Cải Thiện Điều Kiện Nuôi Cấy Serratia Marcescens Sh1 Và Phương Pháp Thu Hồi Sắc Tố Prodigiosin

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHỆ TP HỒ CHÍ MINH ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP Đề tài “CẢI THIỆN ĐIỀU KIỆN NUÔI CẤY SERRATIA MARCESCENS SH1 VÀ PHƯƠNG PHÁP THU HỒI SẮC TỐ PRODIGIOSIN TỪ CANH TRƯỜNG” Ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Chuyên ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Giảng viên hướng dẫn : TS Nguyễn Hoài Hương Sinh viên thực MSSV: 1151100246 : Hồ Thị Bích Phương Lớp: 11DSH04 TP Hồ Chí Minh, 2015 Đồ án tốt nghiệp LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan cơng trình nghiên cứu tơi đƣợc thực phòng thí nghiệm khoa Cơng nghệ sinh học – Thực phẩm – Môi trƣờng, trƣờng đại học Công nghệ TP.Hồ Chí Minh Các số liệu kết trung thực, chƣa công bố Tôi xin chịu hồn tồn trách nhiệm lời cam đoan trƣớc q thầy nhà trƣờng Tp Hồ Chí Minh, tháng 8, năm 2015 Sinh viên thực Hồ Thị Bích Phƣơng Đồ án tốt nghiệp LỜI CẢM ƠN Tận đáy lòng xin gửi vạn lời cảm ơn đến cha mẹ, cha mẹ gian lao nuôi dạy thành ngƣời ngƣời thầy đầu đời Cha mẹ chỗ dựa vững con, ngƣời giúp đứng vững sau lần vấp ngã, nguồn động viên, động lực để tiếp tục phấn đấu sống Với lòng biết ơn sâu sắc Em xin chân thành cảm ơn tồn thể q Thầy Cơ Khoa Cơng nghệ sinh học – Mơi trƣờng – Thực phẩm, tồn thể Thầy Cơ Trƣờng Đại học Cơng nghệ TP Hồ Chí Minh nhiệt tình giảng dạy truyền đạt cho em kiến thức quý báu sở ngành nhƣ chuyên ngành từ ngày em bƣớc chân vào giảng đƣờng đại học Đặc biệt, em xin chân thành cảm ơn Nguyễn Hồi Hƣơng ngƣời ln tận tình dẫn tạo điều kiện thuận lợi cho em hoàn thành phần thực nghiệm đồ án Em xin chân thành cảm ơn thầy Huỳnh Văn Thành thầy Nguyễn Trung Dũng tạo điều kiện thuận lợi cho em thực đồ án phòng thí nghiệm Khoa Công nghệ sinh học - Môi trƣờng – Thực phẩm, Trƣờng Đại học Cơng nghệ TP Hồ Chí Minh Cảm ơn tất bạn lớp 11DSH04 bạn làm đồ án phòng thí nghiệm Khoa Cơng nghệ sinh học - Môi trƣờng – Thực phẩm ln khích lệ, động viên giúp đỡ suốt trình học tập trƣờng trình làm đồ án tốt nghiệp Xin chân thành cảm ơn! TP Hồ Chí Minh, tháng năm 2015 SVTH: Hồ Thị Bích Phƣơng Đồ án tốt nghiệp MỤC LỤC DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT v DANH MỤC HÌNH ẢNH vi MỤC LỤC BẢNG viii LỜI MỞ ĐẦU CHƢƠNG TỔNG QUAN TÀI LIỆU 12 1.1 Tổng quan hợp chất thứ cấp từ vi sinh vật 12 1.1.1 Hợp chất thứ cấp 12 1.1.2 Triển vọng tiềm sản xuất hợp chất thứ cấp từ vi sinh vật 12 1.2 Tổng quan prodigiosin 15 1.2.1 Khái niệm prodigiosin 15 1.2.2 Cấu trúc đặc điểm prodigiosin 16 1.2.3 Hoạt tính sinh học prodigiosin 18 1.3 Tổng quan Serratia