Nghiên cứu thu nhận chondroitin sulfate từ sụn ức gà bằng phương pháp siêu âm kết hợp thủy phân bằng enzyme alcalase và khảo sát tính ổn định của sản phẩm

ĐẠI HỌC QUỐC GIA TP HCM TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA TRƯƠNG NGỌC THẢO NGHIÊN CỨU THU NHẬN CHONDROITIN SULFATE TỪ SỤN ỨC GÀ BẰNG PHƯƠNG PHÁP SIÊU ÂM KẾT HỢP THỦY PHÂN BẰNG ENZYME ALCALASE VÀ KHẢO SÁT TÍNH ỔN ĐỊNH CỦA SẢN PHẨM Chuyên ngành: Công nghệ thực phẩm Mã số: 8540101 LUẬN VÃN THẠC SĨ TP HỒ CHÍ MINH, Tháng 07 năm 2019 CƠNG TRÌNH ĐƯỢC HỒN THÀNH TẠI TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA -ĐHQG -HCM Cán hướng dẫn khoa học: GS.TS Đống Thị Anh Đào (Ghi rõ họ, tên, học hàm, học vị chữ ký) Cán chấm nhận xét 1: TS Nguyễn Hoài Hương (Ghi rõ họ, tên, học hàm, học vị chữ ký) Cán chấm nhận xét 2: TS Trần Thị Thu Trà (Ghi rõ họ, tên, học hàm, học vị chữ ký) Luận văn thạc sĩ bảo vệ Trường Đại học Bách Khoa, ĐHQG Tp HCM ngày 10 tháng 07 năm 2019 Thành phần Hội đồng đánh giá luận văn thạc sĩ gồm: (Ghi rõ họ, tên, học hàm, học vị Hội đồng chấm bảo vệ luận vãn thạc sĩ) CT: TS Trần Bích Lam PB1: TS Nguyễn Hoài Hương PB2: TS Trần Thị Thu Trà UV: TS Lê Ngọc Liễu UV,TK: TS Nguyễn Thị Hiền Xác nhận Chủ tịch Hội đồng đánh giá LV Trưởng Khoa quản lý chuyên ngành sau luận văn sửa chữa (nếu có) CHỦ TỊCH HỘI ĐỒNG TRƯỞNG KHOA KỸ THUẬT HĨA HỌC ĐẠI HỌC QUỐC GIA TP.HCM CỘNG HỊA XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA Độc lập - Tự - Hạnh phúc NHIỆM VỤ LUẬN VÃN THẠC SĨ Họ tên học viên: TRƯƠNG NGỌC THẢO MSHV: 1870066 Ngày, tháng, năm sinh: 09/07/1995 Nơi sinh: Đồng Nai Chuyên ngành: Công nghệ Thực phẩm .Mã số: 8540101 I TÊN ĐỀ TÀI: NGHIÊN CỨU THU NHẬN CHONDROITIN SULFATE TỪ SỤN ỨC GÀ BẰNG PHƯƠNG PHÁP SIÊU ÂM KẾT HỢP THỦY PHÂN BẰNG ENZYME ALCALASE VÀ KHẢO SÁT TÍNH ỔN ĐỊNH CỦA SẢN PHẨM II NHIỆM VỤ VÀ NỘI DUNG: Tổng quan tài liệu nguyên liệu sụn ức gà, enzyme dùng thủy phân Phân tích số thành phần sụn ức gà Thiết lập quy trình công nghệ thu nhận cs phương pháp siêu âm kết hợp thủy phân bang enzyme Alcalase 2,4L Khảo sát yếu tố trình ảnh hưởng đến hiệu suất thu hồi cs từ sụn ức gà gồm: trình xử lý nhiệt nguyên liệu, trình siêu âm, q trình thủy phân Tối ưu hóa q trình siêu âm sụn ức gà để đạt hiệu suất thu nhận cs cao Khảo sát điều kiện trình thủy phân bang enzyme Alcalase2,4L Khảo sát điều kiện trình sấy phun thu nhận chế phẩm Phân tích thành phần chế phẩm cs thu Lão hóa chế phẩm cs nghiên cứu để xác định hạn sử dụng phương pháp gia tốc nhiệt III NGÀY GIAO NHIỆM VỤ: (Ghi theo QĐ giao đề tài) IV NGÀY HOÀN THÀNH NHIỆM VỤ: (Ghi theo QĐ giao đề tài) V CÁN BỘ HƯỚNG DÂN (Ghi rõ học hàm, học vị, họ, tên): GS.TS Đống Thị Anh Đào Tp HCM, ngày tháng năm 20 CÁN BỘ HƯỚNG DẪN (Họ tên chữ ký) CHỦ NHIỆM BỘ MÔN ĐÀO TẠO (Họ tên chữ ký) TRƯỞNG KHOA KỸ THUẬT HÓA HỌC (Họ tên chữ ký) LỜI CẢM ƠN Lời em xin gửi lời cám ơn chân thành đến tất quý thầy cô trường Đại học Bách Khoa TP.HCM, đặc biệt thầy cô môn Công nghệ Thực phẩm tận tình giảng dạy giúp đỡ suốt trình em học trường tạo điều kiện tốt để em hồn thành luận vãn tiến độ Em xin gửi lời cảm ơn chân thành đến Nguyễn Thị Ngun - quản lý phòng thí nghiệm B10 giúp đỡ tạo điều kiện thuận lợi trang thiết bị, dụng cụ, hóa chất suốt thời gian làm đề tài nghiên cứu Đặc biệt cho phép em bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến cô GS TS Đống Thị Anh Đào tận tình hướng dẫn có định hướng thiết thực giúp em giải vấn đề nghiên cứu cách hiệu khoa học Cuối em xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến gia đình bạn bè đồng hành, động viên, khích lệ tạo điều kiện tốt để em tham gia học tập hoàn thành tốt cơng trình nghiên cứu Em xin gửi lời chúc sức khỏe đến gia đình, thầy bạn bè Trân trọng cảm ơn ! TP HCM, thảng 