Xác định một số điều kiện nuôi cấy tối ưu nấm trichoderma harzianum để thu nhận enzyme chitinase

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHỆ TP HCM ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP XÁC ĐỊNH MỘT SỐ ĐIỀU KIỆN NUÔI CẤY TỐI ƯU NẤM Trichoderma harzianum ĐỂ THU NHẬN ENZYME CHITINASE Ngành: Công nghệ sinh học Chuyên ngành: Công nghệ sinh học Giảng viên hướng dẫn: TS Nguyễn Thị Hai Sinh viên thực hiện: Trần Đức Vinh MSSV: 1051110243 Lớp: 10DSH02 TP Hồ Chí Minh, 7/2014 Đồ án tốt nghiệp LỜI CẢM ƠN Lời xin gửi lời cảm ơn chân thành đến Quý thầy cô khoa Công nghệ Sinh học – Thực phẩm – Môi trường, trường Đại Học Công nghệ Thành phố Hồ Chí Minh giảng dạy kiến thức truyền đạt kinh nghiệm quý báu cho suốt năm đại học Tơi xin bày tỏ lòng cám ơn chân thành cô Nguyễn Thị Hai, người nhiệt tình, tận tụy dẫn dắt, động viên, tạo điều kiện tốt giúp đỡ kiến thức chuyên ngành để tơi hồn thành tốt đồ án tốt nghiệp Tôi xin gửi lời cám ơn đến thầy Thành, người nhiệt tình hỗ trợ thiết bị, vật tư giúp đỡ tơi hồn thành tốt đồ án tốt nghiệp Tơi cám ơn bạn phòng thí nghiệm đặc biệt người bạn nhóm ESS động viên, giúp đỡ tơi Và cuối cùng, hết, xin cám ơn ba mẹ, người hết lòng lo lắng, vất vả để tạo điều kiện cho học đến thực ước mơ Con xin cám ơn ba mẹ nhiều Đồ án tốt nghiệp LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan công trình nghiên cứu tơi Các nội dung nghiên cứu kết đề tài trung thực chưa cơng bố cơng trình trước Tơi xin hồn tồn chịu trách nhiệm trước nhà trường lời cam đoan Tp Hồ Chí Minh, ngày 26 tháng năm 2014 Sinh viên thực Trần Đức Vinh Đồ án tốt nghiệp MỤC LỤC DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT DANH MỤC BẢNG DANH MỤC HÌNH CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN .4 1.1 Giới thiệu Trichoderma .4 1.1.1 Phân loại 1.1.2 Lịch sử phát triển 1.1.3 Đặc điểm chung Trichoderma 1.1.3.1 Đặc điểm hình thái .6 1.1.3.2 Đặc điểm sinh trưởng 1.1.3.3 Các sản phẩm trao đổi chất Trichoderma 1.1.4 Vai trò sinh thái .10 1.1.5 Tính ứng dụng Trichoderma giới Việt Nam 10 1.1.6 Ứng dụng Trichoderma nông nghiệp .12 1.1.6.1 Bảo vệ thực vật .12 1.1.6.2 Cải thiện suất trồng 12 1.1.6.3 Trong xử lí mơi trường 13 1.1.6.4 Trong công nghiệp thực phẩm 13 1.1.6.5 Bổ sung thức ăn cho chăn nuôi 14 1.2 Cơ chế kiểm soát sinh học Trichoderma spp 14 1.2.1 Cạnh tranh 14 1.2.2 Kí sinh .15 1.2.3 Bất hoạt enzyme nấm bệnh .16 1.2.4 Tăng khả kháng thực vật 16 1.3 Những nghiên cứu enzyme chitinase 17 1.3.1 Giới thiệu chitin 17 1.3.1.1 Cấu trúc tính chất chitin 17 i Đồ án tốt nghiệp 1.3.1.2 Lịch sử phát chitin .18 1.3.1.3 Sự phân bố chitin tự nhiên 19 1.3.1.4 Điều chế chitin 20 1.3.2 Giới thiệu enzyme chitinase .20 1.3.2.1 Đặc điểm phân bố 20 1.3.2.2 Cơ chế hoạt động chitinase .22 1.3.2.3 Các nguồn thu