giang, ng Tháp, C n Th , B n Tre, Ti n Giang… Nuôi tr ng cá tra m t nh ng ngành có t c đ phát tri n r t nhanh đem l i l i nhu n cao cho ng i dân B nh gan th n m xu t hi n đ u tiên n c ta vào cu i n m 1998 [4] M c dù đ c phát hi n mu n h n so v i m t s b nh khác nh ng b nh gan th n m đ c đánh giá b nh gây thi t h i nghiêm tr ng Theo báo cáo n m 2011, t ng di n tích th ni c a đ a ph ng thu c đ ng b ng Sông C u Long vào kho ng 6.800 ha, b nh gây thi t h i kho ng 500 [3, 35] T l cá ch t nhi m b nh cao, t 50 - 60% nguy hi m nh t giai đo n cá gi ng, t l cá ch t có th lên t i 90% [6] Khóa lu n t t nghi p Nguy n Th Nga – Tr ng i h c Khoa h c t nhiên Khi cá b b nh ng i ni th K53B-CNSH ng dùng ch t hố h c thu c kháng sinh đ ch a tr , nhiên s d ng b a bãi, vi khu n E ictaluri cá tra kháng v i m t s lo i thu c kháng sinh nh : Oxytetracylin, Oxolinic acid, Sulphonamid [1]; Amoxicilin Ampicilin [5] Vi c s d ng kháng sinh làm cho s n ph m th y s n sau th ng khơng đ c a chu ng s tích l y thu c, hố ch t th t Nh v y b nh gan th n m đ c đánh giá m t nh ng b nh gây t n th t l n cho ngành nuôi tr ng th y s n, đ c bi t cá tra cá basa c a n c ta Vi c phân l p đ xác đ nh xác tác nhân gây b nh r t c n thi t đ ng i nuôi tr ng th y s n có th phịng tr b nh 1.2 CÁC PH NG PHÁP PHÁT HI N VI KHU N E ictaluri 1.2.1 Ph ng pháp truy n th ng 1.2.1.1 Ph ng pháp vi sinh Ph ng pháp phân l p m t ph ng pháp c b n dùng đ phát hi n vi khu n M u b nh ph m sau thu nh n đ c nuôi c y môi tr ng ch n l c riêng dành cho vi khu n E ictaluri EIM (Edwardsiella ictaluri medium) Vi khu n phát tri n EIM đ c phân bi t v i E ictaluri d a hình thái c a khu n l c EIM c ch vi khu n Gr (+) ngo i tr c u khu n (Enterococci) Ngoài ra, fungizone c ng đ c thêm vào EIM nh m ng n ch n s phát tri n c a h u h t lo i n m EIM cho phép đánh giá ngu n môi tr ng, m c đ nhi m ngu n mang E ictaluri Sau c y tr i vi khu n môi tr ng EIM, nuôi c y nhi t đ 28oC sau 24 – 48 gi thu đ kích th c t 0,5 – mm [27] c khu n l c đ n có hình trịn nh màu xanh 1.2.1.2 Xác đ nh ho t tính sinh hóa n hình Bên c nh ph ng pháp vi sinh, đ phát hi n xác vi khu n E ictaluri, ta ti n hành ph n ng sinh hóa đ c tr ng c a E ictaluri nh : ho t tính catalase (+), ho t tính oxydase (-), kh n ng sinh Indole (-), sinh H2S (-), sinh axit môi tr ng sucrose, monitol, arabinose E ictaluri có ho t tính protease r t h n ch , không phân h y casein, gelatin, collagen nh ng l i phân h y chrondroitin sulfate có ho t tính tan huy t [8] Vi c phân lo i d a vào ph ng pháp truy n th ng t n th i gian mà đ xác ch a cao nên r t h n ch ch n đoán d ch b nh Khóa lu n t t nghi p Nguy n Th Nga – Tr ng i h c Khoa h c t nhiên 1.2.2 Ph K53B-CNSH ng pháp PCR vƠ sequensing 1.2.2.1 Phân lo i d a vào 16S rDNA Vi c s d ng trình t gen mã hóa 16S rRNA đ nghiên c u phát sinh loài vi khu n phân lo i đ c s d ng r t ph bi n Gen mã hóa 16S rRNA t n t i nh m t h đa gen ho c operon; ch c n ng c a gen mã hóa 16S rRNA khơng thay đ i theo th i gian cho th y s thay đ i th t ng u nhiên m t th c đo xác q trình ti n hóa gen 16S rRNA có kích th c kho ng 1500 bp đ l n cho m c đích thơng th ng dùng phân lo i c p đ phân t [21] i v i hai loài E ictaluri E tarda, sau s d ng PCR nhân trình t 16S rDNA, đ c trình t cho th y đ t ng đ ng rDNA c a hai loài lên t i 99,6% [5] c ng ch có th k t lu n tác nhân gây b nh thu c chi Edwardsiella Nh v y k t h p ph ng pháp truy n th ng ph vào 16S rDNA có th phát hi n đ c ng dài, lên đ n ngày ng pháp phân lo i d a c E ictaluri song t ng th i gian nghiên c u 1.2.2.2 Phân lo i d a vào gen đ c tr ng Gen eip18 m t ba gen đ c tr ng ch có E ictaluri mà khơng có E tarda, đ c xem m t nh ng ch th phân t đ xác đ nh xác đ n c p đ lồi Vì v y đ ki m tra xem ch ng vi khu n có ch a đo n gen có th s d ng ph ng pháp PCR v i c p m i eip18 nh m nhân s l ng l n gen eip18 đ i v i nh ng ch ng có đo n gen Sau khu ch đ i, s n ph m đ c n di nhu m Ethidium bromide Tồn b qui trình đ đ c đ c k t qu m t kho ng ti ng [7] v i k thu t ph c t p, máy móc đ t ti n, thu c nhu m DNA đ c h i 1.2.3 Ph ng pháp LAMP N m 2000, Notomi c ng s phát tri n k thu t LAMP (Loop-mediated isothermal amplifications), m t ph ng pháp phát hi n d a vi c khu ch đ i m t trình t DNA có s n u ki n đ ng nhi t [20] T đ n k thu t đ c th gi i ng d ng đ phát hi n r t nhi u tác nhân sinh h c bao g m virut, vi khu n, n m, kí sinh trùng…, có E ictaluri [26] LAMP có kh n ng t ng h p m t l ng l n DNA, RNA mà không c n máy gia nhi t