Tiêu chuẩn Việt Nam TCVN 5449-91 - ST SEV 3833-82 giới thiệu nội dung về đồ hộp - chuẩn bị dung dịch thuốc thử, thuốc nhuộm, chỉ thị và môi trường dinh dưỡng dùng cho phân tích vi sinh. Mời các bạn cùng tham khảo.
TCVN 5449-91 Nhãm M tiªu chn ViƯt Nam TCVN 5449-91 ST SEV 3833 - 82 Đồ hộp Chuẩn bị dung dịch thuốc thử, thuốc nhuộm, thị môi trờng dinh dìng dïng cho ph©n tÝch vi sinh Canned foods Preparation of solution of reageuts, dyes indicators and nutrient medium for microbiological analysis Tiêu chuẩn phù hợp với ST SEV 3833-82 Quy định chung 1.1 Để pha chế dung dịch thuốc thử, thuốc nhuộm, thị môi trờng dinh dỡng, quy định riêng khác, cần sử dụng: nớc cất Thuốc thử loại tinh khiết hoá học tinh khiết phân tích tơng ứng với thông số dạng bên ngoài, mùi, độ hoà tan, khối lợng, thể tích, nhiệt độ độ xác phép đo đợc quy định quy định hành Thuốc thử dung dịch phụ chuẩn bị theo quy định hành; Dung dịch thị chuẩn bị theo quy định hành; Các môi trờng dinh dỡng khô, hợp phần khô tơi dùng để chuẩn bị môi trờng dinh dỡng nh thịt, cá, sữa, rau, quả, nấm men, trứng gà, phải tơng ứng với yêu cầu tiêu chuẩn hành 1.2 Khi chuẩn bị dung dịch thuốc thử, thuốc nhuộm, thị môi trờng dinh dỡng, cần ghi rõ tỉ lệ chất theo đơn vị đại lợng vật lý quy định 1.3 Khi pha chế dung dịch thuốc thử, thuốc nhuộm, thị, cần sử dụng dụng cụ đo dung tÝch cÊp A, pha chÕ m«i trêng dinh dỡng (nếu quy định riêng khác) cã thĨ sư dơng dơng ®o dung tÝch cÊp B 1.4 Chuẩn bị môi trờng dinh dỡng dụng cụ chứa thủy tinh tráng men Đối víi dơng thđy tinh míi (gåm: b×nh, èng nghiƯm, pipet, đĩa pêtri), trớc sử dụng, cần ngâm dung dịch axit clohydric - 2% vòng 12 - 24 giờ, rửa nớc máy sau níc cÊt råi trïng nåi hÊp ë 121 10C Đối với dụng cụ thủy tinh sử dụng, cần trùng 121 10C nồi Ban hành theo định số 424/QĐ ngày 17 tháng 07 năm 1991 UBKH Nhà nớc tiêu chuẩn rau hấp đổ hết lợng chứa rửa cặn bẩn dung dịch rửa, tráng nớc máy sau ®ã b»ng níc cÊt 1.5 NÕu tiªu chn hiƯn hành có mô tả môi trờng dinh dỡng khác biệt thành phần có không chứa dịch chiết nấm men, phân tích đồ hộp xuất nhập sử dụng môi trờng có chiết men dịch chiết nấm men Đối với đồ hộp không dùng với mục đích trên, cho phép sử dụng môi trờng dinh dỡng tơng tự chuẩn bị theo tiêu chuẩn hành 1.6 Nếu cách chuẩn bị môi trờng dinh dỡng không ghi rõ điều kiện để hoà tan môi trờng dinh dỡng hay hợp phần khô khuấy tan chúng nớc có nhiệt độ phòng 15 phút sau đó, cần, đun nóng 1.7 Điều chỉnh pH môi trờng nhiệt độ phòng đến mức cần thiết cách cho thêm dung dịch natri hydroxit 10% dung dÞch axit clohydric 25% hay dung dÞch axit xitric 20% vào giọt khuấy, đồng thời xác định độ pH mẫu đợc lấy định kỳ điện kế thị mầu Giá trị pH môi trờng dinh dỡng trùng bị thay đổi Khi kiềm hoá môi trờng dung dịch kiềm, pH sau sôi trùng giảm 0,2, chuẩn bị môi trờng có nớc chiết gan, hỗn hợp vitamin B, pH giảm 0,3 - 0,4 Do chuẩn bị môi trờng, cần điều chỉnh cho pH cao giá trị định khoảng 0,2 - 0,4, đun sôi pH giảm 0,2 - 0,3, tiếp tục kiểm tra pH, điều chỉnh cần trùng nồi hấp NhÊt thiÕt ph¶i kiĨm tra pH sau trïng 1.8 Thanh trïng m«i trêng dinh dìng theo TCVN 4886 - 89 (ST SEV 3013-81) nÕu tiªu chn hiƯn hành quy định riêng khác 1.9 Bảo quản môi trờng dinh dỡng chuẩn bị nhiệt độ phòng không ngày 10C không tháng, tiêu chuẩn hành quy định riêng khác Thiết bị Để chuẩn bị môi trờng dinh dỡng, dung dịch thuốc thử, thuốc nhuộm, thị, cần sử dụng: 1) Nồi hấp để trùng môi trờng dinh dỡng; 2) Thiết bị trùng luồng hơi; 3) Bản trùng làm từ amiăng; 4) Bếp cách thủy điều chỉnh đợc nhiệt độ; 5) Cân phân tích; 6) Cân thí nghiệm; 7) Cân bán kỹ thuật; 8) Phễu lọc nóng; 9) Phễu thủy tinh; 10) Máy đồng hoá hay máy trộn dùng cho phòng thí nghiệm; 11) Đèn cồn đèn khí; 12) Bộ chng cất; TCVN 5449-91 13) TÊm sÊy dơng thđy tinh; 14) C¸i rưa dơng cơ; 15) èng