07 năm 2019 Học viên thực Trương Ngọc Thảo TÓM TẮT Chondroitin sulfate (CS) hợp chất thiên nhiên tổng hợp thể động vật bậc cao tồn mơ liên kết, có tác dụng phòng ngừa hỗ trợ điều trị bệnh xương khớp Sụn ức gà phụ phẩm ngành công nghiệp chế biến thịt gà, chứa hàm lượng cs cao, việc tách chiết thu nhận cs từ nguồn để bổ sung vào thành phần loại thực phẩm chức có ý nghĩa thiết thực Từ nguyên liệu thô, qua trình xử lí sơ bộ, chần nhiệt độ 80°C vòng phút thu sụn thơ Các điều kiện q trình siêu âm tối ưu hóa phương pháp bề mặt đáp ứng (RSM) Các giá trị tối ưu trình siêu âm ứng với biến Z1, Z2, Z3, Z4 điều kiện siêu âm gồm: tỉ lệ nguyênliệurđệm 1:9 (wnguyên Iiệu/Wđệm); pH 9; nhiệt độ 47,34°c thời gian siêu âm 9,5 phút Các điều kiện thủy phân để thu nhận Chondroitin sulfate chế phẩm enzyme Alcalase 2,4L xác định gồm hàm lượng enzyme/cơ chất 4% (v/wpro), nhiệt độ thủy phân 55°c thời gian 60 phút Hiệu suất thu hồi cs đạt 24,29% so với hàm lượng chất khô; 61,02% so với Carbohydrate tổng Sau thủy phân, tiến hành vô hoạt enzyme 80°C 10 phút, dùng TCA 4% (w/v) để loại bỏ protein hòa tan, ly tâm, lọc chân khơng với màng Whatman có kích thước lỗ 15-20pm thu lấy dịch thẩm tích màng cellophane MWC0 14 kDa vòng Các thơng số ảnh hưởng đến q trình sấy phun gồm nhiệt độ khơng khí đầu vào tốc độ bơm nhập liệu sấy thiết bị sấy phun hiệu Buchi B290 thu nhận chế phẩm cs dạng bôt mịn đạt độ ẩm theo tiêu chuẩn USP38 khảo sát Ket xác định thông số trình sấy phun, với tốc độ bơm nhập liệu 7,5 ml/phút nhiệt độ khơng khí đầu vào 140°C độ ẩm sản phẩm đạt 6,47% phù hợp theo tiêu chuẩn USP38 Chế phẩm kiểm tra phương pháp sắc ký lỏng hiệu cao (HPLC) sắc ký thẩm thấu gel (GPC) đạt độ tinh 88,86% khối lượng phân tử trung bình 184,57kDa Áp dụng phương pháp gia tốc nhiệt để đánh giá hạn sử dụng chế phẩm cs nghiên cứu nhằm tiết kiệm thời gian Chế phẩm cs nghiên cứu sau đem chia thành đơn vị mẫu (khối lượng lg/gói, bảo quản bao bì nhựa PE, hàn kín) lưu trữ mốc nhiệt độ 35°C; 40°C; 45°c xác định hàm lượng cs theo mốc thời gian Từ liệu thực nghiệm, xác định có mối tương quan hàm lượng thời gian bảo quản chế phẩm cs nghiên cứu Mối tương quan thể công thức Arrhenius thời hạn sử dụng che phẩm cs nghiên cứu 21,64 tháng bảo quản 30°C i ABSTRACT Chondroitin sulfate (CS) is a natural compound synthesized in the body of animals and exists in connective tissues, which helps prevent and support for the treatment of osteoarthritis Chicken keel cartilage, a by-product of the poultry slaughter industry, contains high cs content, therefore it is meaningful to extract cs from this source to add to functional food ingredients From raw materials, through pretreatment and blanching processes at a temperature of 80°C for minutes, preliminary treatment of crude cartilage was obtained The variables of the ultrasound treatment process were investigated and optimal conditions were obtained by Response Surface Methodology - RSM method Optimal values for independent variables Z1, Z2, Z3, Z4 were found at a ratio of material and buffer 1:9 (Wmateriai/Wbuffer), pH9, temperature 47,34°c, and time within 9,5 minutes After ultrasound treatment, hydrolysis using the enzyme Alcalase was performed under the following conditions: ratio enzyme to substrate 4% (v/w), temperature 55°c, and time 60 minutes The overall yield of cs was 24,29% of the absolute dry weight, and 61,02% of the total carbohydrate content of the starting material At the end of hydrolysis, enzyme was inactivated at 80°C for 10 minutes, then using trichloacetic acid 4% w/v (TCA) to precipitate protein, hydrolyzed cs was ccntrafugatcd and was filtered by vacuum filtration method through Whatman filter paper of 15-20 pm Then the filtrate