nhận chitinase 23 1.3.2.4 Lịch sử nghiên cứu chitinase 25 1.3.2.5 Ứng dụng enzyme chitinase .26 1.3.2.6 Các yếu tố ảnh hưởng đến enzyme chitinase sinh tổng hợp enzyme chitinase từ vi sinh vật .28 1.3.2.7 Những nghiên cứu tối ưu hóa điều kiện thu nhận enzyme chitinase từ Trichoderma harzianum Việt Nam giới .30 1.4 Sơ lược bệnh thán thư ớt tác nhân gây bệnh Collectotrichum sp .32 1.4.1 Bệnh thán thư ớt .32 1.4.1.1 Triệu chứng .32 1.4.1.2 Nguyên nhân gây bệnh 33 CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 34 2.1 Thời gian địa điểm 34 2.1.1 Thời gian 34 2.1.2 Địa điểm 34 2.2 Thiết bị- dụng cụ- vật liệu .34 2.2.1 Thiết bị dụng cụ 34 2.2.1.1 Thiết bị 34 2.2.1.2 Dụng cụ .34 2.2.2 Giống vi sinh vật sử dụng nghiên cứu 35 2.2.3 Môi trường sử dụng để nghiên cứu 35 2.2.3.1 Môi trường PDA .35 2.2.3.2 Mơi trường định tính sinh tổng hợp chitinase 36 ii Đồ án tốt nghiệp 2.2.3.3 Môi trường sử dụng để nuôi cấy sinh tổng hợp enzyme chitinase 36 2.3 Phương pháp thí nghiệm 38 2.3.1 Phương pháp nghiên cứu khả sinh tổng hợp enyme chitinase Trichoderma 38 2.3.1.1 Phương pháp nuôi cấy Trichoderma môi trường thạch PDA 38 2.3.1.2 Phương pháp nghiên cứu khả sinh tổng hợp chitinase Trichoderma môi trường thạch .38 2.3.2 Phương pháp xác định số lượng bào tử buồng đếm hồng cầu .40 2.3.3 Phương pháp nuôi cấy Trichoderma để sản xuất chitinase 41 2.3.4 Phương pháp thu nhận dịch môi trường chứa chitinase 42 2.3.5 Xác định hoạt tính enzyme chitinase phương pháp DNS 42 2.3.6 Phương pháp tủa enzyme cồn 45 2.3.7 Khảo sát ảnh hưởng môi trường nuôi cấy đến sinh tổng hợp chitinase Trichoderma harzianum .46 2.3.8 Khảo sát ảnh hưởng nguồn chất chitin đến sinh tổng hợp chitinase Trichoderma harzianum .46 2.3.9 Khảo sát ảnh hưởng thời gian nuôi cấy đến sinh tổng hợp chitinase Trichoderma harzianum .48 2.3.10 Khảo sát ảnh hưởng pH môi trường ban đầu đến sinh tổng hợp chitinase Trichoderma harzianum 49 2.3.11 Khảo sát ảnh hưởng nguồn đường hàm lượng đến sinh tổng hợp chitinase Trichoderma harzianum 51 2.3.12 Phương pháp thử nghiệm khả ức chế nấm bệnh Collectotrichum sp .52 2.3.13 Phương pháp xử lí số liệu 53 CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN 53 3.1 Kết khả phân giải chitin Trichoderma harzianum mơi trường thạch có chất cảm ứng chitin 1% 53 3.2 Ảnh hưởng thành phần môi trường nuôi cấy đến khả sinh tổng hợp chitinase Trichoderma harzianum 55 3.3 Ảnh hưởng nguồn chất chitin đến sinh tổng hợp chitinase Trichoderma harzianum 60 Đồ án tốt nghiệp 3.4 Ảnh hưởng thời gian nuôi cấy đến khả sinh tổng hợp chitinase Trichoderma harzianum 62 3.5 Ảnh hưởng pH môi trường ban đầu đến khả sinh tổng hợp chitinase Trichoderma harzianum 65 3.6 Ảnh hưởng nguồn đường bổ sung đến sinh tổng hợp chitinase Trichoderma harzianum 67 3.7 Hiệu khống chế nấm