Gene Igf2 (Insulin-like growth factor 2) là gene in dấu, chỉ biểu hiện trên allele có nguồn gốc từ cá thể đực (bố). Nó giữ nhiều chức năng quan trọng, cơ chế kiểm soát biểu hiện của gene Igf2 khá phức tạp và được điều khiển trực tiếp bởi các promoter.
Số 31 (56) - Tháng 8/2017 TẠP CHÍ KHOA HỌC ĐẠI HỌC SÀI GÒN Nhân dòng phân tích trình tự promoter gene Igf2 từ thai chuột Cloning and analysing the sequence of Igf2 gene’s promoter from the mouse’s placenta Đỗ Mỹ Hiếu, Trường Đại học Sư phạm Huế Do My Hieu, Hue University of Education TS Phạm Quang Chinh, Trường Đại học Sư phạm Huế Nguyen Thi Thu Hang, Ph.D., Hue University of Education TS Trần Văn Giang, Trường Đại học Sư phạm Huế Tran Van Giang, Ph.D., Hue University of Education Tóm tắt Gene Igf2 (Insulin-like growth factor 2) gene in dấu, biểu allele có nguồn gốc từ cá thể đực (bố) Nó giữ nhiều chức quan trọng, chế kiểm soát biểu gene Igf2 phức tạp điều khiển trực tiếp promoter Hai promoter P2 P3 gene Igf2 tách chiết, khuếch đại, tinh nhân dòng từ mơ thai chuột 17 ngày Trình tự promoter P2 P3 gene Igf2 có chiều dài 420 212 nucleotid Trình tự promoter có độ tương đồng cao với trình tự (U71085.1) (AH001929.2) GenBank Từ khóa: gene in dấu, Igf2, thai, nhân dòng, promoter Abstract Gene Igf2 (Insulin-like growth factor 2) is an imprinted gene which is expressed from only one of the parental chromosomes This gene plays a lot of important functions; the mechanism for controlling its expression is quite complex and is carried out by the promoters The P2 and P3 promoters of Igf2 have been successfully split, amplified, purified and cloned from placental tissues of 17-day-old male mice The P2 and P3 promoters of the Igf2 gene are 420 and 212 nucleotides in length, which are very much similar with GenBank sequences (U71085.1 and AH001929.2 respectively) Keywords: imprinted gene, Igf2, placenta, cloning, promoter có biểu Thế nhưng, số gene biểu có nguồn gốc từ bố mẹ Hiện tượng gọi in dấu hệ gene (Genomic imprinting) Có 100 gene in dấu, điển hình gene Igf2 (Insulin - like growth factor 2) nằm nhiễm sắc thể số chuột số Đặt vấn đề Động vật có vú lồi có nhiễm sắc thể lưỡng bội, đời thừa hưởng nhiễm sắc thể bố mẹ Như vậy, chúng có hai gene Theo quy luật Mendel, thông thường hai từ bố mẹ gene 11 NHÂN DỊNG VÀ PHÂN TÍCH TRÌNH TỰ PROMOTER CỦA GENE IGF2 TỪ NHAU THAI CHU T 11 người [4 5] Ở người, gene in dấu (Imprinting gene) biểu allele có nguồn gốc từ bố, từ thể mẹ truyền cho khơng biểu [3] Gene mã hóa protein hoạt động yếu tố điều hòa sinh trưởng, đặc biệt hoạt động mạnh giai đoạn phơi thai động vật có vú người Gene Igf2 kiểm soát tăng sinh, sinh trưởng biệt hóa tế bào đặc biệt liên quan đến điều hòa phát triển phơi phát triển thai Với chức đó, gene Igf2 biểu sớm q trình phát triển phơi tất loại mơ nội bì, ngoại bì trung bì, thể