nhá giät; 16) Nåi c¸c cỡ; 17) Bình cầu hay tam giác đáy bằng, có dung tích khác nhau; 18) Giỏ dây thép tráng thiếc dùng để trùng; 19) Cuvet cỡ; 20) Vải băng; 21) Cối xay thịt có đờng kính lỗ không lớn 4mm; 22) Dao; 23) Kéo; 24) Đũa thủy tinh (tròn đờng kính 3,5mm; dài 270mm; uốn cong 30mm, đầu tày); 25) Cái cặp; 26) Pipet More; 27) Pipet dung tích khác nhau; 28) Bếp điện ; 29) pH kÕ; 30) èng nghiƯm dung tÝch kh¸c nhau; 31) Bệ rửa; 32) Khúc xạ kế; 33) Đờng kế; 34) Lới amiăng; 35) Mặt kính đồng hồ; 36) Cối sứ; 37) Nhiệt kế hoá học loại đo đợc từ ®Õn 500C, tõ ®Õn 2500C vµ tõ 50 ®Õn 1000C; 38) Nồi điều nhiệt với khoảng nhiệt độ 50 - 620C, 30 - 370C; 39) Giá chân; 40) Màng lọc amiăng; 41) Phin lọc kiểu Seits; 42) Màng lọc; 43) Bình cổ hẹp dung tích 100 - 200cm3; 44) Hộp kim loại dùng để trùng pipet đĩa petrô; 45) Tủ lạnh; 46) Máy ly tâm; 47) ống đong dung tích khác nhau; tiêu chuẩn rau 48) Đồng hồ cát; 49) Đồng hồ tín hiệu; 50) Đĩa petri loại dùng cho phân tích vi sinh (đáy phẳng đờng kính không 102mm, đờng kính 90 2mm, chiều cao không nhỏ 18mm); 51) Tủ sấy để trùng dụng cụ không khÝ nãng; 52) Que khuÊy kim lo¹i; 53) Que khuÊy thủy tinh; 54) Giá để pipet; 55) Giá để ống nghiệm; 56) Giá kim loại có cặp vòng Thuốc thử, dung dịch vật liệu Để chn bÞ dung dÞch, thc thư, thc nhm, chÊt chØ thị môi trờng dinh dỡng cần sử dụng: 1) Th¹ch (aga); 2) Amoni oxalat; 3) Amoni xitrat; 4) Axeton; 5) Brom; 6) Bromcrezola ®á; 7) Bromtimola xanh; 8) GiÊy läc; 9) Níc cÊt; 10) Glucoza; 11) NÊm men Ðp; 12) Gelatin; 13) PhÌn s¾t amoni Fe (NH4) (SO4)2.12H2O; 14) S¾t sunfat Fe2(SO4)3; 15) S¾t clorua FeCl3; 16) Ièt tinh thÓ I2; 17) Kali nitrat KNO3; 18) Kali bicromat K2Cr2O7; 18a) Kali sunfat K2SO4; 19) Kali Iodua KI; 20) Kali dihydrophotphat KH2PO4 hc Kali hydrophotphat K2HPO4; 21) Canxi Cacbonat CaCo3; TCVN 5449-91 22) Khoai t©y; 23) Axit ascorbic; 24) Axit xitric; 25) Axit lactic; 26) Axit sunphuric, (TK.HH), H2SO4; 27) Axit clohydric đậm đặc, HCl; 28) Axit axetic; 29) Tinh bét tan; 30) TÝm tinh thĨ; 31) TiÕt tr©u bò, cừu ngựa; 32) Quỳ tím; 33) Liti clorua, hexahidrat LiCl.6H2O; 34) Lactoza; 35) Dầu vaselin; 36) Đồng sunfat CuSO4; 37) Sữa bò; 38) Thịt bò, bê, cừu, ngựa; 39) Natri hydroxit NaOH; 40) Xitrat natri, dehidrat; 41) Natri pirunat; 42) Natri sunphit Na2SO3; 43) Natri cacbonat Na2CO3; 44) Natri hidrophotphat vµ Natri dihidrophotphat Na 2HPO4.12H2O vµ NaH2PO4.H2O; 45) Natri axetat, dung dÞch; 46) Natri clorua NaCl; 47) Paradimetylamiabenzaldehyt; 48) Parafin; 49) Pirogalon; 50) Pepton dïng cho vi sinh vật; 51) Gan bò, bê, thỏ chất øc chÕ sù ph¸t triĨn cđa vi sinh vËt; 52) Saccaroza; 53) Xaphranin Q hc T; 54) Mi Mor FeSO4 (NH4)2SO4.6H2O; 55) Etanola; 56) Nớc cà chua; tiêu chuẩn rau 57) Triptophon; 58) Sản phẩm thủy ngân Tripton cña cazein; 59) Triptophan; 60) 2, 3, - Triphenyltetrazol clorua; 61) Fushin (bazơ axit); 62) Sixtein hidroclorua; 63) Cao nấm men khô; 64) Cao thịt khô; 65) Nớc chiết thịt; 66) Trứng gà Chuẩn bị sử dụng dung dịch, thuốc thử, thuốc nhuộm, chất thị hợp phần môi trờng dinh dỡng 4.1 Nớc thạch nghèo, dung dịch 2,0% Hoà tan 2,0g thạch vào 98ml nớc cất Thanh trùng 121 10C 20 phút Sử dụng để tạo màng mặt môi trờng tránh không cho môi trờng tiếp xúc với oxy không khí 4.2 Huyền phù (nhũ tơng) lòng đỏ dung dịch sinh lý Dùng pipet tách lấy lòng đỏ từ trứng lau vỏ cồn 70%, sau đem trộn với 100ml dung dịch sinh lý Nhũ tơng lòng đỏ chuẩn bị tơng tự nhng lấy lòng đỏ đem trộn với 10ml dung dịch sinh lý Cho vào môi trờng dinh dỡng để xác định hoạt tính lexitinaza vi sinh vật 4.3 Nớc brom - dung dịch brom bão hoà Hoà tan - 3,5g brom vào 100ml nớc cất Chuẩn bị níc brom tđ hót B¶o qu¶n lä thđy tinh tối màu có nắp đậy kín tránh ánh sáng Sử dụng nh chất thị để xác định hàm lợng tripxephan môi trờng dinh dỡng Sau