nhân dòng gen và vùng promoter ubiquitin từ cây ngô (Ubiquitin là một protein trong tế bào nhân thực và trình tự của nó có tính bảo thủ cao, ubiquitin tham gia vào nhiều quá trình của tế bào như: cân bằng giữa tổng hợp và thoái biến protein, cấu trúc chromatin, điều hành chu kỳ tế bào, sửa chữa DNA và phản ứng với sốc nhiệt và các stress khác. Gen mã hóa cho protein này (gen Ubiquitin) và promoter Ubiquitin đã được nhân dòng và nghiên cứu đánh giá khả năng hoạt động từ nhiều đối tượng như lúa, ngô, lay ơn. Promoter Ubiquitin có vai trò quan trọng trong thể hiện gen ở cây một lá mầm. Trong bài báo này, chúng tôi giới thiệu các kết quả về nhân dòng gen mã hóa cho protein Ubiquitin (gen Ubi) và promoter Ubiqitin từ dòng ngô H240 phục vụ cho nghiên cứu về công nghệ gen ở cây ngô.
TẠP CHÍ SINH HỌC 2013, 35(3se): 114-121 NHÂN DỊNG GEN VÀ VÙNG PROMOTER UBIQUITIN TỪ CÂY NGÔ (ZEA MAYS L.) Nguyễn Đức Thành*, Lê Hồng Đức Viện Cơng nghệ sinh học, Viện Hàn lâm KH & CN Việt Nam, *nguyenducthanh_pcg@ibt.ac.vn TÓM TẮT: Ubiquitin protein tế bào nhân thực trình tự có tính bảo thủ cao, ubiquitin tham gia vào nhiều trình tế bào như: cân tổng hợp thoái biến protein, cấu trúc chromatin, điều hành chu kỳ tế bào, sửa chữa DNA phản ứng với sốc nhiệt stress khác Gen mã hóa cho protein (gen Ubiquitin) promoter Ubiquitin nhân dòng nghiên cứu đánh giá khả hoạt động từ nhiều đối tượng lúa, ngơ, lay ơn Promoter Ubiquitin có vai trò quan trọng thể gen mầm Trong báo này, giới thiệu kết nhân dòng gen mã hóa cho protein Ubiquitin (gen Ubi) promoter Ubiqitin từ dòng ngơ H240 phục vụ cho nghiên cứu công nghệ gen ngô Các kết nhận cho thấy vùng như: vùng promoter, vùng phiên mã hộp TATA gen Ubi nhân dòng từ dòng ngơ H240 có độ tương đồng cao so với chuỗi gen tương đồng loài gemone thực vật Gen Ubi đăng ký Ngân hàng Gen quốc tế với mã số JX947345.1 Kết nhận nghiên cứu góp phần đáng kể việc nghiên cứu sử dụng promoter Ubiquitin chuyển gen mầm nói chung ngơ nói riêng Từ khóa: Cây ngơ, gen Ubiquitin, hộp TATA, mức độ tương đồng, promoter, vùng phiên mã MỞ ĐẦU Ubiquitin protein tế bào nhân thực trình tự có tính bảo thủ cao, ubiquitin tham gia vào nhiều trình tế bào như: cân tổng hợp thoái biến protein, cấu trúc chromatin, điều hành chu kỳ tế bào, sửa chữa DNA phản ứng với sốc nhiệt stress khác Promoter vùng trình tự nucleotide genome nằm ngược dòng phía đầu 5’ vị trí khởi đầu phiên mã gen (transcription start site-TSS) Promoter thành phần quan trọng cấu trúc tất gen, khởi đầu cho phiên mã, đóng vai trò then chốt việc biểu gen Theo khả biểu hiện, promoter chia làm hai loại chính: promoter khơng đặc hiệu hay gọi promoter định promoter đặc hiệu bao gồm promoter đặc hiệu mô tế bào, đặc hiệu giai đoạn phát triển promoter cảm ứng Hiện nay, có nhiều promoter hiệu sử dụng rộng rãi để điều khiển biểu gen ngoại lai trồng biến đổi gen CaMV35S, CaMV19S, nopaline synthase (NOS) (promoter hai mầm), hay Actin Ubiquitin (promoter mầm) Promoter Ubiquitin phân lập nghiên cứu đánh giá khả hoạt động từ 114 nhiều đối tượng lúa, ngô, lay ơn [1, 3, 6] Các nghiên cứu cho thấy khả hoạt động promoter cao gấp mười lần hoạt động promoter CaMV35S điều khiển biểu gen ngoại lai mầm Hoạt tính promoter Ubiquitin lúa chuyển gen phương pháp chuyển qua tế bào trần mô sẹo thông qua đánh giá mức độ biểu gen thị chọn lọc cho thấy promoter biểu mạnh tất mô tất giai đoạn phát triển lúa [2] Nhìn chung, promoter Ubiquitin có hoạt tính mạnh mơ non có hoạt động trao đổi chất mạnh hạt phấn hoa [9] Trong báo này, giới thiệu kết nhân dòng gen mã hóa cho protein Ubiquitin (gen Ubi) promoter Ubiquitin từ dòng ngơ H240 phục vụ cho nghiên cứu công nghệ gen ngô VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Vật liệu Vật liệu nghiên cứu sử dụng mẫu dòng ngơ H240 Viện Nghiên cứu ngơ cung cấp Vector tách dòng pBT Phòng Nguyen Duc Thanh, Le Hoang Duc Công nghệ tế bào thực vật, Viện Công nghệ Sinh học cung cấp Phương pháp Thiết kế cặp mồi nhân gen Ubiquitin (Ubi) promoter: thông tin trình tự gen promoter Ubiquitin khai thác ngân hàng gen quốc tế thông qua trang Web NCBI Dựa thông tin gen polyUbiquitin1 (Ubi1) ngân hàng gen có mã số DQ141598.1 sử dụng phần mềm Primer [10] để thiết kế cặp mồi đặc hiệu cho nhân gen Ubi Xác định vị trí cắt enzyme giới hạn, vị trí bám mồi xác định thông số kỹ thuật mồi, như: nhiệt độ nóng chảy (Tm), tỷ lệ GC, chiều dài mồi phần mềm NEBcutter V2.0 (New England Biolab INC) Tách chiết DNA genome: DNA genome tách từ mẫu ngô theo phương pháp CTAB Saghai Maroof et al (1994) [12] Nhân gen Ubi promoter: Gen Ubi promoter Ubiquitin nhân từ DNA genome tách từ ngô phản ứng PCR với cặp mồi đặc hiệu thiết kế Thành phần phản ứng bao gồm: đệm 10 x PCR: 2,5 µl; MgCl2 (25 mM): 1,5 µl; dNTP (1 mM): µl; mồi xi (50 ng/µl): µl; mồi ngược (50 ng/µl): µl, ; Taq DNA polymerase (5 U/µl): µl ; DNA (50 ng/ µl): µl nước cất vơ trùng: 12 µl Phản ứng PCR thực máy nhiệt PTC-100 (MJ Research, Inc) với 35 chu kỳ: 94oC: phút; 58oC: phút, 72oC: phút; kết thúc phản ứng 72oC phút Sản phẩm PCR kiểm tra điện di gel agarose 1% Nhân dòng gen Ubi, propotor Ubiquitin đọc trình tự: phân đoạn DNA nhân sau phản ứng PCR có kích thước tương ứng với kích thước lý thuyết Ubi1 tinh kit AccuPrep® Gel Purification (Bioneer) theo hướng dẫn nhà sản xuất Sau tinh phân đoạn gắn vào vector nhân dòng pBT để tạo vector tái tổ hợp Các trình tạo vector tái tổ hợp thực theo mô tả Sambrook et al (1989) [11] Vector tái tổ hợp chứa gen Ubi sau biến nạp vào chủng vi khuẩn E coli chủng DH5α phương pháp sốc nhiệt Kết biến nạp vào E coli vector tái tổ hợp có gắn gen Ubi với vector pBT kiểm tra phản ứng colony PCR sử dụng cặp mồi đặc hiệu nhân Ubi Đồng thời, khuẩn lạc làm khuôn cho phản ứng colony-PCR nuôi lắc qua đêm 37oC ml môi trường LB lỏng bổ sung 100 µg/ml kháng sinh Ampicillin 50 µg/ml kháng sinh Kanamycin để tách plasmid Tách DNA plasmid kiểm tra có mặt gen Ubi cắt enzyme giới hạn BamHI tiến hành theo Sambrook et al (1989) [11] Trình tự nucleotide gen Ubi xác định máy giải trình tự ABI PRISM® 3100 Avant Genetic Analyzer, sử dụng kit BigDye® Terminator V3.1 Cycle Sequencing Phòng Thí nghiệm Trọng điểm công nghệ gen, Viện Công nghệ sinh học Thành phần phản ứng PCR đọc trình tự gồm mồi, DNA plasmid tinh sạch, BigDye, đệm tương ứng tổng thể tích 15 µl Chu trình nhiệt máy ln nhiệt GenAmp® PCR System 9700 gồm 25 chu kỳ: 96oC: phút, 96oC: 10 giây, 50oC: giây, 60oC: phút Sau đó, sản phẩm PCR tinh điện di ống vi mao quản để đọc trình tự Trình tự nucleotide nhận gen Ubi so sánh với trình tự Ubi1 (DQ141598.1) số trình tự cơng bố Ngân hàng Gen quốc tế phần công cụ BLAST NCBI Phân tích promoter: xác định vùng promoter, vùng phiên mã gen Ubi nhận phần mềm TSSP/ Prediction of PLANT Promoters, Softberry, Inc So sánh vị trí promotor, vùng phiên mã gen Ubi từ dòng ngơ H240 gen Ubi1 công bố (DQ141598.1) với liệu chuỗi gen tương đồng loài gemone thực vật chương trình PromH(W) (Promoter prediction using orthologous sequences (http://linux1.softberry.com/berry.phtml); xác định vùng kết thúc phiên mã chương trình ARNold-Program Finding terminator (Gautheret and Lambert, 2001) [4] KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN Kết thiết kế mồi đặc hiệu Dựa trình tự gen Ubi1 Ngân hàng Gen NCBI với mã số DQ141598.1, phần 115 TẠP CHÍ SINH HỌC 2013, 35(3se): 114-121 mềm Primer [10], trình tự cặp mồi đặc hiệu cho nhân gen Ubi thiết kế Mồi xi UbiF có trình tự 5’TAGTGCAGCGTGACCCG - 3’ mồi ngược UbiR có trình tự 5’-TATGCAGAAGTAACA CCAAACAA-3’ Để thuận tiện cho việc nhân dòng vector pBT mồi xi mồi ngược gắn thêm trình tự điểm cắt tương ứng enzyme giới hạn BamHI (GGATCC) PstI (CTGCAG) Kết mồi xuôi (UbiF2) mồi ngược (UbiR2) để nhân gen Ubi có trình tự tương ứng là: UbiF2: 5’-TACTGC AGGTGCAGCGT GACCCG-3’ 5’-TAGG ATCCTGCAGAAGTAACACCAAACAA-3’ (bảng 1) Mồi xi có chiều dài 23 nucletide nhiệt độ nóng chảy (Tm) 65,8 oC tỷ lệ GC 65.2%, mồi ngược có chiều dài 29 nucletide nhiệt độ nóng chảy (Tm) 59,6 oC tỷ lệ GC 41,3% Cặp mồi nhân chuỗi nucleotide có chiều dài theo lý thuyết khoảng kb tương đương với chiều dài gen Ubiquitin Bảng Trình tự mồi dùng cho nhân promoter Ubiquitin Tên UbiF2 UbiR2 Trình tự mồi thiết kế nhân gen Ubiquitin 5’ - TACTGCAGGTGCAGCGTGACCCG - 3’ 5’- TAGGATCCTGCAGAAGTAACACCAAA CAA-3’ Kết nhân gen Ubi promoter Ubiquitin Với cặp mồi đặc hiệu thiết kế, gen Ubi promoter Ubiquitin nhân từ DNA genome dòng ngơ H240 (hình 1) Kết điện di hình cho thấy, sản phẩm PCR có băng có kích thước khoảng kb, tương đương với kích thước gen Ubiquitin promoter theo lý thuyết Hình Kết điện di sản phẩm PCR nhân gen Ubi M DNA marker kb (Biolabs); Đối chứng âm (phản ứng PCR khơng có DNA H240); sản phẩm PCR nhân gen Ubiquitin từ DNA genome dòng ngơ H240 với cặp mồi UbiF2 UbiR2 thiết kế 116 Tm (oC) 65,8 59,6 Tỷ lệ GC (%) 65,2 41,3 Chiều dài 23 29 Kết nhân dòng gen Ubi promoter Sau nhân bản, băng có kích thước tương tự độ dài gen Ubiquitin tinh gắn vào plasmid pBT biến nạp vào chủng E coli DH5α Kết điện di sản phẩm PCR khuẩn lạc với cặp mồi đặc hiệu UbiF2 UbiR2 trình bầy hình Hình Kết điện di sản phẩm PCR nhân gen Ubi từ plasmid khuẩn lạc 2, 4; M DNA marker kb (Biolabs); Đối chứng âm (phản ứng PCR khơng có khuẩn lạc); 2, 3, tương ứng với plasmid từ dòng khuẩn lạc 2, Nguyen Duc Thanh, Le Hoang Duc Hình Kết cắt kiểm tra phân đoạn gen Ubi từ dòng ngơ H240 plasmid pBT M: DNA marker kb (Biolabs); , 3, 4: tương ứng với plasmid từ dòng khuẩn lạc 2, 3, cắt enzyme BamHI Như phân đoạn gen Ubi gắn vào plasmid pBT nhân dòng E coli DH5α Kết khẳng định kết cắt plasmid pBT có chứa phân đoạn gen Ubi enzyme BamHI Sau cắt enzyme phân lập đoạn cắt gel agorose 1%, ảnh điện di nhìn rõ hai băng : băng kb tương ứng với độ dài plasmid pBT băng kb tương ứng với độ dài gen Ubi (hình 3) Kết so sánh trình tự phân tích promoter Ubiquitin Kết so sánh trình tự phân đoạn đoạn gen Ubi mang promoter Ubiquitin từ dòng ngơ H240 với trình tự gen Ngân hàng Gen NCBI trình tự Ubi1 có mã số DQ141598.1 (Zea mays cultivar Nongda 105 polyUbiquitin-1 (Ubi-1) gene, promoter region and 5' UTR) trình bày bảng Bảng Kết so sánh mức độ tương đồng trình tự gen Ubi mang promoter Ubiquitin tách từ dòng ngơ H240 gen Ubi1 với vùng promoter công bố với mã số DQ141598.1 Mã số Ngân hàng gen DQ141598.1 Tên gen Gen polyUbiquitin-1 (Ubi-1) từ dòng ngơ Nongda 105 Zea mays, vùng promoter không phiên mã đầu 5' Mức độ so sánh 99% Giá trị E 0,0 Mức độ tương đồng 94% Bảng Kết so sánh trình tự gen Ubi mang promoter Ubiquitin từ dòng ngơ H240 với số trình tự Ngân hàng Gen quốc tế khác Mã số Tên gen, vector AB201314.1 Cloning vector pSB4U DNA, complete sequence Cre-lox Univector acceptor vector pCR701 complete sequence Reporter vector pUbiGUSPlus; pUbiSXR, complete sequence polyUbiquitin [maize, Genomic, 3841 nt] Zea mays clone MubG1 Ubiquitin gene, complete cds Zea diploperennis polyUbiquitin-1 (Ubi-1) gene, promoter region and 5' UTR FJ750577.1 AY452753.1 S94464.1 U29159.1 AY342393.1 Mức độ so sánh 99% Giá trị E 0.0 99% 0.0 99% 0.0 99% 0.0 99% 0.0 98% 0.0 Mức độ tương Tác giả đồng 93% Kuraya et al (2004) [7] 93% Jia et al (2009) [5] 93% Vickers et al (2003) [15] 93% Christensen et al (1992) [1] 93% Liu et al (1995) [8] 94% Streatfield et al (2003) [13] 117 TẠP CHÍ SINH HỌC 2013, 35(3se): 114-121 Kết bảng cho thấy, mức độ nucleotide tương đồng gen Ubi tách từ dòng ngơ H240 nhân dòng với trình tự gen polyUbiquitin-1 (Ubi-1) từ dòng ngơ Nongda 105 Zea mays, vùng promoter vùng không phiên mã đầu 5' (DQ141598.1) 94% Ngồi ra, chúng tơi tiến hành so sánh với trình tự nucleotide khác Ngân hàng Gen quốc tế thu kết thể bảng Qua bảng thấy, trình tự gen Ubi nhân dòng có độ tương đồng cao với trình tự số gen vector mang promoter Ubiquitin cơng bố, đặc biệt trình tự gen Ubiquitin dòng ngơ chuyển gen Như vậy, khẳng định gen Ubi nhân dòng có độ tin cậy cao Gen Ubi từ dòng ngơ H240 đăng ký Ngân hang Gen quốc tế NCBI với mã số JX947345.1 (Zea mays ubiquitin (Ubi) gene, promoter region) >gi_410109644_gb_JX947345.1_ Zea mays ubiquitin _Ubi_ gene, promoter region TACTGCAGGTGCAGCGTGACCCGGTCGTGCCCCTCTCTAGAGCTCTAGAGTAGAGCATTG CATGTCTAAGTTATAAAAAATTACCACATATTTTTTTTGTACACTTGTGTTTGAAGTGCA GTTTATCTATCTCTATACATATATTTAAACTTCACTATATGAATAATATAGTCTATAGTA TTAAAATAATATCAATGTTTTAGATGATTATATAACTGAGCTGCTAGACATGGTCTAAAG GACAACCGAGTATTTTGACAACATGACTCTACAGTTTTATCTTTTTAGTGTGCGTGTGTT CTTTTTACTTTTGCAAATAGCTTCACCTATATAATACTTCATCCATTTTATTAGTACATC CATTTACTAAATTTTTAGTACATCTATTTTATTCTATTTTAGCCTCTAAATTAAGAAAAC TTAAACTCTATTTTAGTTTTTTATTTAATAATTTAGATATAAAATAGAATAAAATAAAGT GACTAAAAAATAACTAAATACCTTTTTAAGAAATAAAAAAACTAAGGAACCATTTTTCTT GTTCCGAGTAGATAATGACAGCCTGTTCAACGCCGTCGACGAGTCTAACCGGAACACCCC ATCAGCGAACCCAGGCAGCGTCGCGTCCGGTTCAAGCGAAGCAGAACGCCACGGGCATCT TCTGTAGCTGCCCTTTCTGGACCCCCTCTCTCCGAGAGAAGGTTTCCGCTCCCACCGTTG GACTTGCTCCCGCTGTTCGGCATCCCAGAAAATTGCGTGGGCGGGAGCGGCAGACGTGAG CCGGCACGGGCAGGCGGCCTTCCTTCTCACGGCACCGGCAGCTACGGGGGATTCCCTTTC CCACCGCTCCTTTCGCTTTTCCTTCCTCGCCCGCCGTAATAAATAGACACCCCCCCTCCC 60 120 180 240 300 360 420 480 540 600 660 720 780 840 900 Hộp TATA ACACCCTCTTTCCCCCAACCTCGTGTTGTTCGGAGCGCACACACACACAACCAGATCTCC CCCCAAACCCACCCGTCGGCACCTCCCGCTTCAAGGTACGCCGCTCGTCCTCCCCCCCCC CCCCTCTCTCTACCTTCTCTAGATCGGCGTTCCGGTCCATGGTTAGGGCCCCGGTAGTTC TACTTCTGTTCATGTTTGTGTTAGATCCGTGTTTGTGTTAGATCCGTGCTGCTAGCGTTC GTACACGGATGCGACCTGTACGTCAGACACGTTCTGATTGCTAACTTGCCAGTGTTTCTC TTTGGGGAATCCTGGGATGGCTCTAGCCGTTCCGCAGACGGGATCGATTTCATGATTTTT TTTGTTTCGTTGCATAGGGTTTGGTTTGCCCTTTTCCTTTATTTCAATATATGCCGTGCA 960 1020 1080 1140 1200 1260 1320 Chuỗi kết thúc CTTGTTTGTCGGGTCATCTTTTCATGCTTTTTTTTGTCTTGGTTGTGATGATGTGGTCTG GTTGGGCGGTCGTTCTAGATCGGAGTAGAATTCTGTTTCAAACTACCTGGTGGATTTATT AATTTTGGATCTGTATGTGTGTGCCATACATATTCATAGTTACGAATTGAAGATGATGGA TGGAAATATCGATCTAGGATAGGTATACATGTTGATGCGGGTTTTACTGGTGCATATACA GAGATGCTTTTTGTTCGCTTGGTTGTGATGATGTGGTGTGGTTGGGCGGTCGTTCATTCG TTCTAGATCGGAGTAGAATACTGTTTCAAACTACCTGGTGTATTTATTAATTTTGGAACT GTATGTGTGTGTCATACATCTTCATAGTTACGAGTTTAAGATGGATGGAAATATCGATCT AGGATAGGTATACATGTTGATGTGGGTTTTACTGATGCATATACATGATGGCATATGCAG CATCTATTCATATGCTCTAACCTTGAGTACCTATCTATTATAATAAACAAGTATGTTTTA TAATTATTTTGATCTTGATATACTTGGATGATGGCATATGCAGCAGCTATATGTGGATTT TTTTAGCCCTGCCTTCATACGCTATTTATTTGCTTGGTACTGTTTCTTTGTCCGATGCTC ATCCTGTTGTTTGGTGTTACTTCTGCAGGATCCTA 1380 1440 1500 1560 1620 1680 1740 1800 1860 1920 1980 2040 Hình Vị trí promoter, hộp TATA chuỗi kết thúc gen Ubi từ dòng ngơ H240 118 Nguyen Duc Thanh, Le Hoang Duc Sử dụng phần mềm chuyên dụng dự đoán chức (vùng promoter, vùng phiên mã, chuỗi kết thúc) so sánh với trình tự ngân hàng gen, chúng tơi xác định số vùng trình tự đặc biệt vị trí promoter từ 870 đến 920, hộp TATA nằm vị trí từ 877 đến 885 bp chuỗi kết thúc vị trí từ 1266 đến 1291 (bảng hình 4) Kết so sánh vị trí vùng phiên mã gen Ubi dòng ngơ H240 gen Ubi1 cơng bố với mã số DQ141598.1 với liệu chuỗi gen tương đồng loài gemone thực vật thể bảng Bảng Kết phân tích vùng promoter Ubiquitin từ dòng ngơ H240 Mã số Tên gen Vị trí promoter Vị trí hộp TATA 870-920 877-885 Gen Ubiquitin (Ubi) JX947345.1 từ dòng ngơ H240, vùng promoter Vị trí chuỗi kết thúc 1266-1291 Bảng Mức độ tương đồng vùng gen Ubi từ dòng ngô H240 gen Ubi1 từ Ngân hàng Gen (mã số DQ141598.1) so với chuỗi gen tương đồng loài gemone thực vật Mã số JX947345.1 (gen Ubiquitin từ dòng ngơ H240 DQ141598.1 (gen Poly Ubiquitin1 từ Ngân hàng Gen) Mức độ tương đồng chung vùng so sánh (PHa) Mức độ tương đồng vùng phiên mã (PHs) Mức độ tương đồng chuỗi bên phải vùng phiên mã (PHss) Mức độ tương đồng vùng hộp TATA (PHt) Mức độ tương đồng trung bình yếu tố phiên mã vùng so sánh (PHr) 88% 100% 95% 100% 85% 89% 88% 97% 100% 98% Kết bảng cho thấy mức độ tương đồng vùng hộp TATA hai gen so với chuỗi gen tương đồng loài gemone thực vật 100%, mức độ tương đồng vùng phiên mã gen Ubi từ dòng ngơ H240 cao so với gen Ubi1 công bố (100% so với 88%) mức độ tương đồng chung vùng so sánh tương đương (88 89%) KẾT LUẬN Từ kết nhân dòng gen phân tích promoter Ubiquitin từ dòng ngơ H240 chúng tơi rút kết luận sau: Đã nhân dòng thành cơng gen Ubiquitin với mức độ xác cao Gen Ubi từ dòng ngơ H240 có độ tương đồng cao với gen Ubiquitin tách từ dòng ngơ khác cơng bố Ngân hàng Gen quốc tế Đã xác định vùng promoter Ubiquitin gen Mức độ tương đồng vùng promoter, vùng phiên mã vùng hộp TATA gen Ubi nhân dòng có độ tương đồng cao so với chuỗi gen tương đồng loài gemone thực vật Kết nhận nghiên cứu góp phần đáng kể việc nghiên cứu sử dụng promoter Ubiquitin chuyển gen mầm nói chung ngơ nói riêng Lời cám ơn: Cơng trình thực khn khổ đề tài “Nghiên cứu tạo dòng ngơ bố mẹ tăng cường khả tổng hợp tinh bột cơng nghệ gen” thuộc Chương trình Trọng 119 TẠP CHÍ SINH HỌC 2013, 35(3se): 114-121 điểm phát triển ứng dụng Công nghệ Sinh học lĩnh vực Nông nghiệp phát triển nông thôn đến năm 2020 TÀI LIỆU THAM KHẢO Christensen A H., Sharrock R A, Quail P H., 1992 Maize polyubiquitin genes: structure, thermal perturbation of expression and transcript splicing, and promoter activity following transfer to protoplasts by electroporation Plant Mol Biol 18 (4), 675-689 Cornejo M J., Luth D., Blankenship K M., Anderson O D., Blechl A E., 1993 Activity of a maize Ubiquitin promoter in transgenic rice Plant Mol Biol., 23(3): 56781 Dalton S J., Heywood E., Timms E J., Morris P., 2007 A comparison of maize and rice Ubiquitin promoter activity using the uidA (Gus) gene in maize: An enhanced rice Ubiquitin promoter increases transgene expression in maize compared with the native maize Ubiquitin promoter Plant Transformation Technologies Conference, Vienna, Austria, 4-7 February 2007 Gautheret D., Lambert A., 2001 Direct RNA Motif Definition and Identification from Multiple Sequence Alignments using Secondary Structure Profiles J Mol Biol 313:1003-1011 Jia F., Gampala S S., Mittal A., Luo Q., Rock C D., 2009 Cre-lox univector acceptor vectors for functional screening in protoplasts: analysis of Arabidopsis donor cDNAs encoding Abscisic Acid INSENSITIVE1-like protein phosphatases Plant Mol Biol., 70(6): 693-708 Kamo K., Joung Y H., Green K., 2009 GUS expression in Gladiolus plants controlled by twoDladiolus Ubiquitin Promoter Floricul Ornam Biotechnol., 3(1): 10- 14 Kuraya Y., Ohta S., Fukuda M., Hiei Y., Murai N., Hamada K., Ueki J., Imaseki H., Komari T., 2004 Suppresion of transfer of T-DNA 'vector backbone' sequences by multiple left border repeats in vectors for 120 transformation of higher plants mediated by Agrobacterium tumefaciens Mol Breed., 14: 309-320 Liu L., Maillet D S., Frappier J R., Walden D B., Atkinson B G 1995 Characterization, chromosomal mapping, and expression of different polyubiquitin genes in tissues from control and heatshocked maize seedlings Biochem Cell Biol 73 (1-2): 19-30 Rooke L., Byrne D., Salgueiro S 2000 Marker gene expression driven by the maize Ubiquitin promoter in transgenic wheat Ann Appl Biol., 136: 167-172 10 Rozen S., Skaletsky H J., 2000 Primer3 on the WWW for general users and for biologist programmers In: Krawetz S, Misener S (eds) Bioinformatics Methods and Protocols: Methods in Molecular Biology Humana Press, Totowa, NJ, pp 365-386 11 Sambrook J., Fritsch E.F., Maniatis T., 1989 Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2nd Edition) Cold Spring Harbor Laboratory, NY 12 Saghai Maroof M A., Biyashev R M., Yang G P., Zhang Q., Allard R W., 1994, Extraordinarily polymorphic microsatellite DNA in barley: species diversity, chromosome location, and population dynamics Proc Natl Acad Sci USA., 91: 5466-5470 13 Streatfield S J., Love R.T., 2003 Analysis of the maize polyubiquitin-1 promoter heat shock elements and generation of promoter variants with modified expression characteristics Unpublished 14 Toki S., Takamatsu S., Nojiri C., Ooba S., Anzai H., Iwata M., Christensen A H., Quail P H., Uchimiya H., 1992 Expression of a Maize Ubiquitin Gene Promoter-bar Chimeric Gene in Transgenic Rice Plants Plant Physiol., 100:1503-1507 15 Vickers C E., Xue G P., Gresshoff P M., 2003 A synthetic xylanase as a novel reporter in plants Plant Cell Rep., 22(2): 135-140 Nguyen Duc Thanh, Le Hoang Duc CLONING UBIQUITIN GENE WITH PROMOTER REGION FROM ZEA MAYS L Nguyen Duc Thanh, Le Hoang Duc Institute of Biotechnology, VAST SUMMARY Ubiquitin is a protein in eukaryote cells and its sequence is highly conserved The protein has been involved in many cellular processes, such as protein turnover, chromatin structure, cell cycle control, DNA repair and response to heat shock and other stresses The gene codes for this protein (Ubiquitin gene) and its promoter have been cloned The function of the gene and its promoter from many plants like rice, maize and gladiolus plants has been studied Ubiquitin promoter plays an important role in gene expression in monocot In this article, we present the results on cloning the gene coding for Ubiquitin protein (Ubi gene) and its promoter from maize line H240 for genetic engineering studies in maize The data obtained showed that the promoter region, transcription region and TATA box region of cloned Ubi gene from maize line H240 have high level of homology comparing to orthologous sequenes in plant genome The cloned Ubi gene was submited to the GenBank with assession number JX947345.1 The results of this study will, considerablely, contribute to the study and application of Ubiquitin promoter in gene transfer of monocot, in general, and maize, in particular Keywords: Zea mays, homology, maize plant, promoter, TATA box, transcription region, Ubiquitin gene Ngày nhận bài: 24-5-2013 121 ... Tách chiết DNA genome: DNA genome tách từ mẫu ngô theo phương pháp CTAB Saghai Maroof et al (1994) [12] Nhân gen Ubi promoter: Gen Ubi promoter Ubiquitin nhân từ DNA genome tách từ ngô phản ứng... promoter Ubiquitin từ dòng ngơ H240 chúng tơi rút kết luận sau: Đã nhân dòng thành cơng gen Ubiquitin với mức độ xác cao Gen Ubi từ dòng ngơ H240 có độ tương đồng cao với gen Ubiquitin tách từ dòng. .. ngơ chuyển gen Như vậy, khẳng định gen Ubi nhân dòng có độ tin cậy cao Gen Ubi từ dòng ngơ H240 đăng ký Ngân hang Gen quốc tế NCBI với mã số JX947345.1 (Zea mays ubiquitin (Ubi) gene, promoter