gây bệnh thán thư ớt chitinase thu từ Trichoderma harzianum 68 CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 72 4.1 Kết luận 72 4.2 Kiến nghị 72 TÀI LIỆU THAM KHẢO .73 Đồ án tốt nghiệp DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT DNS Dinitrosalicylic acid GlacNac N-acetyl glucosamine kDa Kilo Dalton MT Môi trường NSC Ngày sau cấy PDA Potato D-glucose agar Đồ án tốt nghiệp DANH MỤC BẢNG STT BẢNG NỘI DUNG khả 3.1 phân giải chitin TRANG Trichoderma harzianum mơi trường định tính sinh tổng hợp 56 chitinase Hoạt tính enzyme chitinase ảnh môi 3.2 3.3 3.4 3.5 3.6 3.7 Đường kính vòng melanin qua ngày ni cấy mẫu thí nghiệm 70 3.8 Tỉ lệ phần trăm tản nấm bị phân giải qua ngày 80 trường ni cấy Hoạt tính enzyme chitinase ảnh hưởng nguồn chất cảm ứng Hoạt tính enzyme chitinase ảnh hưởng ngày ni cấy Hoạt tính enzyme chitinase ảnh hưởng pH mơi trường ni cấy Hoạt tính enzyme chitinase ảnh hưởng nguồn dường tỷ lệ đường bổ sung 58 63 65 71 74 Đồ án tốt nghiệp DANH MỤC HÌNH STT HÌNH NỘI DUNG 1.1 1.2 1.3 1.4 1.5 Cấu trúc phân tử chitin 20 1.6 Cơ chế hoạt động hệ enzyme chitinase 26 1.7 2.1 Khuẩn lạc Trichoderma harzianum nuôi cấy môi trường thạch dịch chiết khoai tây (PDA) Sợi nấm cuống bào tử Trichoderma harzianum Bào tử Trichoderma harzianum quan sát kính hiển vi quang học x100 Một số sản phẩm thương mại ứng dụng Trichoderma spp Việt Nam giới Quả ớt bình thường ớt bị bệnh thán thư Collectotrichum spp Buồng đếm hồng cầu Neubauer TRANG 10 11 14 35 43 Vòng phân giải chitin T harzianum môi 3.1 trường dinh dưỡng chứa chitin 1% sau ngày nuôi 54 cấy 10 3.2 11 3.3 Biểu đồ cột thể thay đổi hoạt tính chitinase theo mơi trường ni cấy Môi trường A, B trước ủ sau ủ ngàyvới bào tử Trichoderma harzianum vii 55 58 PHỤ LỤC J: HOAT TINH BY MOI TRUONG Summary Statistics for HOAT TINH Moi Coun Average truong t Standard deviation Coeff of Minimum Maximum Rang Stnd variation e skewness A 0.082333 0.0110604 13.4337% 0.072 0.094 0.022 0.378013 B 0.175 0.0580775 33.1872% 0.108 0.211 0.103 -1.21454 C 0.273 0.0755447 27.672% 0.196 0.347 0.151 -0.126162 D 0.573 0.116258 20.2894% 0.479 0.703 0.224 0.890838 Total 12 0.275833 0.202981 73.5882% 0.072 0.703 0.631 1.41639 ANOVA Table for HOAT TINH by Moi truong Source Sum Squares of Df Mean Square Between groups 0.407777 0.135926 Within 0.0454367 0.0056795 groups Total (Corr.) 0.453214 11 F-Ratio P-Value 23.93 0.0002 Multiple Range Tests for HOAT TINH by Moi truong Method: 95.0 percent LSD Moi truong Count Mean Homogeneous Groups A 0.0823333 X B 0.175 XX C 0.273 X D 0.573 X PHỤ LỤC K: HOẠT TÍNH BY CƠ CHẤT Summary Statistics for HOAT TINH CO Count Average Standard CHAT deviation CT 0.156 0.0183303 DC 0.0813333 0.0080829 FU 0.0873333 0.0161967 LC 0.0986667 0.0112398 VT 0.0993333 0.0057735 Total 