cho - giät níc brom vµo chÊt láng cã chøa Triptophan sÏ cã mµu tÝm phít hång 4.4 Glucoza, dung dÞch níc 0,5; 1; 10; 20% Cho 0,5; 1; 10; 20g glucoza vào bình định mức dung tích 100ml rửa nớc cất vô trùng, sau thêm nớc đến vạch Chuyển nớc glucoza thu đợc vào ống nghiệm vô trùng trùng 112 10C 15 hc ë 100 10C 30 phút lọc qua màng läc Sư dơng nh ngn cacbonhidro m«i trêng dinh dỡng chất khử môi trờng nuôi cấy vi sinh vật kỵ khí 4.5 Chỉ thị bromcresola tím - dung dịch kiềm chuẩn bị theo quy định hành Sử dụng để xác định khả tạo axit cđa vi sinh vËt 4.6 ChØ thÞ bromtimola xanh - dung dịch kiềm chuẩn bị theo quy định hành TCVN 5449-91 Sử dụng để kiểm tra pH cđa m«i trêng dinh dìng 4.7 Canxi cacbonat v« trïng Cho từ đến 100g Cacbonat canxi vào ống nghiệm, bình hay lọ cổ hẹp trùng không khí theo TCVN 4886-89 (ST SEV 3013-81) Dùng để thêm vào môi trờng dinh dỡng loại dùng để kiểm tra sản phẩm chua 4.8 Axit ascorbic - dung dịch 5% Chuẩn bị theo quy định hành trïng b»ng c¸ch läc Sư dơng nh mét chÊt khử liên kết với oxy môi trờng nuôi cấy vi sinh vật kỵ khí 4.9 Axit xitric - dung dịch 20% Cho 20g axit xitric vào bình định mức thêm nớc đến 100ml, hoà tan chuyển vào èng nghiƯm hay b×nh råi trïng ë 121 10C 20 phút Sử dụng để axit hoá môi trờng dinh dỡng 4.10 Thịt miếng, thịt băm, nớc thịt, nớc hầm thịt Thịt bò thịt ngựa lợc xơng, mỡ, gân, đem cắt thành miếng để chuẩn bị nớc hãm thịt xay nhỏ cối xay thịt để chuẩn bị nớc thịt Cho nớc vào theo tỉ lệ lít nớc ứng với 500g thịt để qua đêm tủ lạnh Hôm sau lấy ra, đun nhỏ lửa hỗn hợp thịt với nớc đến sôi cho sôi đến mức cần thiết Trong để sôi, cần khuấy định kỳ hỗn hợp thêm nớc đến thể tích ban đầu Với lợng không lớn (dới 5%) đun sôi nhỏ lửa đồng thời khuấy thờng xuyên để thịt khỏi cháy Với lợng lớn, nên nấu sôi nồi hai vỏ Việc đun sôi kết thúc lọc thử hỗn hợp giấy lọc vào ống nghiệm, chất lỏng thu đợc suốt Tiếp tục để hỗn hợp tủ lạnh ngày Điều chỉnh pH hỗn hợp đến 7,0 7,2, lọc qua vải lọc ép hết nớc từ thịt miếng hay thịt băm Thanh trùng nớc thịt hay nớc hầm thịt miếng hay thịt băm 121 10C 20 phút lít nớc thịt hay nớc hầm tơng ứng với - 5g cao thịt Sử dụng làm hợp phần môi trờng dinh dỡng 4.11 Gan miếng, nớc gan, nớc hầm gan canh thang gan Gan tơi bò, bê thỏ đem loại bỏ màng mỡ Sau cắt thành miếng nhỏ 30 40g để chuẩn bị nớc gan xay nhỏ cối xay thịt để chuẩn bị nớc gan Cho nớc vào gan theo tØ lƯ lÝt níc øng víi 500g, giữ nhiệt độ từ - 0C cho sôi 20 phút Điều chỉnh pH đến 7,1 0,1 lại cho sôi 10 phút Chắt lọc hỗn hợp qua vải, chất lỏng dùng để chuẩn bị nớc hay canh thang Điều chỉnh pH chất lỏng đến 7,1 0,1 thêm nớc đến thể tích ban đầu Thanh trùng nớc gan hay nớc hầm gan 121 10C 20 phút Để chuẩn bị canh thang gan, trớc trùng cần thêm 1% pepton, 0,5% muối ăn (duy trì pH 7,1 0,1) vào chất lỏng trên, sau chuyển hỗn hợp vào bình ống nghiệm đậy kín trùng 121 10C 20 phút Cắt nhỏ miếng gan đến 1,5 - 3g, rót natri cacbonat dung dịch 5% vào cho sôi vòng 10-15 phút, không để sôi mạnh, sau phun nớc rửa miếng gan rá lọc rửa qua vài lần nớc cất pH miếng gan phải 7,1 tiêu chuẩn rau 0,1 Kiểm tra pH gan cách nhúng ngập chất thị bromtimola xanh phải có màu xanh Cho miếng gan vào ống nghiệm hay bình, đậy kín trïng ë 121 10C 20 Sư dơng lµm hợp phần môi trờng dinh dỡng cho vi sinh vật kỵ khí 4.12 Rợu quỳ Chuẩn bị theo quy định hành Cho vào môi trờng dinh dỡng để xác định khả khử quỳ vi sinh vật 4.13 Dầu vaselin Rót 20 - 50ml dầu vào ống nghiệm hay bình, đậy kín trùng 121 20 phút 0C Sử dụng để tạo lớp môi trờng dinh dỡng lỏng dùng cho vi sinh vật kỵ khí 4.14 Sữa tách chất béo Đun sôi sữa, sau để vào tủ lạnh ngày đêm, gạn hết váng sữa, lại đun sôi để nguội tủ lạnh ngày, gạn bỏ lần lớp Sữa tách chất béo đợc chuẩn bị cách phân ly Cho sữa thu đợc vào bình vô trùng, đậy kín trùng 1000C 30 phút trïng