was dialyzed by dialysis tubing cellulose membrane with MWCO 14 kDa for hours to remove out impurities like TCA, amino acids, and minerals The powdered cs with moisture content at 6,47% meet the USP38 standard was obtained by spray drying by the Buchi B-290 laboratory scale spray dryer at flow rate at 7,5 mL/min and temperature of air-in at 140 °C HPLC analysis showed that the powder product contained 88,86% cs with an average molecular weight of 184,57 kDa (determined by GPC) Application of thermal acceleration method to evaluate the shelf life of the research cs product to save time The researched cs products were divided into sample units (weight of lg I pack, stored in PE plastic packaging, sealed) were stored at three level temperature 35°C; 40°C; 45°c and determined cs content following time storage From experimental data, there was a correlation between the cs content and storage time of the researched product This correlation was expressed by the Arrhenius formula and the shelf life of the researched cs was 21,64 months when stored at 30°C ii LỜI CAM ĐOAN Luận văn cơng trình nghiên cứu cá nhân tơi, thực hướng dẫn GS.TS Đống Thị Anh Đào Các số liệu, kết luận nghiên cứu trình bày luận vãn hồn tồn trung thực Tơi xin hồn tồn chịu trách nhiệm lời cam đoan Học viên Tnnmg Ngọc Thảo Chuang 3: KẾT QUÁ VÀ BÀN LUẬN Hình 3.17: Ảnh chụp SEM cs chuẩn (a) chế phẩm nghiên cứu (b) Nhận xét: Kính hiển vi điện tử quét (SEM) quét bề mặt mẫu chùm tia điện tử hội tụ cao chân khơng, thu thập thơng tin (tín hiệu) từ mẫu phát ra, tái tạo thành hình ảnh lớn bề mặt mẫu hiển thị lên hình SEM giúp quan sát bề mặt vật rắn độ phóng đại khác nhau; độ sâu trường quan sát lớn nhiều so với kính hiển vi quang học, cho phép thu ảnh lập thể Từ hình 3.17 cho thấy, phân tử cs có cấu trúc bậc 3, kết lại thành hình cầu lõm bề mặt Tại độ phóng đại, hình dạng bề mặt kích thước phân tử cs mẫu chuẩn mẫu nghiên cứu khơng có khác biệt lớn Ảnh chụp cho thấy mẫu cs chuẩn có khối lượng phân tử thấp phân tử cs có kích thước nhỏ phân bố so với mẫu nghiên cứu Điều phù hợp với kết phân tích sắc ký đồ GPC 3.8.5 Kết phân tích FTIR Mỗi hợp chất hóa học hấp thụ lượng hồng ngoại tần số đặc trưng, cấu trúc vật chất xác định vị trí vạch hấp thu phổ nhận Từ kết hình 3.18 cho thấy mẫu cs nghiên cứu có xuất tất peak độ chuyển dời hóa học đặc trưng, tương đồng với mẫu cs chuẩn mẫu thương mại, không thấy xuất 58 Chuang 3: KẾT QUÁ VÀ BÀN LUẬN peak lạ, cho thấy mẫu có độ tinh cao, từ cho thấy sụn ức gà nguồn nguyên liệu tiềm để thu nhận cs [2] Wavenumber cn>1 Hình 3.18: Kết sắc kí đồ FTIR mẫu cs chuẩn; cs nghiên cứu cs thương mại 59 Chuang 3: KẾT QUÁ VÀ BÀN LUẬN 3.9 Khảo sát tính ổn định chế phẩm nghiên cứu Hầu hết giảm chất lượng sản phẩm tuân theo phương trình Arrhenius [41]: = k(A)n Trong đó: A: Một thuộc tính chất lượng đo đạc (trong trường hợp hàm lượng CS) n: Bậc phản ứng k: Hằng số tốc độ Trong trường hợp phản ứng bậc bậc 1, phương trình Arrhenius chuyển thành mơ hình tuyến tính: kjrt - k2ts2 Trong đó: ki: số tốc độ nhiệt độ T1 k2: số tốc độ nhiệt độ T2 tsi: thời gian sử dụng nhiệt độ T1 tS2: thời gian sử dụng nhiệt đô T2 Hằng số k phương trình Áp dụng mơ hình Arrhenius, biểu thức tốn học tổng qt: k = kữ.e~EAlKr Trong đó: ko: số, không phụ thuộc vào nhiệt độ (hang so Arrhenius) k: số tốc độ nhiệt độ T EA: lượng hoạt hóa (J/mol) R: số khí lý tưởng (R=8,314J/K.mol) T: nhiệt độ (K) Bảng 3.8: Sự thay đổi hàm lượng chế phẩm Hàm lượng (%) Thòi gian (Tháng) 35°c 88,86 86,93 40°C 88,86 85,77 60 45°c 88,86 84,43 Chuang 3: KẾT QUÁ VÀ BÀN LUẬN 85,59 83,7 79,73 83,93 80,89 72,87 82,85 75,28 79,23 10 4- Vẽ đồ thị lnCt -1 (tháng) Tính hồi quy bậc nhất, ta có số tốc độ k: - Ở 35°C: k35=0,0088 