marcescens 24 1.3.1 Phân loại Serratia marcescens 24 1.3.2 Đặc điểm Serratia marcescens 25 1.3.4 Một số hợp chất đƣợc tổng hợp Serratia marcescens 29 1.3.5 Tổng quan quorum sensing S marcescens 31 1.4 Cơ chế sinh tổng hợp prodigiosin 32 1.4.1 Cơ chế tổng hợp prodigiosin 32 1.4.2 Yếu tố ảnh hƣởng đến tổng hợp prodigiosin 34 i Đồ án tốt nghiệp 1.4.3 Điều kiện tổng hợp prodigiosin 38 1.4.4 Thu nhận, tinh định lƣợng prodigiosin 39 1.5 Tiềm sản xuất prodigiosin Serratia marcescens 42 CHƢƠNG VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU45 2.1 Thời gian địa điểm 45 2.1.1 Thời gian 45 2.1.2 Địa điểm 45 2.2 Vật liệu 45 2.2.1 Nguồn vi sinh vật 45 2.2.2 Mơi trƣờng ni cấy hóa chất sử dụng 45 2.3 Phƣơng pháp nghiên cứu 46 2.4 Bố trí thí nghiệm 47 2.5.1 Khảo sát chủng nuôi cấy 49 2.5.1 Kiểm tra độ khiết 49 2.5.2 Kháng sinh đồ 49 2.6 Xác định điều kiện lên men 49 2.7.1 Khảo sát vận tốc lắc nuôi cấy 52 2.7.2 Xác định pH tối ƣu cho môi trƣờng lên men 53 2.7.3 Khảo sát ảnh hƣởng nồng độ muối NaCl 53 2.7.4 Khảo sát ảnh hƣởng phƣơng pháp đồng nuôi cấy 54 2.7.5 Khảo sát ảnh hƣởng sản phẩm Quorum sensing 55 2.8 Thu hồi sản phẩm thô 56 ii Đồ án tốt nghiệp 2.8.1 Xác định tỷ lệ trích ly dung mơi đồng thời khảo sát thể tích lên men 56 2.8.2 Cải thiện q trình trích ly nhờ gia tăng nhiệt độ 56 2.9 Các phƣơng pháp phân tích 56 2.9.1 Xác định protein có mẫu 57 2.9.2 Xác định lipid có mẫu 57 2.10 Sắc ký mỏng TLC 57 2.11 Phƣơng pháp phân tích 59 2.11.1 Phƣơng pháp định lƣợng hợp chất prodigiosin 59 2.11.2 Phƣơng pháp xử lý số liệu thống kê 59 Chƣơng KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 60 3.1 Kết kiểm tra độ khiết 60 3.2 Xác định điều kiện lên men thu prodigiosin 65 3.2.1 Ảnh hƣởng thể tích lên men lên hàm lƣợng prodigiosin tổng hợp 65 3.2.2 Xác định vận tốc lắc 67 3.2.3 Kết xác định pH tối ƣu cho môi trƣờng MT3 69 3.2.4 Ảnh hƣởng nồng độ muối lên hàm lƣợng prodigiosin tổng hợp 71 3.2.5 Kết thí nghiệm đồng ni cấy 73 3.2.6 Sử dụng dịch nuôi cấy 76 3.3 Thu hồi sản phẩm lên men từ canh trƣờng 77 3.3.1 Ảnh hƣởng tỷ lệ canh trƣờng: dung mơi trích ly lên hàm lƣợng prodigiosin thu hồi 77 3.3.2 Cải thiện trình trích ly nhờ gia nhiệt canh trƣờng 78 iii Đồ án tốt nghiệp 3.4 Xác định thành phần hóa học mẫu 84 3.4.1 Phản ứng Biuret’s test 84 3.4.2 Xác định lipid có mẫu 86 3.5 Sắc ký mỏng TLC 88 Chƣơng KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 91 4.1 Kết luận 91 4.2 Kiến nghị 92 TÀI LIỆU THAM KHẢO 93 PHỤ LỤC iv Đồ án tốt nghiệp DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT EPN: Entomopathogenic nematodes OD: mật độ quang (Optical Density) λmax : bƣớc sóng hấp