mét lÇn ë 116 10C 20 Sau trùng sữa không đợc có màu nâu Sữa tách chất béo đợc dùng làm hợp phần môi trờng dinh dỡng 4.15 Natri hydroxit dung dịch 10% Chuẩn bị theo quy định hành Sử dụng để kiềm hoá môi trờng dinh dỡng 4.16 Pyrogalon, dung dịch kiềm Chuẩn bị theo quy định hành Dùng để hấp thụ oxy bình nuôi vi sinh vật kỵ khí 4.17 Dung dịch để xác định khả khử sunfit cđa Clo stridium: Natri sunfit 1%, s¾t sunfat 0,4% Thanh trùng dung dịch 115 10C 30 phút Ngay trớc cấy, cho thêm 5ml dung dịch vào 100ml môi trờng dinh dỡng dùng cho clostridium hoạt hoá để nguội 4.18 Dung dịch thuốc thử dùng để nhuộm Gram 4.18.1 Dung dịch màu Khuker Hoà tan 2g tím tinh thể có hàm lợng chất khô từ 8590% vào 20ml cån; hoµ tan 0,8g amoni oxalat vµo 80ml níc; pha lẫn dung dịch giữ nhiệt độ phßng 24 giê tríc sư dơng 4.18.2 Dung dịch Lugol Hoà tan 2g KI vào 5-10ml nớc, cho thêm 1g Iôt tinh thể, để vài đến Iốt tan hoàn toàn sau thêm nớc đến thể tích 300ml 4.18.3 Dung dịch Iốt (theo công thức) Burke Hoµ tan 2g Kali Iodua KI víi 5-10ml níc bình định mức dung tích 100ml, thêm 1g Iốt tinh thể vào, để vài đến Iốt tan hoàn toàn sau thêm nớc đến vạch TCVN 5449-91 4.18.4 Dung dịch màu tơng phản Hoà tan 0,25g Xaphranin 10ml cồn, sau pha trộn dung dịch thu đợc với 100ml nớc 4.18.5 Cho phép sử dụng dung dịch tím tinh thể 10% để làm dung dịch màu Và dung dịch Xaphranin T-0,5% dung dịch cồn 0,5% làm dung dịch màu tơng phản 4.18.6 Để tẩy màu, vết dung dịch màu bản, sử dụng etanola dung dịch màu Khuker axeton dung dịch tím tinh thể - nớc 4.19 Dung dịch thuốc thử để nhuộm màu bào tư vi khn Hoµ tan 5g malachit xanh 100ml nớc Hoà tan 5g Xaphronin vào 100ml nớc bình khác 4.20 Dung dịch sinh lý Hoà tan 0,85g natri clorua vµo 100ml níc cÊt vµ trïng ë 121 phút 10C 20 Dùng để chuẩn bị huyền phù nhũ tơng lòng đỏ trứng 4.21 Hỗn hợp thuốc thử để tạo điều kiện yếm khí Trộn 1g pirogalon với 1g Kali cacbonat khan 5g đất tảo cát, gói vào bao giấy Dùng để tạo điều kiện yếm khí 4.22 Hỗn hợp parafin Lấy lợng parafin dầu vaselin nhau, cho nóng chảy trộn kỹ, sau trùng không khí nóng 140 10C 60 phút Dùng để tạo lớp môi trờng dinh dỡng lỏng cho vi sinh vật kỵ khÝ 4.23 Níc chiÕt nÊm men - dung dÞch 20% nấm men tự phân Cắt 100g nấm men bánh mỳ Ðp thµnh tõng miÕng nhá vµ rãt 500ml níc vµo Để chuẩn bị nớc chiết, cần cho bình có dung tích thích hợp cho thể tích hỗn hợp chiếm 1/5 dung tích bình Để hỗn hợp vào tủ sấy ë nhiƯt ®é tõ 58 ®Õn 60 0C ngày khuấy 1-2 lần ngày đêm Quá trình tự phân kết thúc nấm men chảy lỏng hoàn toàn Dịch chiết có màu nâu mùi thơm 5ml dung dịch chiết 20% có giá trị 1g nÊm men Sư dơng nh ngn chÊt kÝch thÝch sinh trởng cho vi sinh vật Chuẩn bị sử dụng môi trờng dinh dỡng 5.1 Môi trờng thạch - lòng đỏ trứng TTC Chuẩn bị 500ml thạch thịt - pepton có pH 7,1 0,1, nấu chảy để nguội đến 45 C, sau cho thêm 20ml nhũ tơng lòng đỏ 25mg 2, 3, - Triphenyltetrazal clorua Trộn kỹ hỗn hợp rót vào đĩa petri, bảo quản tủ lạnh không 10 ngày Dùng để nuôi cấy 5.2 Môi trờng thạch gan tiêu chuẩn rau Thêm 500ml nớc máy vào 500ml nớc gan, thêm tiếp 10g pepton, 5g natri clorua 20 30g thạch Đun sôi nhỏ lửa môi trờng đến thạch tan hết, điều chỉnh pH đến 6,8 7,0, sau rót vào ống nghiệm bình cổ hĐp vµ trïng ë 121 10C Dùng để nuôi cấy vi sinh vật kỵ khí a ấm 5.3 Môi trờng thạch - đờng - tiết Seyssler Chuẩn bị 100ml thạch thịt - pepton, nấu chảy để nguội đến 50 0C, sau thêm vào điều kiện vô trùng 10ml dung dịch Glucoza vô trùng 10 - 20ml tiết tơi vô trùng khử fibrin trâu, bò, ngựa cừu Lắc cẩn thận hỗn hợp, tránh tạo váng bọt, rót vào ®Üa petri sau ®ã sÊy m«i trêng theo TCVN… (ST SEV 3015-81) giữ không ngày nhiệt ®é 10C M«i trêng cã pH 7,2 - 7,4 Dùng để xác định hoạt tính tan máu vi sinh vật 5.4 Canh thang (thạch) glucoza - tripton Thêm vào 1000ml nớc cất lợng gồm 5g Tripton; 