tháng-1 (r=0.9934) - Ở 40°C: k40=0,0153 tháng-1 (r-0.9954) - Ở 45°C: k45=0,0271 tháng-1 (r=0.9989) Hình 3.19: Đồ thị lnC-t (tháng) 35°c ả y=- D,0L53x + 1,4857 R - 0,995 Thòi gian (tháng) Hình 20: Đồ thị lnC-t (tháng) 40"C 61 Chuang 3: KẾT QUÁ VÀ BÀN LUẬN 4,5 4.48 v = -0.0271x 4.4881 R2 = 0.9989 4,46 4.44 y 4.42 4,4 '*- •1 4.38 » Thời gian (tháng) Hình 21: Đồ thị lnC-t (tháng) 45"C 4- Đe tính HSD 30°C cần tính k30 Nhiệt độ (°C) 35 k Ink (1/T) 0,0088 -4,7330 0,0032452 40 0,0153 -4,1799 0,0031934 45 0,0271 -3,6082 0,0031432 Vẽ đồ thị lnk-l/T Bảng 3.9: Bảng giá trị đồ thị lnk-l/T theo nhiệt độ -3,0000 y =-11025x+31,04 R2 = 0,9996 -3,5000 -4,0000 -2,5000 0,0031400 0,0031600 O.0O31B00 0,1 0,0032200 ■4,5000 ■5,0000 1.T Hình 22: Đồ thị lnk-l/T Tính hồi quy bậc 62 0,0032400 0,003 2600 Chuang 3: KẾT QUÁ VÀ BÀN LUẬN Ink = C1 - Eo/(RT) = 31,04 - 11025/T Tính số k30 theo phương trình: lnk30= 31,04 - 11025/(273,15+30)= -5,33 => k30=4,844.10-3 Hạn sử dụng chế phẩm xác định khoảng thời gian để hoạt chất lại 90% so với trị so ban đầu, nên: to.9 = 0.105/k30 =21,64 tháng Hạn sử dụng chế phẩm cs nghiên cứu bảo quản 30°C xấp xỉ 21,64 tháng Giải thích: - Nhiệt độ ảnh hưởng đến độ giảm hàm lượng cs theo thời gian bảo quản: Phân tử cs có bậc cấu trúc tùy vào liên kết chuỗi phân tử GlcA-GalNAc không gian Bậc dạng mạch thẳng bắt đầu với gốc đường đơn theo phương thức cố định liên kết Tctrasaccharidc: xylose-galactose-galactose-glucuronic acid (Xyl-Gal-Gal-GlcA), nối tiếp chuỗi disaccharide GlcA-GalNAc Bậc dạng xoắn lò xo xuất hiệu ứng dịch chuyển điện tích hạt nhân (Nuclear Overhauser effects (NOEs)), làm cho gốc carboxylate (COO' ) nhóm amino acetyl tiến lại gần hình liên kết nội phân tử Bậc có dạng hình xoắn ốc dạng ổn định cấu trúc bậc [42] Khi tiến hành nghiên cứu thu nhận tinh cs, để thu chế phẩm dạng bột, dịch thủy phân sau thẩm tích để tinh đạt hàm lượng chất khô yêu cầu đem sấy phun Dựa vào kết thực nghiệm thu từ hình chụp SEM cho thấy cấu trúc phân tử cs chế phẩm sau sấy phun có dạng cấu trúc bậc 3, hình cầu lõm bề mặt (Hình 3.21) Trong trình gia tốc nhiệt để xác định tính ổn định sản phẩm, tác động nhiệt độ cao thời gian dài, phân tử protein tạp chế phẩm biến tính, cấu trúc bậc 3, bậc chuyển thành bậc 1, bậc 2, phân tử protein bị giãn mạch liên kết thứ cấp bị phá vỡ, liên kết với cs bị lỏng lẻo Bên cạnh đó, liên kết nội phân tử cấu trúc cs yếu đi, cs từ cấu trúc bậc duỗi dạng đơn giản (bậc 2, bậc 1) Khi tiếp tục tăng mốc nhiệt độ khảo sát, khả liên kết yếu làm chuỗi cs bị đứt mạch, làm giảm khối lượng phân tử trung bình cs sản phẩm từ hàm lượng cs giảm dần xác định phương pháp định lượng HPLC Kết luận: Có mối tương quan hàm lượng thời gian bảo quản chế phẩm cs nghiên cứu Mối tương quan thể công thức Arrhenius thời hạn sử dụng chế phẩm cs nghiên cứu 21,64 tháng bảo quản 30°C 63 Chuang 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ Chương 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 4.1 Kết luận Trong nghiên cứu này, thiết lập quy trình cơng nghệ thu nhận cs từ sụn ức gà enzyme Alcalase sau thực trình loại peptide polypeptide phương pháp hóa học hóa lý kết tủa TCA, lọc qua màng 15pm, thẩm tích để thu dịch chứa cs sấy phun để thu nhận chế phẩm cs Áp dụng mơ hình Arrhenius để xác định hạn sử dụng chế phẩm nghiên cứu Từ làm sở để khảo sát yếu tố ảnh hưởng đến hiệu suất thu hồi cs xác định mức tối thích tương ứng với yếu tố ảnh hưởng Nghiên cứu đưa điều kiện thích hợp để thủy phân sụn ức gà sau: Điều kiên chần: - Nhiệt độ chần: 85°c - Thời gian chần: phút Điều kiên siêu âm: - Tỉ lệ nguyên liệu:đệm: 1:9 -pH9 - Nhiệt độ siêu âm: 47,5°c - Thời gian siêu âm: 9,5 phút Điều kiện thủy nhãn: -pH6 - Nhiệt độ thủy phân: 54°c - Hàm lượng enzyme/cơ chất: 0,84% (w/wpro) - Thời gian thủy phân: 3,5 Điều kiện sẩy phun: - Nhiệt độ sấy phun: 140°C - Tốc độ nhập liệu: 7,5ml/phút Thơng số đánh giá hiệu q q trình thu nhân CS: - Hiệu suất trình thu nhận CS: 61,02% so với Carbohydrate tổng - Hàm lượng CS/chất khô tuyệt đối: 24,29% - Độ tinh sạch: 88,86% - HSD xác định phương pháp gia tốc nhiệt: 21,64 tháng 4.2 Kiến nghị - Cần có nghiên cứu nâng cao độ tinh cs để đạt chế phẩm cs có độ tinh >90% 62 Chuang 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ - Xác định số tính chất chế phẩm CS: độ bền nhiệt, độ bền acid, - Đưa nghiên cứu rút ngắn thời gian thu nhận cs - Khảo sát độ ổn định chế phẩm phương pháp trực tiếp để kiểm chứng mơ hình động học thiết lập, đưa hạn sử dụng xác - Nghiên cứu ứng dụng tạo loại thực phẩm chức làm giảm giá thành sản phẩm sản phẩm ngoại nhập 63 TÀI LIỆU THAM KHẢO TÀI LIỆU THAM KHẢO [1] [2] [3] [4] [5] [6] [7] [8] [9] [10] [11] [12] [13] [14] [15] [16] [17] F G Luo XM, Leach RM Jr., "Chicken Keel Cartilage as a Source of Chondroitin Sulfate," Poultry Science, vol 81, pp 1086-1089, 2002 L w W.Gamjanagoonchom, A Engkagul, "Determination of chondroitin sulfate from different sources of cartilage," Chemical Engineering and Processing: Process Intensification, vol 45, no 5, pp 465471, 2007 V H B Võ Thị Thanh Tâm, "Nghiên cứu tách chiết chondroitin sulfate từ xương sụn cá đuối (dasyatis kuhlii) cá nhám (carcharhinus sorrah) công nghệ sinh học," Tạp Viện nghiên cứu hải sản, vol 16, pp 26-30, 2010 K H Mikami T, "Biosynthesis and function of chondroitin sulfate.," Biochimica et Biophysica Acta, vol 1830, pp 4719-4733,2013 s J Shang Q, Song G, Zhang M, Cai c, Hao J, Li G, Yu G, "Structural modulation of gut microbiota by chondroitin sulfate and its oligosaccharide.," International Journal of Biological Macromolecules, vol 89, pp 489-498, 2016 M J Rhee DK, Baker M, Gong Y, Smits p, Lefebvre V, Jay GD, Stewart M, Wang H, Warman ML, Carpten JD, "The secreted glycoprotein lubricin protects cartilage surfaces and inhibits synovial cell overgrowth," Journal of Clinical Investigation, vol 115, pp 622-631, 2005 L RM, "Chondroitin sulfate: A complex molecule with potential impact on a wide range of biological systems," Complement TherMed, vol 17, pp 56-62, 2009 L R Szychlinska MA, Al-Qahtani M, Mobasheri A, Musumeci G., "Altered joint tribology in osteoarthritis: Reduced lubricin synthesis due to the inflammatory process New horizons for therapeutic approaches.," Annals of Physical and Rehabilitation Medicine, vol 59, pp 149-156,2016 T E Uebelhart D, Delmas PD, Chantraine A, Vignon E., "Effects of oral chondroitin sulfate on the progression of knee osteoarthritis: a pilot study.," Osteoarthritis Cartilage, vol 6, pp 39-46,1998 w J Lee YH, Choi SJ, Ji JD, Song GG., "Effect of glucosamine or chondroitin sulfate on the osteoarthritis progression: a meta-analysis.," Rheumatol Int, vol 30, pp 357-363, 2010 p J Simon Wandel, Britta Tendal, Eveline Nuesch, Peter M Villiger, Nicky J Welton, Stephan Reichenbach, Sven Trelle, "Effects of glucosamine, chondroitin, or placebo in patients with osteoarthritis of hip or knee: network meta-analysis," BMJ, vol 341, pp 1-9, 2010 A p Asimakopoulou, "The Biological Role of Chondroitin Sulfate in Cancer and Chondroitin-based Anticancer Agents," IN VIVO, vol 22, pp 385-390, 2008 D G Iovu M, du Souich p., "Anti-inflammatory activity of chondroitin sulfate," Osteoarthritis and Cartilage, pp 14-18, 2008 T N Anchalee Srichamroena, Zeb Pictrasik, Lech Ozimek, MữkoBetti, "Chondroitin sulfate exfraction from broiler chicken cartilage by tissue autolysis," LWT - Food Science and Technology, vol 50, pp 607-612, 2013 w H Liu AnJun, Zhu ZhenYuan, Liu