thụ cực đại TLC: Thin Layer Chromatogarphy v Đồ án tốt nghiệp DANH MỤC HÌNH ẢNH Hình 1.1 Các chất đại diện prodigiosin (Furstner, 2003) 19 Hình 1.2 Cấu trúc hóa học prodigiosin (Krishna,2008) 20 Hình 1.3 Cơ chế kháng tế bào ung thƣ prodigiosin (Chia-Che cộng sự,2011) 23 Hình 1.4 Serratia marcescens dƣới kính hiển vi (Gillen and Gibbs, 2011) 29 Hình 1.5 Khuẩn lạc Serratia marcescens môi trƣờng nutrient agar 250C sau 48 (David, 2012) 28 Hình 1.6 So sánh cụm sinh tổng hợp prodigiosin (cụm pig) tử Serratia ATCC 39.600, Sma 274 cụm sunh tổng hợp undecylprodigiosin (cụm màu đỏ) tử Streptomyces coelicolor A3(2) (Cerdeno cộng sự, 2001) 35 Hình 1.7 Một số yếu tố ảnh hƣởng đến trình sinh tổng hợp prodigiosin Serratia marcescens (Sundaramoorthy cộng sự, 2009) 37 Hình 2.1 Sơ đồ bố trí thí nghiệm 51 Hình 2.2 Sơ đồ trích ly 54 Hình 2.3 Cách chuẩn bị giấy chạy sắc ký 61 Hình 3.1 Khuẩn lạc chủng SH1 nuôi cấy môi trƣờng NA 63 Hình 3.2 Hình thái khuẩn lạc soi thằng soi nghiêng dƣới kính hiển vi vật kính 10X 64 Hình 3.3 Kết nhuộm Gram chủng SH1 65 Hình 3.4 Kết kháng kháng sinh chủng SH1 65 vi Đồ án tốt nghiệp Hình 3.5 Ảnh hƣởng thể tích lên men lên hàm lƣợng prodigiosin tổng hợp 69 Hình 3.6 Hàm lƣợng prodigiosin thay đổi vận tốc lắc 71 Hình 3.7 Ảnh hƣởng pH lên tổng hợp prodigiosin S marcescens SH1 73 Hình 3.8 Kết hàm lƣợng prodigiosin bổ sung NaCl 75 Hình 3.9 Đồng nuôi cấy Serratia marcescens SH1 Bacillus sp 77 Hình 3.10 Kết đồng nuôi cấy E coli 78 Hình 3.11 Hàm lƣợng prodigiosin thu hồi sau trích ly nhờ tỷ lệ canh trƣờng: dung môi khác 81 Hình 3.12 Canh trƣờng sau ly tâm 82 Hình 3.13 Sắc tố đỏ sau trích ly với dung mơi Etanol:HCl (95:5) 83 Hình 3.14 Vi khuẩn S marcescens đƣợc cấy môi trƣờng NA 84 Hình 3.15 Hàm lƣợng prodigiosin so với đối chứng 85 Hình 3.16 Kết quét quang phổ sắc tố canh trƣờng khơng đun đun 1000C 86 Hình 3.17 Biuret’s test dịch sau ly tâm dịch trích ly prodigiosin thơ 87 Hình 3.18 Ninhydrin test dịch sau ly tâm dịch trích ly prodigiosin thơ thí nghiệm đun khơng đun canh trƣờng 88 Hình 3.19 Kết mẫu phản ứng Coomassie brilliant blue trƣớc sau phun thuốc thử 90 Hình 3.20 Kết sắc ký mỏng sử dụng hệ dung môi Petrolium ether: Ether : Acetic acid (70 : 40 : 2, v : v :v) 92 Hình 3.21 Sơ đồ quy trình S marcescens SH1 tổng hợp prodigiosin 93 vii Đồ án tốt nghiệp PHỤ LỤC ĐƢỜNG CHUẨN SẮC TỐ Đƣờng chuẩn Sắc tố 0.4 y = 1.100x + 0.004 R² = 0.999 0.35 0.3 O D 53 0.25 0.2 0.15 0.1 0.05 0 0.05 0.1 0.15 0.2 0.25 0.3 0.35 Nồng độ sắc tố (mg/ml) PHỤ LỤC SỐ LIỆU THỐNG KÊ Ảnh hƣởng pH đến hàm lƣợng sắc tố ANOVA Table for Prodigiosin by pH Source Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio P-Value Between groups 2.4576 2.4576 Within groups 0.193979 0.0484949 50.68 0.0021 Đồ án tốt nghiệp Total (Corr.) 2.65158 Summary Statistics for Prodigiosin pH Count Average Standard Coeff of Minimum Maximum Range deviation variation 7.2 3.3012 0.19277 5.83939% 3.1055 3.4909 0.3854 không 2.0212 0.244601 12.1017% 1.7763 2.2655 0.4892 2.6612 0.728228 27.3646% 1.7763 3.4909 1.7146 chỉnh Total Multiple Range Tests for Prodigiosin by pH Method: 95.0 percent LSD pH Count Mean Homogeneous Groups không chỉnh 2.0212 X 7.2 3.3012 X Khảo sát ảnh hƣờng nồng độ muối NaCl Summary Statistics for Prodigiosin % NaCl Count Averag Standard Coeff e of Minimum Maximum Range Stnd deviation variation skewness Đồ án tốt nghiệp 0% 12.103 0.750165 6.19816% 11.3091 12.8 1.4909 -0.4044 1% 18.460 2.53651 13.7402% 15.5454 20.1636 4.6182 -1.1733 2% 12.987 4.71475 36.3012% 8.0727 17.4727 9.4 3% 7.7454 3.82559 49.3915% 4.6909 12.0363 7.3454 0.9209 12.824 4.88085 38.0596% 4.6909 20.1636 15.472 -0.0849 Total 12 ANOVA Table for Prodigiosin by % NaCl Source Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio P-Value 0.0264 Between groups 174.328 58.1094 Within groups 87.7213 10.9652 Total (Corr.) 262.049 11 Multiple Range Tests for Prodigiosin by % NaCl Method: 95.0 percent LSD % NaCl Count Mean Homogeneous Groups 3 7.74543 X 12.103 X 5.30 -0.2880 Đồ án tốt nghiệp 12.9879 XX 18.4606 X Đồng nuôi cấy S marcescens Bacillus subtilis tỷ lệ S/B 2:1 ANOVA Table for Prodigiosin by đồng nuôi cấy Source Sum of Df Mean Square F-Ratio P-Value 0.8848 Squares Between groups 0.101873 0.101873 Within groups 17.096 4.27399 Total (Corr.) 17.1979 0.02 Summary Statistics for Prodigiosin dong nuoi Count Average Standard Coeff cay S/B 2:1 of Minimu Maxim Range Stnd deviation variation m um skewness 7.53333 1.71541 22.7709% 5.9091 9.3273 3.4182 0.31176 Đối chứng 7.79403 2.36773 30.3787% 5.9818 10.473 4.4912 1.00872 Total 7.66368 1.8547 10.473 4.5639 0.76131 24.2011% 5.9091 Đồng nuôi cấy S marcescens Bacillus subtilis tỷ lệ S/B 1:1, S/B 1:2 Summary Statistics for Prodigiosin Đồ án tốt nghiệp NT Count Average Standard deviation Coeff of Minimum Maximum Rang Stnd variation e skewness 1:1 16.8545 7.40232 43.9189% 9.05455 23.7818 14.72 -0.36993 1:2 17.4273 9.00178 51.6534% 7.03636 22.8545 15.81 -1.22109 ĐC 26.0818 13.2061 50.6335% 11.6727 37.6091 25.93 -0.6613 Total 20.1212 9.87946 49.0997% 7.03636 37.6091 30.57 0.38955 ANOVA Table for prodigiosin by nghiệm thức Source Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio P-Value Between groups 160.372 80.1859 0.78 0.5017 Within groups 620.458 103.41 Total (Corr.) 780.829 