t đ ng Ph ng pháp LAMP d a vào trình t ng h p DNA đ c th c hi n b i m t DNA polymerase có ho t tính t tách chu i cao hai c p m i đ c hi u B c đ u tiên c a trình b n m i đ c s d ng, sau hai m i đ cs d ng cho m i chu k Tồn b q trình khu ch đ i đo n DNA đích c n th i gian Khóa lu n t t nghi p Nguy n Th Nga – Tr ng i h c Khoa h c t nhiên K53B-CNSH kho ng 60 phút S n ph m cu i nh n đ c đo n DNA d ng g p khúc có kích th c g p nhi u l n kích th c c a đo n gen đích DNA polymerase th ng đ c s d ng ph n ng LAMP Bst DNA polymerase ho c Bsm polymerase Ph ng pháp LAMP r t nh y, có th thu đ c k t qu t t n ng đ DNA th p [31] Tuy nhiên, m i dùng cho ph n ng LAMP l i ph c t p h n m i cho ph n ng PCR thông th ng Ph n ng LAMP c n ph i s d ng nh t hai c p m i, m t c p có chi u dài 40 nucleotide đ c thi t k đ c bi t, c p cịn l i có chi u dài kho ng 20 nucleotide Do đó, đ đ c hi u c a ph n ng cao h n nhi u so v i ph ng pháp PCR Nh ng u m c a ph ng pháp LAMP so v i ph ng pháp PCR: - Khơng địi h i máy bi n nhi t đ t ti n nh PCR b i t t c ph n ng di n t i nhi t đ c đ nh Do v y ch c n m t máy n nhi t đ n gi n c a phịng thí nghi m bình th ng - K t qu có th đ c đ c sau ph n ng k t thúc mà không c n n di gel agarose d a vào s t o thành Mg2P2O7 k t t a s n ph m ph c a ph n ng khu ch đ i gen có th đ c xác đ nh b ng ly tâm ho c đo đ đ c Ho c d a vào s chuy n màu c a ch th kim lo i ví d Calcein, FDR (Fluorescent detected reagent), HNB (Hydroxyl naphthol blue) hay SYBR Green I - Th i gian th c hi n ph n ng r t ng n, v i gi i h n phát hi n cao g p h n k thu t PCR t 10 – 1000 l n - đ c hi u cao s d ng c p m i nh n bi t trình t khác bi t DNA đích b - Hàm l c đ u tiên trình t ng DNA t ng h p đ b c sau c l n h n g p nhi u l n so v i PCR - B ng s ph i h p v i enzyme mã ng c, LAMP có th khu ch đ i trình t RNA v i đ đ c hi u cao 1.2.3.1 nh ngh a LAMP (loop- mediated isothermal amplification) ph ng pháp khu ch đ i DNA u ki n đ ng nhi t có s t o thành vịng loop phân t s n ph m d i s h tr c a enzyme có ho t tính t tách chu i cao s có m t c a m i đ c hi u 1.2.3.2 M i cho ph n ng LAMP Ph n ng LAMP c n nh t m i: c p m i ngồi F3, B3 có vai trị vi c chuy n m ch nên ch tham gia vào giai đo n đ u c a ph n ng; c p m i Khóa lu n t t nghi p Nguy n Th Nga – Tr ng i h c Khoa h c t nhiên K53B-CNSH FIP, BIP m i lai ch a c trình t khn đ i khn giúp cho vi c hình thành vịng loop M i ngồi ng c B3 b sung v i B3c c a DNA, m i ngồi xi F3 b sung v i F3c c a DNA M i xuôi FIP g m F1c đ u 5’ gi ng trình t F1c DNA đích F2 đ u 3’ b sung v i F2c DNA đích, t ng t m i ng c BIP g m B1c đ u 5’ có trình t gi ng B1c DNA đích B2 đ u 3’ có trình t b sung v i vùng B2c DNA đích Hình 2: M i cho ph n ng LAMP vùng khác bi t s i DNA khuôn đ c kí hi u F3, F2, F1, B1c, B2c B3 t đ u 5’ Kí t c có ngh a vùng trình t n m s i b sung, trình t F1c trình t b sung v i trình t F1, B1c trình t b sung v i trình t B1, B2c trình t b sung v i trình t B2 Hai m i BIP FIP hai m i F3 B3 đ c s d ng ph n ng LAMP FIP (BIP) m i lai có ch a trình t F1c (B1c) F2 (B2) Thi t k m i thích h p m t chìa khóa quan tr ng khu ch đ i gen s d ng ph ng pháp LAMP Có th thi t k m i th cơng ho c s d ng ph n m m Các m đ thi t k m t m i t i u [20,29]: - Các m k t thúc c a m i không đ c giàu AT đ tránh s t o thành c u trúc b c c a m i s b t c p v i m i khác - Nhi t đ nóng ch y Tm c a m i vùng kho ng 55-65ºC, t ng đ ng v i nhi t đ t i u c a Bst polymerase - Tm c a F1c B1c h i cao h n F2 B2 đ c u trúc loop đ c hình thành sau s i đ n DNA đ c gi i phóng t m ch g c - Tm c a m i (B3, F3) nh h n F2, B2 đ đ m b o r ng s t ng h p nh c p m i x y tr c c p m i ngồi Thêm vào n ng đ c p m i b ng 1/4 đ n 1/10 c p m i Khóa lu n t t nghi p Nguy n Th Nga – Tr ng i h c Khoa h c t nhiên K53B-CNSH - Kho ng cách gi a đo n trình t t đ u 5’ c a F2 B2 kho ng 120-180 bp, kho ng cách gi a đo n F2-F3 B2-B3 t đ n 20 bp Kho ng cách vùng t o loop (t đ u 5’ c a F2 t i 3’ F1 5’ B2 đ n 3’ B1) kho ng 4060bp - Chi u dài c a trình t DNA khu ch đ i (t F2 đ n B2) không nên l n h n 200bp tinh t c a m i r t quan tr ng đ kh n ng tái khu ch đ i nhanh chóng - N u gen đích ho c vùng ch a primer có v trí c t c a enzyme gi i h n có th đ c s d ng đ xác đ nh xác s n ph m khu ch đ i 1.2.3.3 Nguyên lý c a ph ng pháp LAMP LAMP m t trình t ng h p DNA t đ ng đ c th c hi n m t nhi t đ không đ i t 60-65ºC kho ng th i gian 45-60 phút v i s có m t c a Bst DNA polymerase, dNTP, v i nh t m i đ c thi t k b sung v i trình t riêng bi t gen đích Có hai b c khu ch đ i LAMP b c không theo chu k b c theo chu k [22] - B c không theo chu k : m c tiêu t o s i DNA có hai vịng loop hai đ u, c u trúc kh i đ u cho b c LAMP theo chu k V i ph ng pháp LAMP, khơng gi ng nh PCR, khơng c n có s bi n tính DNA s i đơi b i nhi t đ Thông qua ho t đ ng c a DNA polymerase có ho t tính t tách chu i cao, m i đ c g n vào DNA đích, b t đ u t khu v c F2 đ u 3’ c a FIP, t ng h p DNA m i theo nguyên t c b sung Sau đó, m i F3 liên k t v i khu v c F3c bên m i FIP, t ng h p s i DNA b sung v i DNA đích thay th s i DNA mà FIP t ng h p, m t s i DNA đơi đ c hình thành t s i DNA đ c t ng h p t m i F3 DNA đích, gi i phóng m t s i DNA đ n có đ u FIP S i đ n hình thành c u trúc loop đ u 5’ s b sung gi a F1c F1 S i DNA đ n đ c dùng làm khn kh i đ u q trình t ng h p DNA b ng m i BIP B3, trình t ng h p t ng t nh b t đ u t v trí 3’ c a BIP Sau đó, m i B3 t ng h p m t s i m i b sung v i khn nên gi i phóng s i đ n đ c t ng h p b i m i BIP S i DNA đ n hình thành c u trúc loop hai đ u nhìn gi ng qu t DNA c u trúc gi ng qu t nhanh chóng t ng h p DNA s t m i C u trúc c u trúc kh i đ u cho s khu ch đ i hàm m theo chu k k ti p (Hình 3) Khóa lu n t t nghi p Nguy n Th Nga – Tr ng i h c Khoa h c t nhiên Hình 3: B K53B-CNSH c t o c u trúc kh i đ u (không theo chu k ) Quá trình đ c kh i đ u m i FIP, vùng F2 b t c p v i vùng F2c s i DNA khuôn kh i đ u cho s kéo dài chu i v phía đ u 5’ c a s i khuôn Ti p t c đ n m i BIP, vùng B2 c ng g n v i vùng B2c c a s i DNA kéo dài chu i M i F3 ti p t c đ n g n vào v trí F3c DNA khn, m t s i m i đ c t ng h p t m i F3 thay th cho s i t ng h p b i m i FIP S i đ n t ng h p b ng m i FIP s b đ y hình thành nên m t c u trúc loop đ u 3’ c a (c u trúc 3) Q trình s đ c ti p di n v i m i BIP m i B3 Cu i m t s i đ n có c u trúc loop c hai đ u 3’ 5’ đ c hình thành (c u trúc 5) - Khu ch đ i theo chu k : chu k LAMP, m i liên k t b sung v i đo n loop s n ph m b t đ u t ng h p s i DNA thay th , t o s i DNA loop m i v i chi u dài g p đôi Trong th i gian ng n, m i FIP liên k t v i đo n loop c a s i đ n g c, t ng h p s i DNA thay th , phát hành s i t ng h p tr c t o s i đ n có c u trúc loop đ u 3’ liên k t b sung gi a B1c B1 Sau đó, b t đ u t đ u 3’ c a B1, s t ng h p DNA b t đ u b ng cách s d ng c u trúc c a b n thân nh khuôn gi i phóng s i b sung liên k t v i FIP, s i đ n có c u trúc gi ng qu t v i loop hai đ u b sung gi a F1-F1c, B1-B1c H n n a, BIP liên k t v i B2c t ng h p s i thay th , gi i phóng s i DNA m i b i B1 K t qu t o c u trúc có kích th c khác nhau, g m trình t l p l i luân phiên đ o ng c c a trình t đích s i m i đ c t o thành Ph n ng theo chu k ti p t c v i s tích l y c a 109 b n c a DNA đích vịng ch a đ y gi Khóa lu n t t nghi p Nguy n Th Nga – Tr ng i h c Khoa h c t nhiên K53B-CNSH S n ph m cu i DNA m ch đơi có c u trúc g n gi ng súp l v i r t nhi u loop đ c t o thành v i trình t l p l p l i luân phiên đ o ng trình t đích m t s i (Hình 4) Hình 4: B c c khu ch đ i theo chu k S d ng c u trúc 5’ làm s i khuôn, DNA t m i đ c kh i đ u t đ u 3’ c a vùng F1 b t đ u kéo dài t m i FIP g n v i vùng F2c c u trúc loop Qua m t vài b c, c u trúc s đ c hình thành c u trúc b sung v i c u trúc C u trúc đ c hình thành t c u trúc ph n ng theo ki u hình thành c u trúc 5-7 C u trúc c u trúc 10 đ c hình thành t c u trúc c u trúc 8, c u trúc kéo dài h n ti p t c đ c t o thành 1.2.3.4 DNA đích Hi u qu c a ph n ng LAMP ph thu c vào kích th c c a DNA đích K t qu t t nh t DNA đích có kích th c 130-200 bp N u DNA đích dài h n 500bp v n có th khu ch đ i đ c nh ng r t khó Vì v y kích th h n 300bp bao g m c F2 B2 [20] c DNA đích c n nh 1.2.3.5 Bst/Bsm DNA polymerase Enzyme t o s polymerase v i kh i l khu ch đ i t t nh t cho ph n ng LAMP Bst DNA ng phân t 67000 dalton, th ng đ c mã hóa b i gen n m nhi m s c th c a Bacillus stearothermophillus Bst DNA polymerase m t DNA polymerase có ho t tính 5’-3’ polymerase ho t tính t tách chu i cao nh ng l i thi u ho t tính 3’-5’ exonuclease Bst DNA polymerase có đ ho t đ ng r t cao, ho t đ ng nhi t đ t i u 60ºC- 65ºC B b t ho t nhi t đ l n h n 70ºC Nó v a có kh n ng tách chu i, v a có kh n ng t ng h p chu i m i Do 10 Khóa lu n t t nghi p Nguy n Th Nga – Tr ng i h c Khoa h c t nhiên K53B-CNSH K t qu cho th y r ng betaine n ng đ 0,1 M, s n ph m ph n ng LAMP đ c khu ch đ i rõ ràng Khi n ng đ betaine ph n ng t ng lên b ng DNA xu t hi n to rõ ràng h n (Hình 13A) Thí nghi m