2,5g cao nÊm men hc 12,5ml níc chiÕt nÊm men 20% (và 12 - 15g thạch chuẩn bị môi trờng đặc) Đun sôi đến tan hoàn toàn, để nguội đến 50 - 60 0C, ®iỊu chØnh pH ®Õn 7,0, cho thêm 1g glucoza riêng môi trờng dùng cho vi khuẩn a nhiệt cần cho thêm 0,04g bromcrezala đỏ Chuyển môi trờng vào bình (nếu môi trờng đặc) ống nghiệm (nếu môi trờng lỏng) trïng nåi hÊp ë 121 10C 15 Dùng để nuôi cấy vi sinh vật a ấm, vi sinh vật hiếu khí a nhiệt có khả tạo axit vi sinh vật kỵ khí tuỳ tiện 5.5 Canh thang (thạch) khoai tây - pepton Cho lít nớc máy vào 200g khoai tây rửa cắt nhỏ đun sôi 15 - 20 phút, tránh nhừ quá, sau lọc qua phin vải thêm nớc vào dung dịch lọc đến thể tích ban đầu Hoà tan 5g pepton, 5g natri clorua, 15-20g thạch dịch lọc đun cho nóng chảy Điều chỉnh pH 7,1 0,1 Rót vào bình ống nghiệm råi trïng ë 125 10C 30 Nªn trì tính vô trùng môi trờng cách gi÷ ỉn nhiƯt ë 55 - 620C 48 giê Dùng để nuôi cấy vi sinh vật hiếu khí a nhiệt vi sinh vật kỵ khí tuỳ tiện 5.6 Canh thang (thạch) thịt - pepton Cho 10g pepton, 5g natri clorua vào 1000ml nớc thịt Điều chỉnh pH 7,1 0,1, đun sôi lọc qua giấy lọc Thanh trùng ë 121 10C 20 Khi cã sù l¾ng cặn canh thang thịt - pepton cần lọc lại lần nữa, sau trùng Để chuẩn bị thạch thịt - pepton 1000ml canh thang thịt - pepton, trớc trùng cần cho thêm 15-20g thạch đun nhỏ lửa đồng thời khuấy cho thạch tan hết Điều chỉnh pH 7,1 0,1 rót vào ống nghiệm bình cổ hẹp trùng 121 10C 20 phút Dùng để nuôi cấy vi sinh vËt hiÕu khÝ a Êm vµ vi sinh vật kỵ khí tuỳ tiện 5.7 Canh thang (thạch) thịt - pepton - glucoza Chuẩn bị 1000ml canh thang (thạch) thịt - pepton trớc trùng cho thêm 1g glucoza sau ®ã ®iỊu chØnh pH 0,1 råi trïng ë 121 10C 20 10 TCVN 5449-91 Dùng để nuôi cấy vi sinh vật hiếu khí a ấm vi sinh vật kỵ khí tuỳ tiện xác định tổng số vi sinh vật cách đếm đĩa petri 5.8 Canh thang (thạch) thịt - pepton với Glucoza nớc chiết nấm men Thêm điều kiện vô trùng 2g cao nấm men 10ml dung dịch 20% dịch chiết nấm men vào 1000ml canh thang (thạch) thịt - pepton - glucoza Dùng để nuôi cấy vi sinh vật hiếu khí kỵ khí t tiƯn 5.9 Canh thang thÞt - pepton víi tinh bột hoà tan Thêm 10g tinh bột vào nớc chuyển vào nớc sôi khuấy thu đợc 100ml dung dịch tinh bột Pha dung dịch thu đợc với 900ml canh thang thịt - pepton có chứa Triptophan (phản ứng dơng tính với Triptophan), sau trïng ë 121 10C 20 M«i trêng có pH 7,1 0,1 Dùng để nuôi cấy vi sinh vật hiếu khí, a nhiệt, tạo axit vi sinh vật kỵ khí tuỳ tiện 5.10 Canh thang thịt - pepton với canxi cacbonat Rót vào ống nghiệm èng - 6ml canh thang thÞt - pepton víi 1% glucoza thêm 0,1g canxi cacbonat vô trùng Cho vào bình cổ hẹp với 100ml môi trờng 2g canxi cacbonat vô trùng trùng 121 10C 20 phút Dùng để nuôi cấy vi sinh vật hiếu khí a ấm kỵ khí tuỳ tiện phân tích sản phẩm đồ hộp chua 5.11 Canh thang Hottinger môi trờng, thành phần canh thang 5.11.1 Để chuẩn bị dung dịch Hottinger gốc, ngâm 1kg thịt cắt nhỏ thành miếng vào 1000ml nớc sôi, 20 phót, råi vít ra, nghiỊn nhá b»ng cèi xay thịt lại cho tiếp vào nớc hầm Cho thêm 30 - 40g tuyến tuỵ nghiền nhỏ (có thể thay tuyến tuỵ - 5g Pancreatin) 20ml Cloroform Dùng nút đậy kín chai lại lắc mạnh, (giữ chặt nút) Giữ nhiệt độ 37 0C vòng - Thịt dạng miếng nhỏ mịn lắng xuống đáy chai, phần chất lỏng phía phải suốt Rót chất lỏng läc sau ®ã trïng ë 121 10C 20 phút Dung dịch thu đợc phải cho phản ứng dơng tính triptophan (có màu hồng thêm giọt nớc brom vào ống nghiệm có nút) 5.11.2 Để chuẩn bị canh thang, cần pha trộn 200ml dung dịch Hottinger gốc với 400ml nớc hầm thịt 400ml nớc, thêm tiếp 5g natri clorua, 0,2g natri dihydophotphat kali dihydrophotphat, đun sôi 10 phút, điều chỉnh đến pH 7,6 Rót mạnh canh thang Hottinger vào ống nghiệm bình cổ hẹp có chứa sẵn thịt chín thịt băm đáy Đổ lớp dầu vaselin vô trùng dày cm lên trùng 