Multiple Range Tests for prodigiosin by nghiệm thức Method: 95.0 percent LSD NT Count Mean Homogeneous Groups 1:1 16.8545 X Đồ án tốt nghiệp 1:2 17.4273 X DC 26.0818 X Sử dụng dịch trong nuôi cấy ANOVA Table for prodigiosin by nghiệm thức Source Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio P-Value 0.01 Between groups 2.49983 1.24992 Within groups 579.421 96.5702 Total (Corr.) 581.921 0.9872 Table of Means for PRO by NT with 95.0 percent LSD intervals NT Count Mean Stnd error (pooled s) Lower limit Upper limit DC 26.0818 5.67363 16.2651 35.8985 E coli 26.7182 5.67363 16.9015 36.5349 S 27.3727 5.67363 17.556 37.1894 26.7242 marcescens Total Multiple Range Tests for Prodigiosin by nghiệm thức Đồ án tốt nghiệp NT Count Mean Homogeneous Groups DC 26.0818 X Dịch 26.7182 X 27.3727 X nuôi cấy E coli Dịch S marces cens Xác định vận tốc lắc So sánh kết thí nghiệm với ANOVA Table for Prodigiosin by TN Source Sum of Df Mean Squares P-Value 8.89 0.0161 Square Between groups 48.365 24.1825 Within groups 2.72145 16.3287 F-Ratio 10 Đồ án tốt nghiệp Total (Corr.) 64.6937 Multiple Range Tests for Prodigiosin by TN Method: 95.0 percent LSD TN Count Mean Homogeneous Groups TNC 5.185 X TNB 8.8848 X TNA 10.7653 X Summary Statistics for Prodigiosin TN Count Average Standard deviation Coeff of Minimum Maximum Range variation TNA 10.7653 2.08945 19.409% 8.376 12.25 3.874 TNB 8.8848 1.42031 15.9859% 7.2545 9.8545 2.6 TNC 5.185 1.33464 25.7405% 3.736 6.364 2.628 Total 8.27838 2.84372 34.3511% 3.736 12.25 8.514 Thí nghiệm xử lý nhiệt canh trƣờng Summary Statistics for Prodigiosin 11 Đồ án tốt nghiệp NT Count Average Standard Coeff of Minimum Maximum Range deviation variation 10.168 4.34639 42.7458% 6.291 14.8 8.509 DUN 26.15 5.89949 22.5602% 18.655 33.054 14.399 Total 18.159 9.79748 53.9538% 6.291 33.054 26.763 DC ANOVA Table for Prodigiosin by NT Source Sum of Df Mean Squares F-Ratio P-Value 19.03 0.0048 Square Between groups 510.849 510.849 Within groups 161.085 26.8475 Total (Corr.) 671.934 Multiple Range Tests for Prodigiosin by NT Method: 95.0 percent LSD NT Count Mean Homogeneous Groups DC 10.16 X 12 Đồ án tốt nghiệp DUN 26.15 X PHỤ LỤC BẢNG Bảng Tiêu chuẩn biện luận kháng sinh đồ theo Enterobacteriaceae Tiêu chuẩn biện luận kháng sinh đồ theo Enterobacteriaceae Kháng sinh Ký S I R Hàm lƣợng Đĩa hiệu Ampicillin Am ≥ 17 14 – 16 ≤ 13 10μg Gentamicin Ge ≥ 15 13 – 14 ≤ 12 10 μg Cefuroxime Cu ≥ 18 15 – 17 ≤ 14 30 μg Cefoxitin Cn ≥ 18 15 – 17 ≤ 14 30 μg Cefotaxime Ct ≥ 26 23 – 25 ≤ 22 30 μg Amoxicillin-clavulanic Ac ≥ 18 14 – 17 ≤ 13 20 μg /10 μg Amikacin Ak ≥ 17 15 – 16 ≤ 14 30 μg