đo s n ph m ph n ng t i OD400 c ng cho k t qu t ng t , giá tr OD400 đ c xác đ nh t n ng đ betaine 0,1 M, t 0,2 M tr lên giá tr OD400 xác đ nh đ c cao nh t n đ nh ch ng t ph n ng khu ch đ i di n t t nh t Nh v y, có th s d ng n ng đ betaine ph n LAMP đ khu ch đ i m t ph n gen eip18 t 0,2 M ng nh h ng c a t l m i ngoƠi vƠ m i Theo nh Notomi c ng s phát tri n ph ng pháp LAMP cho th y, t l m i m i ngồi ln khác giai đo n đ u c a s khu ch đ i ch y u dùng đ n m i ngồi B3 F3 đ t o s i khn cho ph n ng LAMP Nh ng giai đo n khu ch đ i theo chu k l i ch y u s d ng m i BIP FIP cho nên, n ng đ m i ch nên b ng ¼ đ n 1/10 n ng đ m i [20] N m 3.2.3 2004, Ihira c ng s công b r ng t l m i dao đ ng l n s làm nh h ng đ n đ nh y c a ph n ng LAMP Do đó, chúng tơi th c hi n thí nghi m v t l m i ngồi m i nh h ng nh th đ n k t qu c a ph n ng S d ng n ng đ dNTP 0,5 mM, Betaine 0,2 M xác đ nh trên, ph n ng LAMP ti p t c đ c th c hi n v i t l m i ngoài:m i 1:1, 1:2, 1:3, 1:4, 1:5, 1:6, 1:7 1:8 đ khu ch đ i đ c hi u gen eip18 N ng đ m i ngồi có m i ph n ng 0,16 M i v i m i t l m i th c hi n song song m t ph n ng khơng có DNA khuôn làm đ i ch ng S n ph m ph n ng LAMP ki m tra s nh h ng c a t l m i đ c phân tích gel agarose 2% song song v i vi c đo OD400 s n ph m ph n ng 26 Khóa lu n t t nghi p Nguy n Th Nga – Tr ng i h c Khoa h c t nhiên K53B-CNSH A OD400 1.4 1.2 0.8 0.6 0.4 0.2 B 1|1 1|1 1|2 1|2 1|3 1|3 1|4 1|4 1|5 1|5 1|6 1|6 1|7 1|7 1|8 1|8 (-) (+) (-) (+) (-) (+) (-) (+) (-) (+) (-) (+) (-) (+) (-) (+) T l m i ngoƠi: m i Hình 14: nh h ng c a t l (m i ngoài: m i trong) đ n ph n ng LAMP A: K t qu n di gel agarose, nhu m EtBr soi d i tia UV B: Giá tr OD400 c a h n h p ph n ng sau th i gian 60 phút 65oC 1-2: t l 1:1; 3-4: t l 1:2; 5-6: t l 1:3; 7-8: t l 1:4; 9-10: t l 1:5; 11-12: t l 1:6; 13-14: t l 1:7; 15-16: t l 1:8 Các đ ng ch y l đ i ch ng khơng có DNA M: marker 100bp K t qu hình 14 cho th y, DNA đ c khu ch đ i t l m i 1:2 Khi n ng đ m i cao h n l ng DNA đ c khu ch đ i nhi u h n Và t l 1:4 ph n ng LAMP cho hàm l ng DNA đ c khu ch đ i n đ nh ( ng v i đ ng ch y 8) c th c hi n thí nghi m riêng bi t Nh v y có th l a ch n t l m i ngoài:m i 1:4 đ th c hi n nghiên c u ti p theo 27 Khóa lu n t t nghi p Nguy n Th Nga – Tr ng i h c Khoa h c t nhiên K53B-CNSH nh h ng c a n ng đ Mg2+ Mg2+ có nh h ng tr c ti p t i s phát quang c a Calcein đ ng th i theo Saiki c ng s (1998) ion Mg2+ t có th nh h ng đ n nhi t đ g n m i 3.2.4 ho t tính c a DNA polymerase Ph n ng LAMP đ c th c hi n t i u ki n n ng đ dNTP 0,5 mM, betaine 0,2 M, t l m i ngoài:m i 1:4 v i n ng đ MgSO4 cu i ng ph n ng thay đ i t – 10 mM i v i m i n ng đ Mg2+, th c hi n song song m t ph n ng khơng có DNA làm đ i ch ng âm B ng 5: nh h CMg2+ ng c a n ng đ Mg2+ lên s đ i mƠu c a Calcein 0mM 1mM 2mM 3mM 4mM 6mM 7mM 8mM 9mM 10Mm (+)/(-) 5mM K t qu thu đ c cho th y s khác bi t màu s c gi a m u âm m u d ng b t đ u c p ng ph n ng có n ng đ Mg2+ ban đ u 4mM (B ng 5): m u d ng có màu vàng chanh ch ng t ph n ng khu ch đ i DNA di n ra, m u âm có màu da cam khơng có ph n ng khu ch đ i nh ng n ng đ Mg2+ th p h n 4mM khơng có s khác bi t màu s c gi a m u âm m u d ng (đ u có màu cam) ch ng t DNA không đ c khu ch đ i t i n ng đ mM (đ ng ch y s 9) khu ch đ i đ c gen đích th hi n b n n di gel agarose (Hình 15A) nh ng n ng đ Mg2+ cao h n 4mM s khác bi t màu s c gi a m u âm m u d ng c a m i c p n ng đ c ng gi ng v i c p n ng đ Mg2+ mM, b n n di gel agarose hàm l n ng đ Mg2+ mM K t qu t m ud ng DNA đ ng t đo đ đ c c khu ch đ i c ng không thay đ i so v i b c sóng 400 nm (Hình 15B), v i ng t n ng đ Mg2+ mM, giá tr OD400 đ 28 Khóa lu n t t nghi p c xác đ nh không khác Nguy n Th Nga – Tr ng i h c Khoa h c t nhiên đ ng ngh a v i vi c ph n ng đ c khu ch đ i v i c K53B-CNSH ng đ nh Các m u d ng có b sung Mg2+ v i n ng đ th p h n mM m u âm giá tr OD400 b ng ch ng t ph n ng không di n OD400 0.8 0.7 0.6 0.5 0.4 0.3 0.2 0.1 N ng đ Mg2+ (mM) B Hình 15: nh h ng c a n ng đ MgSO4 đ n ph n ng LAMP A: K t qu n di s n ph m ph n ng LAMP khu ch đ i đo n gen eip18 agarose 2% M: marker 100 bp; 1-2: mM MgSO4; 3-4: mM MgSO4; 5-6: mM MgSO4; 7-8: mM MgSO4; 9-10: mM MgSO4; 11-12: mM MgSO4; 13-14: mM MgSO4; 15-16: mM MgSO4; 17-18: mM MgSO4; 19-10: mM MgSO4; 21-22: 10 mM MgSO4 Các đ ng ch y ch n đ i ch ng khơng có DNA B: Giá tr OD400 c a h n h p ph n ng sau th i gian 60 phút 29 Khóa lu n t t nghi p 65oC Nguy n Th Nga – Tr ng i h c Khoa h c t nhiên K53B-CNSH K t qu