trưởng thành, gene biểu thấp [1] Gene Igf2 chuột điều khiển promoter khác promoter có trình tự bảo thủ cao gene Igf2 chuột người chúng biểu allele có nguồn gốc từ cá thể đực (bố) truyền cho đời [2] Mức độ biểu gene chủ yếu promoter định, promoter biết liên quan đến biểu gene P0, P1 P2 P3 [7] Các promoter điều khiển biểu exon exon 4, exon exon Trong đó, exon exon mang ba mã hóa amino acid mở đầu Hai promoter P2 P3 biểu phổ biến tất mô nằm gần exon 4, nên liên quan lớn đến chế biểu gene Igf2 Khi nghiên cứu mức độ biểu promoter P2 P3 chuột thấy hai promoter biểu cao hầu hết mô quan nghiên cứu (gan, thận, tim) Còn promoter khác P0 P1 biểu thấp [3] Vì vậy, xác định trình tự promoter thai để từ nghiên cứu xác mức độ biểu gene Igf2 thai chuột thực cần thiết Nguyên liệu phương pháp 2.1 Nguyên liệu hóa chất 2.1.1 Nguyên liệu Các mẫu thai chuột đực 17 ngày tuổi thu nhận phòng thí nghiệm Giải phẫu - Sinh lý thuộc khoa Sinh, trường Đại học Sư phạm Huế, xử lý mẫu với nitơ lỏng bảo quản nhiệt độ -20oC để tiến hành tách chiết ADN (Hình A) Cặp mồi đặc hiệu sử d ng để thực q trình khuếch đại nh n dòng (Bảng 1) Bảng Trình tự cặp mồi đặc hiệu sử dụng nghiên cứu Tên mồi Trình tự Chiều dài P2F 5'-CTATAAGAACCGGGGGTTGG-3' 21N P2R 5'-GGACAGGCGTGGCGGCGCTC-3' 20N P3F 5'-GGGAGTGGTCAGCAGGGAGGGG-3' 22N P3R 5'-CTCCTGGCTCCACAGCCCTG-3' 20N - Chủng vi khuẩn E coli DH5α Viện Công nghệ Sinh học, Đại học Huế cung cấp - Vertor tạo dòng pGEM-T Easy (Promega) (Hình B) 12 ĐỖ MỸ HIẾU - PHẠM QUANG CHINH - TRẦN VĂN GIANG Hình Vị trí lấy mẫu tách chiết ADN (A) Cấu tạo vector pGEM-T Easy (Promega) (B) 2X Sau ủ nhiệt độ 50°C, dịch tế bào chiết với ml phenol/chloroform (1:1) Ly tâm dịch chiết 30 phút 20°C (6000v/1phút) Dịch tủa ml (EtOH) 70% 300 µl NaCl M nhiệt độ -20°C 12 qua đêm Ly t m thu lấy tủa, rửa tủa 500 µl (EtOH) 70% Ly tâm loại bỏ cồn, làm khơ ADN nhiệt độ phòng 2.2.2 Phản ứng PCR Thành phần phản ứng PCR bao gồm: µl ADN; µl đệm 2X PCR master mix (2,4 mM dNTP loại; 0,3 đơn vị Taq ADN polymerase), 0,5 µl mồi xi, 0,5 µl mồi ngược bổ sung nước vơ trùng để đạt thể tích phản ứng 12 µl Phản ứng PCR thực theo chu trình sau: biến tính ADN gene 95oC/5 phút; tiếp đến 30 chu kỳ: 95oC/1 phút, 48oC/30 giây, 72oC/1 phút; cuối 72oC/10 phút [8] 2.2.3 Điện di agarose gel Chuẩn bị agaro gel 0,8%, sau gel đông, tra mẫu vào giếng, chạy với điện trường 100 V 30 phút Sau kết thúc điện di, nhuộm gel với ethidium bromide (EtBr) có nồng độ 0,5 g/ml 15 phút, rửa lại nước cất cho vào hệ thống máy đọc gel Ch p ảnh phân tích kết 2.2.4 Gắn sản phẩm PCR vào vector Sản phẩm PCR gắn vector pGEM®-T Easy (Promega), thành phần 2.1.2 Hóa chất thiết bị Các hóa chất sử d ng nghiên cứu: Các môi trường LB lỏng, LB đặc Các dung dịch: phá tế bào (10mM Tris, 100mM EDTA, 2% SDS, pH 8,0), dung dịch tủa protein (Ammonium acetate 7,5 M), PCI (Phenol - Chloroform Isoamylchloroform: 25:24:1), đệm TE (10Mm Tris-HCl; 1mM EDTA; pH 8,0), cồn rửa (70% EtOH) Tris, EDTA, SDS, ammonium acetate, protein K, agarose, chloroform, ethanol, loading dye (5X), ampicillin,… Các thiết bị sử d ng nghiên cứu như: Máy PCR (Mỹ), máy ly tâm lạnh (Đức), máy vortex (Đức), hệ thống đọc UV trực tiếp (Mỹ), hệ thống điện di (Mỹ) Máy pH tự động (Th y Sỹ), nồi khử trùng (Nhật Bản), tủ lạnh (Nhật Bản), tủ lắc (Đức), tủ cấy (Nhật bản), tủ ấm (Nhật bản), cân phân tích (Đức) 2.2 Phương pháp nghiên cứu Các phương pháp sinh học phân tử tham khảo theo Sambrook Ruesel (2001) [9] có cải tiến Các thí nghiệm thực từ 10/2015 - 5/2017 phòng thí nghiệm trọng điểm Di truyền - Vi sinh thuộc khoa Sinh trường Đại học Sư phạm Huế 2.2.1 Tách chiết ADN tổng số ml dịch mô tế bào giải đông nhiệt độ phòng Thêm 40 µl proteinase (20µg/ml) hòa tan đệm pK 13 NHÂN DỊNG VÀ PHÂN TÍCH TRÌNH TỰ PROMOTER CỦA GENE IGF2 TỪ NHAU THAI CHU T phản ứng gắn bao gồm: µl vector, µl đệm 2X (2X Rapid Ligation Buffer), µl T4 ADN ligase, µl sản phẩm, sau bổ sung nước vơ trùng để đạt thể tích cuối 10 µl, phản ứng ủ 4oC qua đêm 2.2.5 Biến nạp sản phẩm gắn dính vào tế bào khả biến E coli Vector mang sản phẩm PCR biến nạp vào tế bào khả biến E coli DH5α phương pháp shock nhiệt Hỗn hợp biến nạp bao gồm: 10 µl dung dịch gắn chứa vector mang sản phẩm PCR, 200 µl dung dịch tế bào khả biến DH5α Hỗn hợp trộn nhẹ nhàng, ủ 30 phút tủ đá, sốc nhiệt 42oC 45 giây, chuyển sang khay đá, ủ phút Sau hỗn hợp ni mơi trường LB lỏng (800 µl) (khơng có kháng sinh), ủ 37oC, lắc 200 vòng/phút Lấy 200 µl dung dịch biến nạp trải môi trường LB đặc có bổ sung 50 µg/ml ampicillin, 30 µl X - Gal 40 µg/ml, 30 µl IPTG 100 mM 2.2.6 Tách chiết tinh plasmid tái tổ hợp Lấy ml dịch nuôi cấy plasmid tái tổ hợp đưa vào ống Eppendorf 1,5 ml, ly t m 6000 vòng/phút phút để thu tế bào Sau ly tâm bỏ dịch phía trên, giữ cặn tế bào bên Thêm 600 µl nước cất vào để hòa tan cặn, dùng pipet hút nhẹ lên xuống vài lần cho Thêm 100 µl dung dịch phá tế bào vào hỗn dịch để phá màng tế bào, đảo nhẹ nhàng, ủ nhiệt độ phòng phút Thêm 350 µl dung dịch rửa (nhiệt độ - 8oC), trộn nhẹ nhàng, sau ly t m 10 phút, nhiệt độ 4oC Lấy dịch bên đưa lên màng cột lọc Ly tâm phút, bỏ dịch Bổ sung 200 µl dung dịch rửa lên màng lọc, sau ly t m, bỏ dịch bên Rửa với 400 µl dịch rửa, ly tâm tiếp phút Làm khô cột ly tâm phút Cuối cùng, chuyển cột lọc sang ống Eppendorf mới, thêm 50 µl dung dịch thơi rửa lên màng lọc, để nhiệt độ phòng phút Ly tâm 30 giây, bỏ cột lọc thu dịch chứa ADN plasmid tinh Tồn q trình thực với tốc độ ly tâm 12000 vòng/phút 2.2.7 Giải trình tự ADN Giải trình tự ADN theo nguyên lý phương pháp Sanger dựa dideoxyl ADN polymerase xúc tác gắn deoxynucleotide vào đầu 3’-OH mạch đơn ADN tổng hợp, gặp deoxynucleotide khơng có nhóm 3’-OH