Piperacillin/tazobactam Pt ≥ 21 18 – 20 ≤ 17 100 μg /10 μg Ciprofloxacin Ci ≥ 21 16 – 20 ≤ 15 μg Ertapenem En ≥ 22 19 – 21 ≤ 18 10 μg Ceftazidime Cz ≥ 21 18 – 20 ≤ 17 30 μg Chloramphenicol Cl ≥ 18 13 – 17 ≤ 12 30 μg Imipenem Im ≥ 23 20 – 22 ≤ 19 10 μg Trimethoprim / Bt ≥ 16 11 – 15 ≤ 10 1.25 μg acid /23.75 μg sulfamethoxazole Cefepime Cm ≥ 18 15 – 17 ≤ 14 30 μg Tetracycline Te ≥ 15 12 – 14 ≤ 11 30 μg 13 Đồ án tốt nghiệp Bảng Đánh giá nồng độ oxy hòa tan Nồng độ O2 Đánh giá mg/l Nguy hiểm, oxy nƣớc không đủ cho cá, tôm mg/l Nƣớc đủ oxy cung cấp ch0 cá, tôm -8 mg/l Tốt, nƣớc có nhiều oxy Bảng Hàm lƣợng prodigiosin thu hồi trích ly tỷ lệ canh trƣờng:dung môi (mg/ ml canh trƣờng) quy mơ lên men khác A (thể tích lên B (thể tích lên C (thể tích Tỷ lệ canh trƣờng: men 20 ml/ men 200 ml/ lên men 400 dung mơi bình) bình) ml/ bình) Tỷ lệ 2:3 8,4 7,3 3,7 Tỷ lệ 1:2 12,3 9,9 6,4 Tỷ lệ 2:5 11,7 9,5 5,5 14 Đồ án tốt nghiệp Bảng Kết hàm lƣợng prodigiosin đồng nuôi cấy S marcescens SH1 với Bacillus sp Nghiệm thức Đối chứng S/B = 2:1 Đối chứng S/B = 1:1 26,1 ± 13,2 (a) 16,9 ± 7,4 17,4 ± 9,0 S/B = 1:2 Hàm lƣợng 7,8 ± 2,4(a) 7,5 ± 1,7 (a) prodigiosin tổng (a) (a) hợp (mg/ml canh trƣờng) % prodigiosin 100 ± 96,7 ± 22 % tổng hợp so với 30,4% 100 ± 50,6 % 64,6 28,4 % đối chứng (%) PHỤ LỤC HÌNH ẢNH Thí nghiệm đo oxy hòa tan DO 15 ± 66,8 34,5% ± Đồ án tốt nghiệp Hình Chai DO chứa canh trƣờng MT3 thí nghiệm đo oxy hòa tan Hình Mẫu đo oxy hòa tan lên men 24h lắc 200 vòng/phút Mơi trƣờng PG; 2.Mơi trƣờng MT3 Canh trƣờng MT3 (6 mg/l) Mơi trƣờng PG (4 mg/l) Hình Đo oxy hòa tan sử dụng kit đo oxy hòa tan bán sẵn thị trƣờng Thí nghiệm đồng ni cấy S marcescens Bacillus subtilis 16 Đồ án tốt nghiệp A Đối chứng; B Nghiệm thức S/B = 2:1 A.Đối chứng; B S/B = 1:1; C S/B = 1:2 Hình Thí nghiệm lên men đồng ni cấy S marcescens SH1 với Bacillus sp Thí nghiệm ni cấy có bổ sung dịch S marcescens SH1 E coli Hình Sử dụng dịch trong ni cấy 17 Đồ án tốt nghiệp A Đối chứng; B Dịch S marcescens; C Dịch loại bỏ tế bào E coli Hình Canh trƣờng đun 1000C 18 ... yếu tố cần cải thiện Dựa sở đề tài “CẢI THIỆN ĐIỀU KIỆN NUÔI CẤY Serratia mercescens SH1 VÀ PHƢƠNG PHÁP THU HỒI SẮC TỐ PRODIGIOSIN TỪ CANH TRƢỜNG” đƣợc tiến hành nhằm tăng nồng độ prodigiosin. .. hợp 10 Đồ án tốt nghiệp Mục tiêu đề tài Cải tiến điều kiện lên men Serratia marcescens tổng hợp prodigiosin, nhƣ phƣơng pháp thu hồi sắc tố thô Nội dung đề tài Khảo sát chủng Serratia marcescens. .. đồ Cải tiến điều kiện nuôi cấy Serratia marcescens tổng hợp prodigiosin: tăng thể tích lên men, ảnh hƣởng vận tốc lắc, pH nuôi cấy, nồng độ muối % NaCl, thử áp dụng phƣơng pháp đồng nuôi cấy