15 0.104533 0.0296163 Coeff of variation 11.7502% 9.938% 18.5458% 11.3917% 5.81225% 28.3319% ANOVA Table for HOAT TINH by CO CHAT Source Sum of Df Mean F-Ratio Squares Square Between 0.0106331 0.0026582 16.14 groups Within 0.00164667 10 0.0001646 groups 67 Total (Corr.) 0.0122797 14 Minim um 0.14 0.072 0.077 0.089 0.096 0.072 Maxim um 0.176 0.086 0.106 0.111 0.106 0.176 P-Value 0.0002 Rang e 0.036 0.014 0.029 0.022 0.01 0.104 Stnd skewness 0.6613 -1.22474 1.20377 0.712437 1.22474 2.1398 Multiple Range Tests for HOAT TINH by CO CHAT Method: 95.0 percent LSD CO Count Mean CHAT DC 0.08133 33 FU 0.08733 33 LC 0.09866 67 VT 0.09933 33 CT 0.156 Homogeneous Groups X X X X X PHỤ LỤC L: HOAT TÍNH BY NGAY NUOI CAY Summary Statistics for Hoat tinh Ngay Count Average Standard nuoi deviation cay 0.091 0.0111355 0.554333 0.0821969 3 1.46067 0.042548 Coeff of Minimum Maximum Rang Stnd variation e skewness 1.445 0.0168226 1.16419% 1.426 1.458 3 0.993667 0.0820386 8.25615% 0.939 0.428 0.10018 23.4065% 0.354 0.209667 0.0076376 3.64275% 0.203 0.740333 0.538359 72.7184% 0.081 1.088 0.542 0.218 0.022 0.553065 0.163 0.466695 0.085 0.173975 0.032 0.990526 0.149 1.17884 0.188 1.06796 0.015 0.6613 1.502 1.421 0.552287 Total 21 12.2368% 0.081 14.8281% 0.479 2.91292% 1.417 0.103 0.642 1.502 ANOVA Table for Hoat tinh by Ngay nuoi cay Source Sum of Df Mean F-Ratio Squares Square Between 5.74501 0.957501 259.80 groups Within 0.0515967 14 0.0036854 groups Total (Corr.) 5.7966 20 Multiple Range Tests for Hoat tinh by Ngay nuoi cay Method: 95.0 percent LSD Ngay nuoi Count Mean Homogeneous cay Groups 0.091 X 0.209667 X 0.428 X 0.554333 X 0.993667 X 1.445 X 3 1.46067 X P-Value 0.0000 PHỤ LỤC M: HOAT TINH BY pH Summary Statistics for HOAT TINH pH Cou Avera Standard Coeff of nt ge deviation variation 1.536 0.307027 19.98% 67 2.056 0.474601 23.0762% 67 1.398 0.0880587 6.2959% 67 1.000 0.0372066 3.71818% 67 Tot 12 1.498 0.464145 30.9808% al 17 Minimu Maxim Range Stnd m um skewness 1.252 1.862 0.61 0.41407 1.691 2.593 0.902 0.996276 1.301 1.472 0.171 -0.812139 0.96 1.033 0.073 -0.676931 0.96 2.593 1.633 1.58829 ANOVA Table for HOAT TINH by pH Source Sum of Df Mean F-Ratio Squares Square Between 1.71243 0.570811 6.95 groups Within 0.657301 0.0821626 groups Total (Corr.) 2.36973 11 Multiple Range Tests for HOAT TINH by pH Method: 95.0 percent LSD pH Count Mean Homogeneous Groups 1.0006 X 7 1.3986 XX 1.5366 XX 2.0566 X P-Value 0.0128 Stnd kurtosis 1.16096 PHỤ LỤC N: HOAT TINH BY NGUON DUONG VA TY LE BO SUNG Summary Statistics for hoat tinh Nguon Count Average duong va ty le bo sung Standard deviation Coeff of Minimum Maximum Range variation G0.1 0.2945 0.0819451 27.8252% G0.2 0.802667 0.169766 G0.3 S0.1 0.225 0.413 0.188 0.659 0.99 0.331 0.447667 0.0386954 