YuJiang, Liang JinSuo, "Extraction of the chondroitin sulfate from Sturgeon cartilage.," vol 25, pp 617-619, 2009 J Xie, Ye, HY, Luo, XF, "An efficient preparation of chondroitin sulfate and collagen peptides from shark cartilage," vol 21, pp 1171-1175, 2014 B Lignot, V Lahogue, and p Bourseau, "Enzymatic extraction of chondroitin sulfate from skate cartilage and concentration-desalting by ultrafiltration," Journal of biotechnology, vol 103, no 3, pp 64 TÀI LIỆU THAM KHẢO [18] [19] [20] [21] [22] [23] [24] [25] [26] [27] [28] [29] [30] [31] [32] [33] [34] [35] [36] 281-284, 2003 R w Famdale, D J Buttle, and A J Barrett, "Improved quantitation and discrimination of sulphated glycosaminoglycans by use of dimethylmethylene blue," Bỉochỉmỉca et Biophysica Acta (BBA)-General Subjects, vol 883, no 2, pp 173-177, 1986 V Hascall, "Proteoglycans: the chondroitin sulfate/keratan sulfate proteoglycan of cartilage," ISIAtlas Sci Biochem, vol l,pp 189-198, 1988 H Kitagawa, T Uyama, and K Sugahara, "Molecular cloning and expression of a human chondroitin synthase," Journal of Biological Chemistry, vol 276, no 42, pp 38721-38726, 2001 M Bemfield et al., "Functions of cell surface heparan sulfate proteoglycans," Annual review of biochemistry, vol 68, no 1, pp 729-777,1999 T Nakano, z Pietrasik, L Ozimek, and M Betti, "Extraction, isolation and analysis of chondroitin sulfate from broiler chicken biomass," Process Biochemistry, vol 47, no 12, pp 1909-1918,2012 s s Jun-Kyo Suh, Takashi March, J.Richard Steadman, Savio L.Y.Woo, "Basic science of articular cartilage injury and repair ," Operative Techniques in Sports Medicine, vol 3, no 2, pp 78-86,1995 N R Association, "Essential Rendering-All about the Animal By-products Industry," Alexandria, VA: National Renderers Association, 2006 K w Jang, "Biophysical effects of ultrasound therapy for cartilage regeneration and microbubble mediated shock waves and drug release control for cancer treatment," 2015 K Li, Z.-L Kang, Y.-F Zou, X.-L Xu, and G.-H Zhou, "Effect of ultrasound treatment on functional properties of reduced-salt chicken breast meat batter," Journal of food science and technology, vol 52, no 5, pp 2622-2633,2015 p McPhie, "[4] Dialysis," in Methods in enzymology, vol 22: Elsevier, 1971, pp 23-32 L Craig and w Konigsberg, "Dialysis studies, in Modification of pore size and shape in cellophane membranes," The Journal of Physical Chemistry, vol 65, no 1, pp 166-172, 1961 M Blanco, J Fraguas, c Sotelo, R Perez-Martin, and J Vazquez, "Production of chondroitin sulphate from head, skeleton and fins of Scyliorhinus Canicula by-products by combination of enzymatic, chemical precipitation and ultrafiltration methodologies," Marine drugs, vol 13, no 6, pp 3287-3308, 2015 s Shin, s You, B An, and c Kang, "Study on Exfraction of Mucopolysaccharide-protein Containing Chondroitin Sulfate from Chicken Keel Cartilage Electrophoresis," Asian- australasian journal of animal sciences, vol 19, no 4, pp 601-604, 2006 A Srichamroen, T Nakano, z Pietrasik, L Ozimek, and M Betti, "Chondroitin sulfate extraction from broiler chicken cartilage by tissue autolysis," LWT-Food Science and Technology, vol 50, no 2, pp 607612, 2013 M Vittayanont and T Jaroenviriyapap, "Production of crude chondroitin sulfate from duck trachea," International Food Research Journal, vol 21, no 2, p 791, 2014 T Nakano and L Ozimek, "Chondroitin sulphate distribution in broiler chicken carcasses," British poultry science, vol 55, no 1, pp 54-58, 2014 s Xiong, A Li, z Wu, and M Wei, "Extraction, separation and purification of chondroitin sulfate from chicken keel cartilage," Transactions of the Chinese Society of Agricultural Engineering, vol 