121 10C 20 phút 5.11.3 Để chuẩn bị môi trờng Hottinger đặc với tripton, glucoza cao nấm men, cần thêm vào 1000ml canh thang Hottinger lợng gồm 0,5g cao nấm men 2,5ml dịch chiết nấm men 20%; 5g glucoza, 5g tripton, 15 - 20g thạch, sau ®iỊu chØnh pH m«i trêng ®Õn 0,10C 20 phút Trớc sử dụng, cần thêm cách vô trùng 0,6g axit ascorbic vào môi trờng vô trùng nóng chảy 5.11.4 Môi trờng Hottinger đặc với glucoza nớc chiết nấm men chuẩn bị theo điều 5.11.3 tiêu chuẩn nhng Tripton axit ascorbic 11 tiêu chuẩn rau 5.11.5 Canh thang Hottinger môi trờng Hottinger đặc với tripton, glucoza nớc chiết nấm men đợc dùng để nuôi cấy vi sinh vật kỵ khí a ấm Môi trờng Hottinger đặc với glucoza nớc chiết nấm men dùng để nuôi cấy vi sinh vËt hiÕu khÝ a Êm vµ vi sinh vËt kỵ khí tuỳ tiện 5.12 Canh thang (thạch) VF với gan Chuẩn bị 2kg thịt lợc mỡ, gân màng, xay nhỏ cối xay thịt đem trộn với 500g gan băm nhỏ, không chứa chất ức chế phát triển vi sinh vật lít n ớc bình tráng men Đun nóng đến 50 0C thêm 100ml dung dịch axit clohydric 10% Trộn kỹ hỗn hợp cho thêm lợng pepxin xác định trớc Lợng pepxin cho thêm vào hỗn hợp thịt, gan nớc xác định theo độ chuẩn pepxin, nhng thêm nhiều so với ớc tính 50% Ví dụ với độ chuẩn 1:10 cần 0,25g pepxin để phân cắt 2,5kg protein Nh vậy, thực tế cần thêm 0,375g pepxin Để pepxin tác dụng lên hỗn hợp 20 50 0C bếp cách thủy Sau 20 dới tác dụng pepxin, hỗn hợp phải cho phản ứng Biure dơng tính phản ứng với triptophan Để kiểm tra phản ứng Biure, cần dùng 5ml lớp hỗn hợp đợc phân cắt cho 1-2 giọt dung dịch hydroxit natri nồng độ 20mol/1 lít để kiềm hoá thêm vài giọt dung dịch sunphit đồng 1% Chấm dứt trình phân cắt việc đun nóng đến 85% Tách thịt băm khỏi hỗn hợp cách lọc qua vải thêm natri hydroxit điều chỉnh đến pH 5,6 Đun sôi hỗn hợp phút, để nguội lọc qua giấy lọc thêm natri hydroxit điều chỉnh pH = 7,4 Đo thể tích nớc hầm thêm 1,5% pepton vào cần, 1,5 - 2% thạch Sau hoà tan pepton thạch (đun nóng) lại điều chỉnh pH 7,4 Rót canh thang hay thạch vào bình trùng 127 10C 20 phút Để chuẩn bị nớc hầm với gan, cần cho khoảng - 1,5g mẩu gan vào ống nghiệm rót canh thang vào đến độ cao 10 - 15cm Thanh trïng ë 127 10C 20 phút Dùng cho vi sinh vật kỵ khí a ấm, kể tác nhân gây ngộ độc thịt 5.13 Môi trờng clostridium chọn lọc D.R.CM (lỏng sệt hay đặc) Cho vào 800ml nớc cất 10g cao thịt (cho phép thay nớc cất cao thịt 800ml nớc thịt) 10g pepton 1,5g cao nÊm men 20% hay 7,5ml dÞch chiết men 5g natri axetat Chuẩn bị riêng hồ tinh bét b»ng c¸ch cho 1g tinh bét tan mét nớc chuyển vào nớc sôi, đồng thời khuấy liên tục thêm thể tích đến 200ml Pha trộn hồ thu đợc với 800ml hỗn hợp đun sôi bếp cách thủy 30 phút Sau sôi, thêm vào dung dịch 1g glucoza 0,5 Sixtein hidroclorua L điều chỉnh pH dung dịch đến 7,0 Lọc dung dịch nóng qua giấy lọc Để chuẩn bị môi trờng sệt, cần cho thêm vào dung dịch 0,2% thạch, môi trờng đặc thêm 1,5 - 2% thạch Thanh trùng môi trờng nồi hấp 121 10C 15 phút Các dung dịch sunphit natri (Na 2SO3.7H2O) 4% dung dịch sắt xitrat (FeC6H5O7.5H2O) 7% (khi chuẩn bị dung dịch sắt xitrat, cần đun nóng dung dịch phút) đợc trùng cách lọc qua màng lọc bảo quản riêng rẽ 3-5 0C bình cổ hẹp đậy kín thời gian không 14 ngày 12 TCVN 5449-91 Trớc sử dụng, cần hoạt hoá để nguội sôi trờng gốc Pha trộn dung dịch Natri Sunfit Sắt xitrat với theo thể tích cho thêm cách vô trùng vào môi trờng để nguội theo tỷ lệ 0,5ml hỗn hợp ứng với 25ml môi trờng gốc Dùng để nuôi cấy vi sinh vật kỵ khí a ấm xác định khả khử Sunfit vi sinh vật 5.14 Sữa quỳ tím Cho rợu quỳ vào sữa vô trùng thu đợc màu tím nhạt (với 100ml sữa cần khoảng 1ml rợu quỳ) Rót mạnh sữa quỳ tím vào ống nghiệm vô trùng, sau đun sôi bếp cách thủy, 15 - 20 phút để nguội đến 45 0C để nuôi cấy Dùng cho clostridium ủ ấm phân tích đồ hộp sữa 5.15 Môi trờng Bliephend