8.6438% 0.403 0.471 0.068 0.2445 0.0417193 17.0631% 0.215 0.274 0.059 S0.2 0.235 0.0866949 36.8914% 0.181 0.335 0.154 S0.3 0.219333 0.0440151 20.0677% 0.176 0.264 0.088 Total 18 0.376722 0.224577 0.176 0.99 0.814 21.1502% 59.6133% Analysis of Variance for HOAT TINH - Type III Sums of Squares Source Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio P-Value A:nguon duong 0.2815 0.2815 10.24 B:ty le bo sung 0.191056 0.0955282 3.48 RESIDUAL 0.384833 14 0.0274881 MAIN EFFECTS TOTAL (CORRECTED) 0.85739 17 All F-ratios are based on the residual mean square error 0.0064 0.0595 Multiple Range Tests for HOAT TINH by ty le bo sung Method: 95.0 percent LSD ty le bo sung Count LS Mean LS Sigma Homogeneous Groups 0.1% 0.277833 0.0676856 X 0.3% 0.3335 0.2% 0.518833 0.0676856 0.0676856 XX X Multiple Range Tests for HOAT TINH by nguon duong Method: 95.0 percent LSD nguon duong Count LS Mean LS Sigma Homogeneous Groups S 0.251667 0.0552651 X G 0.501778 0.0552651 X Analysis of Variance for HOAT TINH - Type III Sums of Squares Source Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio P-Value A:nguon duong 0.2815 0.2815 33.24 0.0001 B:ty le bo sung 0.191056 0.0955282 11.28 0.0018 AB 0.2832 0.1416 16.72 0.0003 RESIDUAL 0.101633 12 0.00846939 MAIN EFFECTS INTERACTIONS TOTAL (CORRECTED) 0.85739 17 PHỤ LỤC O: Kết đếm bào tử đĩa cấy nấm Trichoderma harzianum môi trường PDA sau ngày Thí nghiệm Tổng bào tử/ml dịch huyền Bào tử/ml môi trường cấy phù 8 5,023*10 ± 0,126*10 8 4,363*10 ± 0,475*10 8 3,933*10 ± 0,404*10 8 5,190*10 ± 0,350*10 8 5,250*10 ± 0.530*10 Môi trường nuôi cấy 2,512*10 ± 0,063*10 Ngày nuôi cấy 2,182*10 ± 0,238*10 pH 1,967*10 ± 0,202*10 Nguồn đường bổ sung 2,595*10 ± 0,175*10 Nguồn chất cảm ứng 2,625*10 ± 0,265*10 6 6 6 6 6 PHỤ LỤC P: Hiệu khống chế nấm gây bệnh thán thư ớt chitinase thu từ Trichoderma harzianum ngày sau cấy ngày sau cấy PHỤ LỤC Q: Kết thí nghiệm ảnh hưởng enzyme chitinase đến bệnh thán thư Nghiệm thức Đối chứng ĐK tản nấm (cm) ĐK tản nấm bị phân giải (cm) Đường kính tản nấm (cm) Thí ĐK tản nghiệm nấm bị phân giải (cm) Ngày nuôi cấy NSC NSC 4,7 5,7 6,3 4,9 6,1 NSC 1,8 1,8 1,7 NSC 3,2 3,1 3,2 NSC 7,2 7,9 7,5 NSC 8,5 9 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1,7 4,4 5,9 6,8 1,8 1,5 2,8 4,5 4,5 5,5 5,6 6,9 7,8 7,8 0 3,3 3,5 5,5 6,6 0 3,3 3,7 5,5 0 3,4 3,7 5,5 6,5 PHỤ LỤC R: Ngày Summary Statistics for dk to nam bi phan giai mau tn Count Average Standard deviation Coeff of variation Minimu Maxi Rang Stnd m mum e skewness doi chung 0.0 % 0.0 0.0 0.0 0.0 enzyme 0.746333 0.0119304 1.59853% 0.733 0.756 0.023 -0.885573 Total 0.373167 0.408853 0.0 0.756 0.756 0.00139265 109.563% ANOVA Table for dk to nam bi phan giai by mau tn Source Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio Between groups 0.83552 0.83552 11740.33 0.0000 Within groups 0.000284667 0.0000711667 Total (Corr.) 0.835805 P-Value Multiple Range Tests for dk to nam bi phan giai by mau tn Method: 95.0 percent LSD mau tn Count Mean Homogeneous Groups doi chung 0.0 enzyme 0.746333 X X Ngày Summary Statistics for dk mau tn Count Average Standard deviation Coeff of variation Mini Maximum Rang Stnd mum e skewness doi chung % 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 enzyme 0.642333 0.0431432 6.71663% 0.593 0.673 0.08 -1.11901 Total 0.321167 0.352877 109.873% 0.0 0.673 0.0239098 0.673 ANOVA Table for dk by mau tn Source Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio P-Value Between groups 0.618888 0.618888 Within groups 0.00372267 0.000930667 Total (Corr.) 0.622611 664.99 0.0000 Multiple Range Tests for dk by mau tn Method: 95.0 percent LSD mau tn Count Mean Homogeneous Groups doi chung X enzyme 0.0 0.642333 X Ngày Summary Statistics for dk5 mau tn5 Count Average Standard deviation Coeff of variation Minim Maxi Rang Stnd um mum e skewness doi chung 0.0 % 0.0 0.0 0.0 0.0 enzyme 0.797333 0.0115036 1.44276% 0.786 0.809 0.023 0.0921249 Total 0.398667 0.436778 0.809 0.809 0.00114012 109.56% 0.0 ANOVA Table for dk5 by mau tn5 Source Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio P-Value Between groups 0.953611 0.953611 14412.25 0.0000 Within groups 0.000264667 0.0000661667 Total (Corr.) 0.953875 Multiple Range Tests for dk5 by mau tn5 Method: 95.0 percent LSD mau tn5 Count Mean doi chung 0.0 enzyme 0.797333 Homogeneous Groups X X Ngày Summary Statistics for dk mau tn Count Averag Standard e deviation Coeff of Mini Maximu Rang Stnd variation mum m e skewness doi chung % 0.0 0.0 enzyme 0.809 0.0348712 4.31041 % Total 0.4045 0.443656 0.0 0.0 0.769 0.833 109.68% 0.0 0.833 0.0 0.064 -1.15263 0.833 0.00998047 ANOVA Table for dk by mau tn Source Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio P-Value Between groups 0.981722 0.981722 0.0000 Within groups 0.002432 0.000608 Total (Corr.) 0.984154 Multiple Range Tests for dk by mau tn Method: 95.0 percent LSD mau tn Count Mean Homogeneous Groups doi chung 0.0 enzyme 0.809 X X 1614.67 ... dụng enzyme chitinase, sinh từ số vi sinh vật định Xuất phát từ vấn đề trên, sinh viên định thực đề tài Xác định số điều kiện nuôi cấy tối ưu nấm Trichoderma harzianum để thu nhận enzyme chitinase. ”... đích nghiên cứu Tìm điều kiện ni cấy tối ưu để thu nhận enzyme chitinase từ Trichoderma harzianum Nội dung nghiên cứu Định tính khả sinh tổng hợp chitinase từ chủng Trichoderma harzianum Khảo sát... động hệ enzyme chitinase 26 1.7 2.1 Khuẩn lạc Trichoderma harzianum nuôi cấy môi trường thạch dịch chiết khoai tây (PDA) Sợi nấm cuống bào tử Trichoderma harzianum Bào tử Trichoderma harzianum