phản ứng tổng hợp bị ngừng lại Kết hỗn hợp sản phẩm sau phản ứng bao gồm polynucleotide có kích thước nucleotide phát đầu dò huỳnh quang máy đọc chương trình tự động ABI PRISM 3100 Avant Gentic Analyzer Các phản ứng tổng hợp bị dừng cách bổ sung formamite ngăn không cho sợi ADN bắt cặp với nhau, phân tử ADN tổng hợp điện di gel polyacrylamite để tách Dịch chiết plasmid tinh gửi đến công ty Biomedic để giải trình tự thơng qua Viện cơng nghệ Sinh học – Đại học Huế 2.2.8 Phân tích trình tự promoter Các trình peomoter gene IGF2 thai chuột 17 ngày phân tích chương trình BLAST Các trình tự chỉnh sửa xếp phần mềm BioEdit 7.0 Kết nghiên cứu thảo luận 3.1 Tách chiết khuếch đại ADN tổng số Mẫu thai chuột sử d ng để tách chiết ADN tổng số ADN tổng số sau tách chiết điện di gel agarose 0,8 % (Hình A) 14 ĐỖ MỸ HIẾU - PHẠM QUANG CHINH - TRẦN VĂN GIANG Hình Điện di đồ ADN tổng số (A) Khuếch đại promoter P3, M: ADN marker kb, 1: sản phẩm PCR (B) Khuếch đại promoter P2, M: ADN marker kb, 2: sản phẩm PCR (C) Kết điện di cho thấy ADN tổng số tách chiết từ thai chuột tập trung thành băng đậm, tương đối sạch, bị đứt gãy, đảm bảo chất lượng cho nghiên cứu Từ ADN tổng số, promoter P2 P3 gene Igf2 nhân lên phản ứng PCR với cặp mồi đặc hiệu Sản phẩm PCR tập trung băng rõ nét, với kích thước khoảng 200 bp promoter P3 (Hình B) khoảng 400 bp promoter P2 (Hình C) Kích thước ph n đoạn nh n lên tương đương với kích thước P2 P3 tính tốn l thuyết trắng chọn khuẩn lạc trắng khuẩn lạc mang gene tái tổ hợp tiếp t c nuôi mơi trường LB lỏng có bổ sung ampicillin Dịch nuôi qua đêm sử d ng để tách chiết plasmid kiểm tra có mặt plamid tái tổ hợp mang promoter 3.2 Nhân dòng promoter P2 P3 3.2.1 Gắn sản phẩm PCR vào vector biến nạp vào tế bào khả biến Sản phẩm PCR gắn vào vector pGEM - T Easy, sau biến nạp vào tế bào tế bào khả biến Dung dịch biến nạp trải lên đĩa chứa mơi trường chọn lọc (LB + agar + 50 µg/ml ampicillin + X-Gal 40 µg/ml + IPTG 100 mM) Ni qua đêm nhiệt độ 37oC, khuẩn lạc xuất đĩa thạch (Hình 3) Các khuẩn lạc Hình Khuẩn lạc mọc đĩa thạch 3.2.2 Tách chiết kiểm tra plasmid tái tổ hợp Các khuẩn lạc trắng ni mơi trường LB lỏng có chứa 50 µg/ml ampicillin để tiến hành tách plasmid Plasmid sau tách chiết điện di kiểm tra với khuẩn lạc có vertor khơng mang gene chèn làm đối chứng âm (Hình 4) 15 NHÂN DỊNG VÀ PHÂN TÍCH TRÌNH TỰ PROMOTER CỦA GENE IGF2 TỪ NHAU THAI CHU T Hình Kiểm tra plasmid tái tổ hợp, (ĐC) plasmid đối chứng, (1, 2, 3, 4, 5) plasmid tách chiết (A) PCR kiểm tra plasmid (B) PCR kiểm tra plasmid (C), M: marker Ba plasmid (1, 2, 3) tách chiết từ khuẩn lạc mang sản phẩm biến nạp PCR P2, có plasmid có chênh so với đối chứng, nghĩa có khả mang tái tổ hợp, nên kích thước lớn di chuyển chậm hơn, plasmid tiếp t c PCR với mồi đặc hiệu để kiểm tra độ xác, sản phẩm điện di đồ cho thấy, kích thước với sản phẩm PCR P2 từ ADN tổng số tính tốn lý thuyết (Hình A C) Ba plasmid (4, 5, 6) tách chiết từ khuẩn lạc mang sản phẩm biến nạp từ PCR P3, có plasmid có chênh so với đối chứng, nghĩa có khả mang tái tổ hợp, nên kích thước lớn di chuyển chậm hơn, plasmid tiếp t c PCR với mồi đặc hiệu để kiểm tra độ xác, sản phẩm điện di đồ cho thấy, kích thước với sản phẩm PCR P3 từ ADN tổng số tính tốn l thuyết (Hình A &B) 3.3 Giải trình tự so sánh với trình tự GenBank Mẫu plasmid tái tổ hợp mang promoter P2 P3 chuột Mus musculus sau tinh gửi giải trình tự Kết giải trình tự promoter P2 có 420 nucleotide, 44 đảo CpG (Hình 5) kết giải trình tự promoter P3 có 212 nucleotide, có đảo CpG (Hình 5) Q trình methyl hóa ADN chủ yếu xảy vị trí phân tử carbon C5 cytosine nằm đảo CpG, thành dạng 5methylcytosine Sự thay khơng làm thay đổi trình tự ADN liên quan lớn đến chế biểu gene [6] Với có mặt nhiều đảo CpG trình tự P2 promoter dễ bị methyl hóa ảnh hưởng lớn đến q trình biểu gene Igf2 so với promoter P3 Quá trình methyl hóa ADN thường xảy vị trí dinucleotide CpG, gọi đảo CpG, thường diễn số vùng định vùng promoter vùng exon Ở nhiều bệnh, ung thư, đảo CpG promoter gene có methyl hóa mức bất thường, gây bất hoạt q trình phiên mã di truyền cho tế bào phân bào [9] 16 ĐỖ MỸ HIẾU - PHẠM QUANG CHINH - TRẦN VĂN GIANG Hình Trình tự promoter P2 P3 Sau khuếch đại giải trình tự promoter P2 P3, kích thước vị trí đoạn khuyếch đại so sánh với promoter khác gene Igf2 (Hình 6) Trong tương quan promoter P2 có kích thước lớn với vị trí TSS, tiếp đến P1 [10] kích thước nhỏ P0 P3 Cả promoter khơng có hộp TATA promoter điển hình số lồi sinh vật nhân chuẩn khác Hình Vị trí kích thước P2, P3 tương quan với promoter khác 17 NHÂN DỊNG VÀ PHÂN TÍCH TRÌNH TỰ PROMOTER CỦA GENE IGF2 TỪ NHAU THAI CHU T độ tương đồng promoter P3 với trình tự (AH001929.2) 100% (Hình B) Điều chứng tỏ promoter P3 khơng có đa hình di truyền, promoter P2 có hai điểm SNP, nhìn chung hai promoter có tính bảo thủ cao Đồng thời, q trình thực nghiên cứu khơng xảy sai sót Trình tự promoter sau phân tích, tiến hành so sánh với trình tự (U71085.1) (AH001929.2) GenBank phần mềm BLAST Kết cho thấy promoter P2 so với trình tự (U71085.1) có mức độ tương đồng promoter 99%, có hai nucleotide sai khác (Hình A) Còn mức A B Hình So sánh P2 P3 với trình tự GenBank 18 ĐỖ MỸ HIẾU - PHẠM QUANG CHINH - TRẦN VĂN GIANG 2583 - 2592 Kết luận ADN tổng số tách chiết từ mô thai chuột Mus musculus 17 ngày có nồng độ cao, sạch, bị đứt gãy tập trung thành băng rõ nét Đã giải trình tự phân tích trình tự promoter P2 có 44 đảo CpG có 420 nucleotide, giải trình tự promoter P3 có đảo CpG có 212 nucleotide Trong tương quan promoter P2 có kích thước lớn với vị trí TSS, P3 ngắn TSS Cả promoter khơng có hợp TATA promoter số lồi sinh vật nhân chuẩn khác Trình tự promoter P2 có độ tương đồng 99% so với trình tự GenBank (U71085.1), promoter P3 có độ tương đồng 100% so với trình tự GenBank (AH001929.2) Elly, H (2003) The many levels of control of Igf2 expression, Nature, 5, 91 - 102 Firth, M., Ganeshprasad, U., Baxter, R C (1998) Structural determinants of ligand and cell surface binding of insulin-like growth factor-binding protein-3, J Biol Chem, 273(5): 2631 - 2638 Kim, M., S., Lee, J., Sidransky, D (2010) ADN methylation markers in colorectal cancer, Cancer Metastasis Review, 29 181 - 206 Monk, D., Sanches, R., Arnaud, P., Apostolidou, S., Hills, F., Abu-Amero, S., Murrell, A., Friess, H., Reik, W., Stanier, P., Constância, M., Moore, G E (2006) Imprinting of IGF2 P0 Transcript and Novel Alternatively Spliced INS-IGF2 Isoforms Show Differences between Mouse and Human.” Human molecular genetics, 15(8): 1259 – 1269 TÀI LIỆU THAM KHẢO Rand, K., Clark, S J., Molloy, P (2002) Conversion-specific detection of DNA methylation using real-time polymerase chain reaction (ConLight-MSP) to avoid false positives Methods: 27 (2): 114 - 120 Christiansen, J., Kofod, M., Nielsen, F., C (1994) A Guanosine Quadruplex and Two Stable Hairpins Flank a Major Cleavage Site in Insulin-like Growth Factor II mRNA Nucleic acids research, 22(25): 5709 – 5716 Sambrook, J and Russel, D W (2001) Molecular cloning: A laboratory manual, cold spring harbor labortory press Constância, Hemberger, M., Hughes, J., Dean, W., Smith, F., Fundele, R,, Stewart, F., Kelsey, G., Fowden, A., Sibley, C., Reik, W (2002) Placental - Specific IGF - II is a Major Modulator of Placental and Fetal growth, Nature, 417(6892): 945 - 948 10 Tran, V G., Court, F., Duputié, A., Antoine, E., Aptel, N., Milligan, L., Carbonell, F., Lelay-Taha, M., Piette, J., Weber, M., Montarras, D., Pinset, C., Dandolo, L., Forné, T., Cathala, G (2012) H19 Antisense RNA Can up-Regulate Igf2 Transcription by Activation of a Novel Promoter in Mouse Myoblasts PloS one, 7(5): e37923 Butler, J E., Kadonaga, J T (2002) Regulation of gene expression the RNA polymerase II core promotor: A Key component in the regulation of gene expression, Gene and development, 16 Ngày nhận bài: 30/6/2017 Biên tập xong: 15/8/2017 19 Duyệt đăng: 20/8/2017 ...NHÂN DỊNG VÀ PHÂN TÍCH TRÌNH TỰ PROMOTER CỦA GENE IGF2 TỪ NHAU THAI CHU T 11 người [4 5] Ở người, gene in dấu (Imprinting gene) biểu allele có nguồn gốc từ bố, từ thể mẹ truyền... để giải trình tự thơng qua Viện cơng nghệ Sinh học – Đại học Huế 2.2.8 Phân tích trình tự promoter Các trình peomoter gene IGF2 thai chuột 17 ngày phân tích chương trình BLAST Các trình tự chỉnh... kiểm tra với khuẩn lạc có vertor khơng mang gene chèn làm đối chứng âm (Hình 4) 15 NHÂN DỊNG VÀ PHÂN TÍCH TRÌNH TỰ PROMOTER CỦA GENE IGF2 TỪ NHAU THAI CHU T Hình Kiểm tra plasmid tái tổ hợp,