đặc Hoµ tan vµo 800ml níc cÊt 10g lactoza, 10g glucoza, 5g pepton Đun sôi lọc qua giấy lọc Thêm vào dịch lọc 4g cao nấm men 20ml dịch chiÕt nÊm men 20%, 5g canxi cacbonat nghiÒn nhá trớc sử dụng, đa pH đến 7,3 0,1 thêm 15-20g thạch; hoà tan hợp phần rót môi trờng vào bình vô trùng trùng 117 10C 20 phút, không lâu Dùng ®Ĩ nu«i cÊy vi khn lactic 5.16 M«i trêng Bliephend láng Hoµ tan vµo 800ml níc cÊt 10g lactoza, 5g pepton, 10g glucoza đun sôi lọc qua giấy lọc Thêm vào dịch lọc 4g cao nấm men 20ml dịch chiết nấm men 20% 10ml dung dịch bromcrezola đỏ, điều chỉnh pH 7,3 0,1, rót vào bình vô trùng trùng 117 10C 20 phút, nhng không lâu Dùng để nuôi cấy vi khuÈn lactic 5.17 M«i trêng Winson - Blar dïng cho vi khuẩn kỵ khí Chuẩn bị dung dịch phèn sắt amoni 5% dung dịch Natri sunfit 20% n ớc cất vô trùng extempore Thanh trùng dung dịch natri sunfit luồng nóng Thêm 10ml dung dịch natri sunfit 1ml dung dịch phèn sắt amoni vào 100ml thạch thịt - pepton với 1% glucoza nấu chảy để nguội đến 80 0C Điều chỉnh pH 7,5 - 7,8, rót môi trờng vào đĩa Petri sấy đĩa máy ổn nhiệt Dùng để nuôi cấy vi sinh vật kỵ khí a ấm xác định khả khử sunfit chúng 5.18 Môi trờng thịt luộc Cho 500g thịt lọc xơng, mỡ, gân tim trâu bò vào 500ml nớc cất sôi có chứa 1,5ml dung dịch natri hydroxit 1mg/1 lít đun sôi 20 phút Gần kết thúc sôi, cho thêm lợng cần thiết axit lactic để đa pH hỗn hợp đến 7,0 Lọc chất lỏng nóng qua phin lọc vải màu Cho vào dịch lọc l ợng pepton cần thiết để có nồng độ 0,5% lợng Natri clorua đủ để đạt nồng độ 0,25% Tiếp tục đun sôi chất lỏng thu đợc 20 phút, thêm tiếp vào 1ml axit clohydric lọc Đa pH dịch lọc đến 8,2 ®un s«i Sau ®ã, ®iỊu chØnh pH 7,7 - 7,8 Cho vào ống nghiệm 2,5g thịt rót tiếp 10ml chất lỏng chuẩn bị vµo Thanh trïng ë 121 10C 20 Sau trùng pH môi trờng phải 13 tiêu chuẩn rau 7,4 - 7,5 Để tách vi sinh vật kỵ khí tiêu thụ đờng, cần thêm 6,5 - 1% glucoza vào môi trờng Dùng thạch nghèo, dầu vazelin hỗn hợp parafin để tạo lớp phủ bề mặt môi trờng Dùng để nuôi cấy vi khuẩn lactic 5.19 Môi trờng nớc cà chua Cho vào 700 ml níc 300 ml níc cµ chua, 2g cao nÊm men 10 ml dịch chiết nấm men 20%, 10g glucoza, ®iỊu chØnh pH 5,5 - 5,6 vµ läc Rãt vµo bình vô trùng 100 ml trùng nồi hấp (117 10C) 20 phút Chuẩn bị riêng 20 g thạch 500 ml nớc cất cách đun nóng rót vào bình định mức, bình 100 ml trùng nồi hấp 121 10C Tríc cÊy, trén lÉn 100ml môi trờng lỏng với 100 ml thạch nóng chảy, điều kiện vô trùng Chuyển môi trờng thạch thu đợc vào đĩa chứa 0,25g canxi cacbonat vô trùng Dùng để nuôi cấy vi khuẩn lactic 5.20 Môi trờng Kitt-Taroxi Cho vào ống nghiệm vô trùng vài miếng thịt gan Rót vào ống nghiệm 10-12ml canh thang thịt pepton 0,3% glucoza có hoà tan tr ớc 0,15% thạch 0,1% tinh bột Thanh trùng nồi hÊp ë 121 10 C 20 phót, pH m«i trờng sau trùng phải đạt 7,1 0,1 Khi chuẩn bị môi trờng dự trữ cần thay việc thêm thạch tinh bột việc tạo lớp dầu vaselin dày 1,5 - 2cm bề mặt môi trờng èng nghiƯm tríc trïng Khi dïng m«i trêng Kitt-Taroxi mà không thêm 0,15% thạch dầu Vaselin cần phủ lớp thạch nghèo hỗn hợp parafin dày - 1,5cm lên bề mặt môi trờng sau cấy xong Dùng để nuôi cấy vi sinh vật kỵ khí a nhiệt a ấm 5.21 Môi trêng Kitt-Taroxi cã Canxi cacbonat Cho mét Ýt canxi cacbonat vào đáy ống nghiệm bình cổ hẹp chuyên dïng cho m«i trêng Taroxi råi trïng b»ng khÝ nóng theo TCVN 4886-89 (ST SEV 3013-81) cho thêm vài miếng thịt gan rót canh thang thịt - pepton có glucoza vào chuẩn bị môi trờng Taroxi theo trình tự nh Dùng cho vi sinh vật kỵ khí để kiểm tra sản phẩm đồ hộp chua 5.22 M«i trêng Kitt-Taroxi chøa canxi cacbonat, níc chiÕt nấm men axit ascorbic Chuẩn bị nh môi trờng Kitt-Taroxi có canxi cacbonat nhng cần thêm 2g cao nấm men 10ml dịch chiết nấm men 20% vào canh thang thÞt - pepton tríc rãt canh thang thÞt pepton vào ống nghiệm