25, no 1, pp 271-275, 2009 J A Vazquez, M Blanco, J Fraguas, L Pastrana, and R Perez-Martin, "Optimisation of the extraction and purification of chondroitin sulphate from head by-products of Prionace glauca by envứonmental friendly processes," Food chemistry, vol 198, pp 28-35, 2016 User Guide to BioPAT®MODDE Version 11 65 TÀI LIỆU THAM KHẢO [37] [38] [39] [40] [41] [42] T T An, Kiểm nghiệm dược phẩm Hà Nội: Nhà xuất Y Học, 2005 s Shin, s You, B An, and c Kang, "Study on extraction of mucopolysaccharide-protein containing chondroitin sulfate from chicken keel cartilage," ASIAN AUSTRALASIAN JOURNAL OF ANIMAL SCIENCES, vol 19, no 4, p 601, 2006 T Zhao et al., "Extraction, purification and characterisation of chondroitin sulfate in Chinese sturgeon cartilage," Journal of the Science of Food and Agriculture, vol 93, no 7, pp 1633- 1640, 2013 Specification Sheet - CHONDROITIN SULFATE (Bovine) [Online], S.-Y Lee and J Krochta, "Accelerated shelf life testing of whey-protein-coated peanuts analyzed by static headspace gas chromatography," Journal of agricultural and food chemistry, vol 50, no 7, pp 20222028, 2002 J E Scott, F Heatley, and B Wood, "Comparison of secondary structures in water of chondroitin-4sulfate and dermatan sulfate: implications in the formation of tertiary structures," Biochemistry, vol 34, no 47, pp 15467-15474, 1995 66 PHỤ LỤC PHỤ LỤC A CÁC PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH A.l Phương pháp xác định ẩm Nguyên tẳc: Dùng nhiệt để làm bay nước có mẫu Từ chênh lệch khối lượng mẫu trước sau sấy, tính độ ẩm mẫu sấy mẫu 100 - 105°C đến khối lượng khơng đổi, lượng nước tự có mẫu bốc hết Thiết bi, dung cu, vát liêu: tủ say, cốc sứ Tiến hành thi nshỉêm: Xác định khối lượng khô tuyệt đối cốc sứ cách sấy cốc sứ 105°C Tại thời điểm sấy cuối cùng, đậy nắp cốc sứ chuyển vào bình hút ẩm để làm nguội tới nhiệt độ phòng, sau tiến hành cân (trước cân mở nắp cốc sứ để làm cân áp suất đậy lại ngay) Cân 2g mẫu thử vào cốc cân, mở nắp cho vào tủ sấy, sấy nhiệt độ 105°C Sau tiếng, cân khối lượng mẫu lần sau 30 phút cân lại mẫu lần chênh lệch lần cân liên tiếp khơng lớn 0,05% Cồng thức tính tốn: X(%) = mi~m2xl00% Mị Trong đó: mi : khối lượng mẫu thử trước sấy, g m2 : khối lượng mẫu thử sau sấy, g A.2 Phương pháp xác định hàm lượng tro Nguyên tắc: Dùng sức nóng (550 - 600°C) nung cháy hồn tồn chất hữu Phần lại đem cân tính phần trăm tro có thực phẩm Thiết bi, dung cu, vãt liêu: chén nung sứ, bếp điện, lò nung điều chỉnh nhiệt độ (500 - 600°C), cân phân tích, bình hút ẩm Iloả chat: HNƠ3 đậm đặc H2O2 Tiến hành: Nung chén rửa tới 500 - 600°C đến trọng lượng khơng đổi Đe nguội bình hút ẩm cân 67 PHỤ LỤC cân phân tích xác đến 0,000 lg Cho vào chén khoảng 5g mẫu cân so.Tiến hành nung bếp điện đến tạo tro đen Sau cho tất vào lò nung tăng nhiệt độ từ từ đến 500 - 600°C Nung tro trắng, nghĩa loại hết chất hữu cơ, thường 6-8 Trong trường hợp tro đen, lấy để nguội, cho thêm vài giọt HNO3 đậm đặc H2O2 nung cho trắng Đe nguội bình hút ẩm cân cân phân tích Tiếp tục nung thêm nhiệt độ vòng 30 phút để nguội bình hút ẩm cân khối lượng không đổi Kết hai nung cân liên tiếp không cách 0,0005g cho mẫu Cóng thức tính tốn: X(%)= G|“Gxl00 m Trong đó: G : khối lượng chén nung, g Gi: khối lượng chén nung tro tong số, g m : khối lượng mẫu thử, g A.3 Phương pháp xác định hàm lượng béo Ngun tẳc: Dựa vào tính tan hồn tồn chất béo vào dung mơi hữu Dùng dung mơi hữu trích ly chất béo có sản phẩm thực phẩm Sau làm bay hết dung mơi, chất béo lại đem cân, tính hàm lượng chất béo có sản phẩm thực phẩm Thiết bỉ, dung cu, vát liêu: trích ly soxhlet, tủ sấy, bình hút ẩm Hố chat: Dung mơi Hexan Tiến hành: Sấy khô nguyên liệu đến khối lượng không đổi Cân