hoàn toàn phù h p v i công b c a Kuboki c ng s (2003), Notomi c ng s (2000) Các nghiên c u khác liên quan đ n LAMP v nh h ng c a n ng đ ion Mg2+ đ n ph n ng cho th y, tùy đ dài c a m i, đ dài c a gen đích mà l ng Mg2+ t i u đ c b sung vào có th khác Trong nghiên c u c a Yeh c ng s n m 2005 cho th y l ng Mg2+ t i u 6mM, t ng t công b c a Qiao c ng s n m 2007 nhân gen gag b ng ph n ng LAMP đ xác đ nh s có m t c a b o t vi khu n Bacillus anthracis nhóm th c ph m ch a tinh b t n ng đ Mg2+ t i u 6mM Nhi u nghiên c u khác v LAMP c ng ch r ng gi i h n n ng đ Mg2+ t i u t 4mM đ n 8mM [25,20] T thí nghi m s d ng Mg2+ 4mM cho ph n ng LAMP khu ch đ i gen eip18 v i s có m t c a Calcein làm ch th kim lo i phát tín hi u hu nh quang cho nghiên c u ti p theo 3.2.5 nh h ng c a nhi t đ ph n ng Theo khuy n cáo c a nhà cung c p, ho t tính t i u c a Bst DNA polymerase đ t đ c nhi t đ 65 C Nh ng m t s tác gi l i công b k t qu ph n ng t t nh t x y nhi t đ th p h n [9,13,23] S d ng n ng đ dNTP o 0,5 mM, betaine 0,2 M, t l m i ngoài:m i 1:4, Mg2+ mM xác đ nh đ c, ph n ng LAMP đ c th c hi n m t s nhi t đ khác nhau, bao g m: 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75 80oC K t qu hình 16 cho th y nhi t đ thích h p đ ph n ng khu ch đ i DNA x y n m kho ng t 55oC đ n 65oC, Calcein chuy n t màu da cam (tr c ph n ng) sang màu vàng chanh (sau ph n ng), ng th c hi n nhi t đ th p h n 55 oC cao h n 65 oC không di n trình khu ch đ i nên Calcein v n gi màu da cam gi ng nh tr c ph n ng (Hình 16B) T ng ng, v i k t qu n di gel agrarose, b ng DNA ch xu t hi n nhi t đ 55, 60, 65ºC ( ng ch y 6,7,8, Hình 16A) t ng ng v i k t qu đo đ đ c, giá tr OD 400 ch xác đ nh đ c ba nhi t đ (Hình 16C) Song đ đ m b o m c đ n đ nh c a ph n ng phù h p v i ho t đ ng t i u c a enzyme Bst polymerase, giá tr nhi t đ 65oC đ c ch n đ th c hi n ph n ng Thêm vào đó, nhi t đ Tm trung bình c a m i 63.5oC hồn toàn phù h p đ ph n ng di n đ ng nh t 30 Khóa lu n t t nghi p Nguy n Th Nga – Tr ng i h c Khoa h c t nhiên K53B-CNSH OD400 0.8 0.6 0.4 0.2 C Hình 16: nh h 30 35 40 45 50 55 60 65 70 Nhi t đ ph n ng (oC) 75 80 ng c a nhi t đ ph n ng lên ph n ng LAMP s đ i màu c a Calcein A: K t qu n di gel agarose, nhu m EtBr soi d i tia UV B: S thay đ i màu s c c a Calcein ng quan sát d i ánh sáng th ng 1: 30ºC; 2: 35ºC; 3: 40ºC; 4: 45ºC; 5: 50ºC; 6: 55ºC; 7: 60ºC; 8: 65ºC; 9: 70ºC; 10: 75ºC; 11: 80ºC; M: marker 100bp C: Giá tr OD400 c a h n h p ph n ng sau th i gian 60 phút 3.2.6 nh h ng c a th i gian ph n ng Trong ch n đốn tác nhân gây b nh th i gian ch n đốn đóng vai trị h t s c quan tr ng u tr M t s ph ng pháp phát hi n th ng dùng phịng thí nghi m nh ph ng pháp vi sinh (c n đ n ngày), ph ng pháp PCR truy n th ng (kho ng 180 phút) M t s nghiên c u c ng ch r ng th i gian c n thi t cho ph n ng LAMP cho k t qu t t d i 60 phút [13,26] Tùy t ng b m i, gen đ c s d ng mà xác đ nh đ c th i gian thích h p s d ng cho ph n ng S d ng n ng đ dNTP 0,5 mM, betaine 0,2 M, t l m i ngoài:m i 1:4, Mg2+ mM nhi t đ ph n ng 65ºC xác đ nh đ c, ti n hành d ng ph n ng LAMP m t s th i m khác nhau, bao g m: 0, 5, 10, 31 Khóa lu n t t nghi p Nguy n Th Nga – Tr ng i h c Khoa h c t nhiên K53B-CNSH 15, 20, 30, 40, 45, 50, 55, 60 phút sau th c hi n ph n ng K t qu thu đ c quan sát s đ i màu c a Calcein ng s n ph m ph n ng cho th y th i gian 40 phút tr lên d i ánh sáng th ng ng có màu vàng chanh ch ng t DNA đ c khu ch đ i, n di agarose 2% th y r ng sau 30, 35 phút có hi n t ng lên v t nh ng m ch a t p chung thành b ng, 40 phút ph n ng tr lên s n ph m LAMP đ c khu ch đ i t o thành b ng gi ng nh thang chu n DNA có th quan sát b ng m t th ng b n n di (Hình 17) K t qu t ng đ ng v i k t qu đo OD400 s n ph m khu ch đ i OD400 b t đ u đ c xác đ nh giá tr 30 phút, giá tr t ng d n lên n đ nh h n 50- 60 phút (Hình 17C) OD400 0.8 0.7 0.6 0.5 0.4 0.3 0.2 0.1 C Hình 17: nh h th (-) 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Th i gian ph n ng (phút) ng c a th i gian lên ph n ng LAMP s đ i màu c a Calcein A: K t qu n di gel agarose, nhu m EtBr soi d i tia UV B: S thay đ i màu s c c a Calcein ng quan sát d i ánh sáng ng M: marker 100bp; 1: m u âm; 2: phút; 3: phút; 4: 10 phút; 5: 15 phút; 6: 20 phút; 7: 25 phút; 8: 30 phút; 9: 35 phút; 10: 40 phút; 11: 45 phút; 12: 50 phút; 13: 55 phút; 14: 60 phút C: Giá tr OD400 c a h n h p ph n ng 32 Khóa lu n t t nghi p 65ºC Nguy n Th Nga – Tr ng i h c Khoa h c t nhiên Nh v y, b ng ph K53B-CNSH ng pháp n di ph ng pháp đo OD400 chúng tơi có th xác đ nh ph n ng LAMP có x y hay khơng sau 30 phút th c hi n ph n ng, v i ph ng pháp s d ng Calcein ch th màu đ phát hi n s n ph m ph n ng LAMP ng ng th i gian phát hi n 40 phút (nh vào s khác bi t gi a màu vàng chanh c a ph n ng khu ch đ i đ c DNA màu da cam c a ph n ng ch a khu ch đ i đ c DNA) Tuy nhiên, v i yêu c u ph ng pháp đ n gi n, không đ c h i, d s d ng, ng d ng đ c r ng rãi, khơng c n k thu t cao, máy móc đ t ti n s d ng Calcein đ phát hi n s n ph m ph n ng LAMP có u m v t tr i có tính ng d ng cao h n h n ph ng pháp khác 3.2.7 Gi i h n phát hi n c a ph n ng LAMP xác đ nh gi i h n phát hi n c a ph n ng LAMP khu ch đ i gen eip18 c a vi khu n E ictaluri, ph n ng LAMP đ c ti n hành v i n ng đ DNA khuôn gi m 10 l n cho m i thí nghi m b t đ u t 94 ng/l t i 0,094 fg/µl u ki n n ng đ dNTP 5mM, Betaine 0,2 M, t l m i ngoài:m i 1:4, Mg2+ 4mM, nhi t đ t 55-65ºC th i gian ph n ng 40-60 phút Sau ph n ng, ti n hành quan sát s thay đ i màu c a Calcein d i ánh sáng th ng cho th y: v i ng ph n ng t đ n có màu vàng chanh ch ng t ph n ng khu ch đ i DNA di n ra, ng ng 10 có màu cam đ ng ngh a v i vi c ph n ng LAMP khơng di n ng (Hình 18B) S n ph m ph n ng đ c ki m tra l i b ng n di gel agarose 2%, nhu m EtBr quan sát b ng m t th ng d i ánh sáng UV cho th y ng ph n ng pha loãng t đ n 107 l n xu t hi n b ng DNA nh thang chu n DNA ch ng t DNA đ c khu ch đ i ( ng ch y t 1-8, Hình 18A), n ng đ pha lỗng 108 109 l n khơng có s khu ch đ i DNA nên không xu t hi n b ng ( ng ch y 9,10, Hình 18A) K t qu thí nghi m cho th y ph n ng LAMP di n v i n ng đ DNA m u r t th p, ch 9,4 fg K t qu quan sát gel agarose 2% s đ i màu c a Calcein ng ph n ng phù h p v i Nh v y, v i ph n ng LAMP có th phát hi n đ vi khu n E ictaluri gi i h n th p nh t 9,4 fg 33 Khóa lu n t t nghi p c gen eip18 đ c tr ng c a Nguy n Th Nga – Tr ng i h c Khoa h c t nhiên K53B-CNSH OD400 0.8 0.7 0.6 0.5 0.4 0.3 0.2 0.1 C pha loưng c a DNA m u Hình 18: Gi i h n phát hi n c a ph n ng LAMP s đ i màu c a Calcein A: K t qu n di gel agarose, nhu m EtBr soi d th i tia UV B: S thay đ i màu s c c a Calcein ng quan sát d i ánh sáng ng C: Giá tr OD400 c a h n h p ph n ng sau th i gian 60 phút 65oC M: marker 100bp; 1: 94 ng; 2: 9,4 ng; 3: 0,94 ng; 4: 94pg; 5: 9,4 pg; 6: 0,94 pg; 7: 94 fg; 8: 9,4 fg; 9: 0,94 fg; 10: 0,094 fg Theo công b c a nhi u tác gi s d ng ph ng pháp LAMP đ phát hi n gen đích cho th y, ph ng pháp c c nh y v i gi i h n phát hi n c c k cao, có th lên đ n femtogram DNA đích Kono so sánh gi i h n phát hi n virut gây b nh đ m tr ng tơm th y b ng ph ng pháp LAMP có th phát hi n đ c virut n ng đ 1fg, b ng ph ng pháp nested-PCR 10 fg [14] C ng dùng ph ng pháp LAMP đ phát hi n n m Fusarium nh ng Nessie công b ch phát hi n đ 3.2.8 c gen đích gaoA - gen mã hóa galactose oxidase đ c hi u c a ph n ng LAMP Theo Yeh c ng s (2005) gen eip18 gen đ c tr ng c a vi khu n E ictaluri nên b m i cho ph n ng LAMP đ n ng đ 2pg [19] c thi t k d a trình t c a gen ki m tra m c đ đ c hi u c a b m i đ 34 Khóa lu n t t nghi p c thi t k , s d ng Nguy n Th Nga – Tr ng i h c Khoa h c t nhiên K53B-CNSH DNA genome c a ch ng E ictaluri E7, E5, E40 phân l p t i Vi t Nam ch ng chu n E.i ATCC 33202 m t s DNA genome tách chi t t ch ng vi khu n khác nh Vibrio sp., P aeruginosa, S typhimurium, S enteretidis, S aureus, E coli, P mirabilis, A hydrophila, Enterococcus sp đ c dùng làm đ i ch ng âm OD400 0.8 0.7 0.6 0.5 0.4 0.3 0.2 0.1 C Hình 19: 10 11 12 13 14 15 16 Các loƠi vi khu n đ c hi u c a ph n ng LAMP khu ch đ i gen eip18 c a vi khu n E Ictaluri A: K t qu n di gel agarose, nhu m EtBr soi d i tia UV B: S thay đ i màu s c c a Calcein ng quan sát d th ng C: Giá tr OD400 c a h n h p ph n ng sau th i gian 60 phút i ánh sáng 65oC 1, 11: E ictaluri E7; 2: E Ictaluri E5; 3: E Ictaluri E40; 4: E Ictaluri Ei; 5: A hydrophila; 6: E tarda ATCC 15469; 7: Vibrio sp.; 8: P aeruginosa; 9: S typhimurium; 10: S Enteritidis; 12: S aureus; 13: E coli; 14: P mirabilis; 15: Enterococcus sp.; 16: đ i ch ng âm không b sung DNA; M: Marker 100 bp 35 Khóa lu n t t nghi p Nguy n Th Nga – Tr ng i h c Khoa h c t nhiên K53B-CNSH K t qu hình 19 ch r ng ch có thí nghi m mà DNA khn DNA genome c a ch ng E ictaluri m i xu t hi n s n ph m ph n ng b ng DNA đ c khu ch đ i n di đ đ ng ch y khác t ng ng v i DNA genome tách chi t t ch ng vi khu n không ph i E ictaluri không th y xu t hi n s n ph m DNA c a ph n ng LAMP (Hình 19A), ch ng ph n ng có DNA khn DNA genome c a ch ng E ictaluri màu c a Calcein m i chuy n sang màu vàng chanh thay màu da cam tr c ph n ng màu da cam c a m u DNA genome c a E ictaluri K t qu đo đ đ c hình 19C c ng t ng ng v i k t qu c a hai ph ng pháp i u ch ng t r ng b m i đ c thi t k cho ph n ng LAMP r t đ c hi u đ phát hi n gen eip18 c a vi khu n E ictaluri 3.2.9 So sánh ch th ph n ng LAMP d A ng b ng Calcein vƠ SYBR Green I B (-) (+) (+) (-) Hình 20: S khác bi t màu gi a ph n ng LAMP âm (khơng có DNA c a E ictaluri) d ng (có DNA c a E ictaluri) b sung ch th màu SYBR Green I (trái) Calcein (ph i) Theo công b c a Lê Nguy n Nguyên H , s d ng SYBR Green I làm ch th màu phát hi n ph n ng LAMP nh Hình 20A cho th y, s khác bi t màu s c gi a ph n ng LAMP âm d ng c a SYBR Green I rõ ràng h n c a Calcein (hình 20B) Tuy nhiên, v i nh c m c a SYBR Green I u m c a Calcein trình bày ph n t ng quan, vi c l a ch n Calcein làm ch th màu phát hi n s n ph m ph n ng LAMP hoàn toàn phù h p u vi t h n c 36 Khóa lu n t t nghi p Nguy n Th Nga – Tr ng i h c Khoa h c t nhiên K53B-CNSH K T LU N Ph n ng LAMP phát hi n nhanh vi khu n E ictaluri E7 ti n hành u ki n ph n ng t i u: 0,5 mM dNTP, 0,2-0,5 mM Betaine, t l (m i ngoài: m i trong) (1:4- 1:8), mM Mg2+, t 55-65oC 40- 60 phút Gi i h n phát hi n c a ph n ng LAMP v i DNA c a E ictaluri E7 xung quanh giá tr 9,4 fg DNA C p m i đ c thi t k đ nh n bi t gen eip18 c a E ictaluri E7 đ c hi u cho vi khu n có th s d ng gen đ phân bi t E ictaluri v i loài g n g i khác Ph n ng LAMP d th c hi n, máy móc đ n gi n, hi u qu khu ch đ i cao mà ch c n th c hi n u ki n đ ng nhi t Tuy nhiên LAMP r t nh y c m d b nhi m c n c n th n vi c đóng m n p H th ng đóng phát hi n b ng Calcein-Mn r t đ n gi n, quan sát đ c b ng m t th ng cho k t qu có đ tin c y cao, t ng đ ng v i n di gel agarose ph ng pháp đo đ đ c mà tránh đ c nh c m d gây ô nhi m c a LAMP đ ng th i không c n k thu t cao, máy móc ph c t p, ch t nhu m đ c h i nh EtBr 37 Khóa lu n t t nghi p Nguy n Th Nga – Tr ng i h c Khoa h c t nhiên K53B-CNSH TẨI LI U THAM KH O Ti ng Vi t T Thanh Dung, Nguy n Ng c, Nguy n Quang Th nh, oàn Th Mai Thy, M Crumlish, H W Ferguson (2003), Xác đ nh vi khu n gây b nh đ m tr ng gan cá Tra (Pangasius hypophthalmus) nuôi thâm canh đ ng b ng sông C u Long, i h c C n Th Vi n Th y S n, i h c Stirling Lê Nguy n Nguyên H (2011), Phát hi n đo n gen eip18 c a ch ng vi khu n Edwardsiella ictaluri b ng ph ng pháp LAMP (Loop mediated isothermal amplification), Lu n v n th c s sinh h c Hi p h i ch bi n xu t kh u th y s n Vi t Nam (2012), Báo cáo xu t kh u th y s n Vi t Nam-2011, Hi p h i ch bi n xu t kh u th y s n Vi t Nam, Hà N i Th Hòa, Bùi Quang T , Nguy n H u D ng, Nguy n Th Mu i (2004), Giáo trình b nh h c th y s n, NXB Nông Nghi p, Hà N i V ng Ph ng H ng (2010), Phân l p xác đ nh m t s đ c m c a vi khu n gây b nh gan th n m cá tra Vi t Nam, Khóa lu n t t nghi p c nhân Sinh h c, i h c Khoa h c t nhiên, Hà N i Lý Th Thanh Loan (2007), B c đ u phát hi n Clostridium sp c m nhi m cá tra (Pangasius hypophthalmus) nuôi BSCL Vi t Nam, Trung tâm qu c gia quan tr c, c nh báo môi tr ng phòng ng a d ch b nh th y s n khu v c Nam b - Vi n nghiên c u NTTS II Mai Xuân Toàn (2011), Nghiên c u t o b sinh ph m phát hi n vi khu n Edwardsiella ictaluri gây b nh cá tra Vi t Nam b ng ph ng pháp PCR, Khóa lu n t t nghi p c nhân Sinh h c, i h c Khoa h c t nhiên, Hà N i Ti ng Anh Buchanan RE, Gibbons NE (1974), Bergey’s manual of determinative bacteriology, The Williams & Wilkins Co., Baltimore Endo S, Komori T, Ricci G, Sano A, Yokoyama K, Ohori A, Kamei K, Franco M, Miyaji M, Nishimura K (2004), “Detection of ga43 of Paracoccidiodes brasiliensis by the loop-mediated isothermal amplification (LAMP) method”, FEMS Microbiol Lett, 234, 93-97 10 Hawke JP, McWhorter AC, Steigerwalt AG, Brenner DJ (1981), “Edwardsiella ictaluri sp nov., the causative agent of enteric septicemia of catfish”, International J Systemc Bacteriol, 31, 396-400 38 Khóa lu n t t nghi p Nguy n Th Nga – Tr ng i h c Khoa h c t nhiên 11 K53B-CNSH Humphery S, Michael H (2006), Microbial proteomic: Functimal biology of whole organism, Hoboken, New Jersey, John Wiley and Sonc Inc 12 Innis MA, Myamb KB, Gelfan DH, Brow MAD (1988), “DNA sequencing with Thermus aquaticus DNA polymerase and direct sequencing of polymerase chain reaction-amplified DNA”, Proc Natl Acad Sci U S A, 85, 9436–9440 13 Iwamoto T, Sonobe T, Hayashi K (2003), “Loop-mediated isothermal amplification for direct detection of Mycobacterium tuberculosis complex, M avium and M intracellulare in sputum samples”, J Clin Microbiol, 41, 2616–2622 14 Kono T, Savan R, Sakai M, Itami T (2004), “Detection of white spot syndrome virus in shrimp by loop-mediated isothermal amplification”, J Virol Methods, 115, 59-65 15 Kuboki N, Inoue N, Sakurai T, Di Cello F, Grab DJ, Suzuki H, Sugimoto C, Igarashi I (2003), “Loop-mediated isothermal amplification for detection of African trypanosomes”, J Clin Microbio., 41, 5517–5524 16 17 Lucigen Corporation, Bst DNA polymerase- exonuclease minus Michelle MM, Denise LF, Ronald LT (2002), “Cloning and characterization of Edwardsiella ictaluri proteins expressed and recognized by the channel catfish Ictalurus punctatus immune response during infection”, Dis Aquat Ogan, 52(2), 93-107 18 Mori Y, Hirano T, Notomi T (2006), “Sequence specific visual detection of LAMP reactions by addition of cationic polymers”, BMC Biotechnology, 6(3) 10 pp 19 Niessen L, Zudi FV (2010), “Detection of Fusarium graminearum DNA using a loop-mediated isothermal amplification (LAMP) assay”, International Journal of Food Microbiology, 140, 183–91 20 Notomi T, Okayama H, Masubuchi H, Yonekawa T, Watanabe K, Amino N, Hase T (2000), “Loop-mediated isothermal amplification of DNA”, Nucleic acids Res, 15, E63 21 Panangala VS, Shoemaker CA, Van Santan VL, Kleisius PH (2005), “Analysis of 16S-23S intergenic spacer regions of the rRNA operons in Edwardsiella ictaluri and Edwardsiella tarda isolates from fish”, J Appl Microbiol, 99(3), 657-669 39 Khóa lu n t t nghi p Nguy n Th Nga – Tr ng i h c Khoa h c t nhiên 22 K53B-CNSH Parida MM (2008), Rapid and real-time detection technologies for emerging viruses ofbiomedical importance, Department of Virology, Defence R & D Establishment, Gwalior 474 002, India 23 Poon LLM, Leung CSW, Tashiro M, Chan KH, Wong BWY, Yuen KY, Guan Y, Peiris JSM (2004), “Rapid detection of the severe acute respiratory syndrome (SARS) coronavirus by a loop-mediated isothermal amplification assay”, Clin Chem, 50, 1050-1052 24 Qingli Zhang (2009), Detection of aquatic animal viruses by loop mediated isothermal amplification (LAMP), Yellow Sea Fisheries Research Institute 25 Saiki RK, Gelfand DH, Stoffel S, Scharf SJ, Higuchi R, Horn GT, Mullis KB, Erlich HA (1998), “Primer-directed enzymatic amplification of DNA with a thermostable DNA polymerase”, Science, 239, 487–491 26 Savan R, Igarashi A, Matsuoka S, Sakai M (2004), “Sensitive and rapid detetcion of Edwardsiellosis in fish by a loop-mediated isothermal amplification method”, Appl Environ Microbiol, 70(1), 621-624 27 Shotts EB, Waltman WD (1990), “A medium for the selective isolation of Edwardsiella ictaluri”, J Wildl Dis., 26, 214–218 28 Taft Y, Toribara, Larysa koval (2001), “Determination of Calcein in biological material”, The use of Calcein as an indicator in the edta titration, 7(3-4), 248-252 29 Tomita Norihiro, Mori Yasuyoshi, Kanda Hidetoshi, Notomi Tsugunori (2008), Loop-mediated isothermal amplification (LAMP) of gene sequences and simple visual detection of products, Eiken Chemical Co., Ltd., Biochemical Research Laboratory, 1381-3 Shimoishigami, Ohtawara, Tochigi 324-0036, Japan 30 Waltman WD, Shotts EB, Hsu TC (1986), “Biochemiacal characteristics of Edwardsiella ictaluri”, Applied and environmental microbiology, 51(1), 101-104 31 Yeh HY, Shoemarker CA, Klesius PH (2005), “Evaluation of a loopmediated isothermal amplification method for rapid detection of channel catfish Ictalurus punstatus important bacterial pathogen Edwardsiella ictaluri”, J Microbiol Method, 63, 36-44 Trang web http://www.fermentas.com/en/home 32 33 http://www.micro-gen.ouhsc.edu 34 http://sigmaaldrich.com 35 http://pangasius-vietnam.com 40 Khóa lu n t t nghi p ... Vi n nghiên c u NTTS II Mai Xuân Toàn (2011), Nghiên c u t o b sinh ph m phát hi n vi khu n Edwardsiella ictaluri gây b nh cá tra Vi t Nam b ng ph ng pháp PCR, Khóa lu n t t nghi p c nhân Sinh. .. trịn nh màu xanh 1.2.1.2 Xác đ nh ho t tính sinh hóa n hình Bên c nh ph ng pháp vi sinh, đ phát hi n xác vi khu n E ictaluri, ta ti n hành ph n ng sinh hóa đ c tr ng c a E ictaluri nh : ho t... tr ng c a E ictaluri nh : ho t tính catalase (+), ho t tính oxydase (-), kh n ng sinh Indole (-), sinh H2S (-), sinh axit mơi tr ng sucrose, monitol, arabinose E ictaluri có ho t tính protease