Trớc phân tích cần thêm cách vô trùng vào môi trờng Kitt-Taroxi hoạt hoá có chứa canxi cacbonat cao nấm men mét lỵng axit ascorbic theo tû lƯ 100g lít môi trờng Dùng cho VSV kỵ khí a nhiệt a ấm 5.23 Môi trờng Robert Cho vào 1000ml níc cÊt mét lỵng gåm 2g nitrat kali, 2g kali dihydrophotphat, 1g thạch, 30g gelatin Để cho gelatin nở đun nóng bếp cách thủy đến gelatin thạch tan hết, cho thêm 25ml canh thang thịt - pepton vô trùng 10ml dung dịch 2,3,5 -Triphenyl - tetrazola clorua, sau ®ã ®iỊu chØnh pH 7,1 0,1 trùng 14 TCVN 5449-91 ngày liên tiếp 100 10C lần 20 phút lần 110 Môi trờng phải không màu 10C 15 phút Dùng để nuôi cấy C.perfringens 5.24 Môi trờng Smit- Lorenx Hoà tan cách đun nóng 5g glucoza, 10g pepton tripton hay triptoza (dipco), 20g thạch 950ml nớc Chuẩn bị riêng dung dịch tinh bột cách hoµ tan 5g tinh bét tan 50ml níc, sau chuyển vào môi trờng điều chỉnh pH 7,1 0,1 trïng ë 117 10C 20 Sư dơng để nuôi cấy vi sinh vật hiếu khí vi sinh vật a nhiệt, có khả tạo axit, kỵ khÝ t tiƯn 5.25 M«i trêng tinh bét - pepton đợc làm giàu triptophan Hoà tan 10g pepton vào nớc cho thêm 5g tinh bột hoà tan sẵn 50ml nớc, thêm nớc đến thể tích 1000ml điều chỉnh pH 6,2 0,1, lọc qua giấy lọc, sau thêm tiếp 500mg Triptophan, 5g glucoza, 20g thạch, đun nóng cho thạch tan hết Thêm 10ml dung dịch bromcrezola đỏ 0,04%, rót vào bình vô trùng vµ trïng ë 116 10C 20 Dïng để nuôi cấy VSV hiếu khí, tạo axit VSV a nhiệt, kỵ khí tuỳ tiện 5.26 Môi trờng sunfat lactat (đặc, sệt) Hoà tan 5g pepton lít nớc, cho thêm 4g cao nấm men 20ml dịch chiÕt nÊm men 20%, 1,5g Natri sunfat; 1,5g magiª sunfat, 3,5g natri lactat råi ®iỊu chØnh pH 7,2 - 7,4, sau để chuẩn bị môi trờng đặc cần thêm tiếp 20g thạch môi trờng sệt 1,5g thạch Đun nóng cho tan hết rót vào bình trïng ë 121 10C 20 tríc dïng, cần cho vào môi trờng nóng chảy lợng dung dịch muối Mor (muối sunphat kép sắt amoni «xit) theo tû lƯ 4mg/ml Tríc sư dơng, cần trùng dung dịch muối Mor 10% cách lọc qua màng lọc, sau cho cách vô trùng vào ống nghiệm - giọt Có thĨ thay thÕ natri lactat b»ng axit lactic ®· trung hoà natri hydroxit Dùng để nuôi cấy vi khuẩn kỵ khí, a nhiệt D nigrificans 5.27 Môi trờng cho Clotridium giµu dinh dìng (RCM) Cho vµo 1000ml níc mét lợng gồm 3g cao nấm men hay 15ml dung dịch chiÕt nÊm men 20%, 10g cao thÞt, 10g pepton, 1g tinh bét tan, 5g glucoza, 0,5g xistein hydro clorua, 5g natri clorua, 3g natri axetat hc 5g níc natri axetat, 0,5g thạch môi trờng sệt 1,5g thạch môi trờng đặc Đun nóng lắc liên tục môi trờng đến sôi, cho sôi đến thành phần tan hết, làm nguội dung dịch đến 50 600C đa pH đến 7,0 Rót mạnh môi trờng sệt vào ống nghiệm, môi trờng đặc rót vào bình, sau trùng 115 10C 20 phút Môi trờng sệt cần đợc hoạt hoá trớc sử dụng, môi trờng đặc sau đợc rót vào đĩa petri, cần đem sÊy Cho phÐp sư dơng 1000ml níc thÞt thay cho cao thịt nớc Dùng để nuôi cấy vi sinh vật kỵ khí a ấm 15 tiêu chuẩn rau PHơ LơC THAM KH¶O ST SEV 435-77 Thc thư Phơng pháp chuẩn bị thuốc thử dung dịch phụ ST SEV 804-77 Thc thư Híng dÉn chung viƯc tiÕn hµnh thư ST SEV 809-77 Thc thư vµ chất tinh khiết đặc biệt, thị hoá học Chuẩn bị dung dịch thị ST SEV 1052-78 Đơn vị đo lờng đại lợng vật lý 16 ... khí a ấm 15 tiêu chuẩn rau PHụ LụC THAM KHảO ST SEV 43 5-7 7 Thuốc thử Phơng pháp chuẩn bị thuốc thử dung dịch phụ ST SEV 80 4-7 7 Thc thư Híng dÉn chung viƯc tiÕn hµnh thư ST SEV 80 9-7 7 Thc thư... trêng dinh dìng theo TCVN 4886 - 89 (ST SEV 301 3-8 1) tiêu chuẩn hành quy định riêng khác 1.9 Bảo quản môi trờng dinh dỡng chuẩn bị nhiệt độ phòng không ngày 10C không tháng, tiêu chuẩn hành quy định... cổ hẹp trùng không khí theo TCVN 488 6-8 9 (ST SEV 301 3-8 1) Dùng để thêm vào môi trờng dinh dỡng loại dùng để kiểm tra sản phẩm chua 4.8 Axit ascorbic - dung dịch 5% Chuẩn bị theo quy định hành