xác 5g nguyên liệu nghiền nhỏ, cho vào bao giấy sấy khô biết khối lượng Đặt bao giấy vào trụ chiết Lắp trụ chiết vào bình cầu gắn sinh hàn Qua đầu sinh hàn, dùng phễu cho dung môi vào trụ chiết cho lượng dung môi chảy xuống bình cầu lượng phễu đủ ngập mẫu Dùng làm nút đầu ống sinh hàn Mở nước lạnh vào ống sinh hàn Mở công tắc đèn nhốt đầu trích lipid Điều chỉnh nhiệt độ trích cho chu kỳ hồn lưu dung mơi đạt từ đến lần 68 PHỤ LỤC Chiết trích ly hoàn toàn hết chất béo Thử cách lấy vài giọt dung môi cuối ống xiphong nhỏ lên giấy lọc, dung môi bay không để lại vết dầu loang kết thúc Cho dung mơi chảy xuống hết bình cầu Lấy bao giấy ra, đặt tủ hotte cho bay hết dung môi nhiệt độ thường cho vào tủ sấy, sấy 100- 105°C 1,5 Đe nguội bình hút ẩm, cân xác định khối lượng Câng thức tính tốn: Trong đó: Mi : khối lượng bao giấy mẫu ban đầu, g M2 : khối lượng bao giấy mẫu sau trích lipid sấy khơ, g m : khối lượng mẫu ban đầu, g A.4 Phương pháp Kjeldahl Nguyên tẳc: Khi đốt nóng mẫu đem phân tích với H2SO4 đậm đặc, hợp chất dễ bị oxy hóa Carbon hydro thành CO2 H2O, nitơ sau giải phóng dạng NH3 kết hợp với H2SO4 tạo thành (NH4)2SƠ4 tan dung dịch Đuổi NH3 khỏi dung dịch NaOH đồng thời chưng cất thu hoi NH3 lượng dư H2SO4 0,1 N lại dung dịch NaOH chuẩn, qua tính lượng nitơ có mẫu ngun liệu thí nghiệm Cóng thức tính tốn: (a-bx ^)x0,0014x V xioo uxm Trong đó: N: : Hàm lượng Nitơ tính phần trăm khối lượng : Số ml dung dịch chuẩn H2SO4 O,1N đem hấp thụNH3 : Số ml NaOH 0,1 N tiêu tốn cho chuẩn độ : Khối lượng mẫu đem vô hóa mẫu,g : Tổng thể tích định mức dung dịch vơ vơ hóa (lOOml) : Tổng thể tích dung dịch vơ hóa mẫu cần phân tích(lOml) V 0,0014 : Lượng gam nitơ tương ứng với H2SO4 O,1N K : Hệ số điều chỉnh nồng độ NaOH 0,1 N V 69 PHỤ LỤC Hàm lượng protein thô: Protein (%) - nitơ (%)x6,25 A.5 Phương pháp Sigma-Aldrich St Louis xác định hoạt độ enzyme Nguyên tắc: Cho enzyme thủy phân tác dụng với chất casein, sản phẩm tạo thành đoạn peptide ngắn, acid amin Trong loại acid amin L-Tyrosine chiếm đa số Xác định L-Tyrosine phản ứng màu với thuốc thử Foline, từ xác định hoạt tính enzyme theo định nghĩa: Một đơn vị hoạt độ enzyme theo phương pháp Sigma-Aldrich St Louis lượng enzyme tối thiểu điều kiện thí nghiệm pH 7,5; nhiệt độ t=37°c, thủy phân casein phút tạo thành sản phẩm hòa tan TCA, phản ứng với thuốc thử Foline, cho độ hấp thu bước sóng 660nm tương ứng với lmM LTyrosine đường chuẩn Đe xác định hoạt tính chế phẩm enzyme: - Cơ chất: dung dịch L-Tyrosine l,lmM - Điều kiện tiêu chuẩn: pH 7,5; t=37°c Hoá chất: - Đệm H2HPO4 50mM, pH 7,5; t=37°c - Casein 0,65% (v/v) - Dung dịch TCA lOmM - Thuốc thử Foline & Ciocalteau (tỷ lệ thuốc thử:nước cất = 1,4) - Dung dịch Na2CO3 50mM - Dung dịch đệm acetate lOmM, pH 7,5, t=37°c - Dung dịch L-Tyrosine l,lmM Dung dịch enzyme phân tích: pha lỗng 9000 lần dung dịch đệm acetate lmM Tiến hành: Xây dựng đường chuẩn: thực theo bảng _ Õng nghiêm Thể tích 1-Tyrosine, mL H2O, mL Dung dịch Na2CƠ3 Thuốc thử Folin, mL 0,05 0,1 0,2 1,95 1,9 1,8 5,0 5,0 5,0 1,0 1,0 1,0 u 30 phút 37°c, so màu bước sóng 66( nm 70 Blank 0,4 1,6 5,0 1,0 2,0 5,0 1,0 ... PHƯƠNG PHÁP SIÊU ÂM KẾT HỢP THỦY PHÂN BẰNG ENZYME ALCALASE VÀ KHẢO SÁT TÍNH ỔN ĐỊNH CỦA SẢN PHẨM II NHIỆM VỤ VÀ NỘI DUNG: Tổng quan tài liệu nguyên liệu sụn ức gà, enzyme dùng thủy phân Phân tích... nghiên cứu cụ thể khả tách chiết cs từ sụn ức gà Trước thực trạng đó, việc triển khai đề tài Nghiên cứu thu nhận chondroitin sulfate từ sụn ức gà phương pháp siêu âm kết hợp thủy phân bang enzyme. .. phần sụn ức gà Thiết lập quy trình cơng nghệ thu nhận cs phương pháp siêu âm kết hợp thủy phân bang enzyme Alcalase 2,4L Khảo sát yếu tố trình ảnh hưởng đến hiệu suất thu hồi cs từ sụn ức gà gồm: