Tiêu chuẩn Quốc gia TCVN 9522:2012 - EN 15851:2010. Tiêu chuẩn về Thực phẩm - xác định Aflatoxin B1 trong thực phẩm chế biến từ ngũ cốc dành cho trẻ sơ sinh và trẻ nhỏ - phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) có làm sạch bằng cột ái lực miễn nhiễm và detector huỳnh quang.
TIÊU CHUẨN QUỐC GIA TCVN 9522 : 2012 EN 15851 : 2010 THỰC PHẨM - XÁC ĐỊNH AFLATOXIN B1 TRONG THỰC PHẨM CHẾ BIẾN TỪ NGŨ CỐC DÀNH CHO TRẺ SƠ SINH VÀ TRẺ NHỎ - PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO (HPLC) CÓ LÀM SẠCH BẰNG CỘT ÁI LỰC MIỄN NHIỄM VÀ DETECTOR HUỲNH QUANG Foodstuffs - Determination of aflatoxin B1 in cereal based foods for infants and young children - HPLC menthod with immunoaffinity column cleanup and fluorescence detection Lời nói đầu TCVN 9522 : 2012 hoàn toàn tương đương với EN 15851 : 2010; TCVN 9522 : 2012 Ban kỹ thuật tiêu chuẩn quốc gia TCVN/TC/F13 Phương pháp phân tích lấy mẫu biên soạn, Tổng cục Tiêu chuẩn Đo lường Chất lượng đề nghị, Bộ Khoa học Công nghệ công bố THỰC PHẨM - XÁC ĐỊNH AFLATOXIN B1 TRONG THỰC PHẨM CHẾ BIẾN TỪ NGŨ CỐC DÀNH CHO TRẺ SƠ SINH VÀ TRẺ NHỎ - PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO (HPLC) CÓ LÀM SẠCH BẰNG CỘT ÁI LỰC MIỄN NHIỄM VÀ DETECTOR HUỲNH QUANG Foodstuffs - Determination of aflatoxin B1 in cereal based foods for infants and young children HPLC menthod with immunoaffinity column cleanup and fluorescence detection CẢNH BÁO - Khi áp dụng tiêu chuẩn liên quan đến vật liệu, thiết bị thao tác gây nguy hiểm Tiêu chuẩn không đưa tất vấn đề an toàn liên quan đến việc sử dụng chúng Người sử dụng tiêu chuẩn phải tự thiết lập thao tác an tồn thích hợp xác định khả áp dụng giới hạn quy định trước sử dụng tiêu chuẩn Phạm vi áp dụng Tiêu chuẩn quy định phương pháp xác định hàm lượng aflatoxin B thức ăn cho trẻ nhỏ sắc ký lỏng hiệu cao (HPLC) có làm cột lực miễn nhiễm detector huỳnh quang Phương pháp kiểm tra xác nhận nghiên cứu liên phòng thử nghiệm qua việc phân tích hai mẫu: nhiễm tự nhiên mẫu thêm chuẩn khoảng 0,7 μg/kg đến 0,18 μg/kg Thông tin thêm kiểm tra xác nhận, xem Điều Phụ lục B Tài liệu viện dẫn Các tài liệu viện dẫn sau cần thiết cho việc áp dụng tiêu chuẩn Đối với tài liệu viện dẫn ghi năm công bố áp dụng phiên nêu Đối với tài liệu viện dẫn không ghi năm công bố áp dụng phiên nhất, bao gồm sửa đổi, bổ sung (nếu có) TCVN 4851:1989 (ISO 3696:1987), Nước dùng để phân tích phòng thí nghiệm - Yêu cầu kỹ thuật phương pháp thử Nguyên tắc Phần mẫu thử chiết hỗn hợp metanol nước Dịch chiết lọc, pha loãng với nước muối dung dịch đệm phosphat (PBS) đến nồng độ dung môi quy định đưa lên cột lực miễn nhiễm có chứa kháng thể đặc hiệu với aflatoxin B1 Aflatoxin B1 tinh cô đặc cột rửa giải metanol khỏi kháng thể cột Aflatoxin B định lượng sắc kí lỏng hiệu cao pha đảo (RP-HPLC) có dẫn xuất sau cột (PCD) với brom hóa sau detector huỳnh quang Việc tạo dẫn xuất sau cột thực brom sinh từ phương pháp điện hóa pyridinium hydrobromua perbromua (PBPB) Thuốc thử 4.1 Yêu cầu chung Chỉ sử dụng thuốc thử loại tinh khiết phân tích nước đáp ứng yêu cầu loại quy định TCVN 4851 : 1989 (ISO 3696:1987) trừ có qui định khác Các dung môi phải đạt chất lượng sử dụng để phân tích sắc kí, trừ có quy định khác Có thể sử dụng dung dịch bán sẵn có đặc tính tương đương với loại liệt kê CẢNH BÁO: Việc thải dung môi không sử dụng phải tuân thủ quy định pháp luật môi trường Tổ chức quốc tế nghiên cứu ung thư (IARC) thông báo quy trình xử lý khử nhiễm chất thải phòng thử nghiệm, xem [4] 4.2 Khí nén heli tinh khiết 4.3 Nitơ 4.4 Dinatri hydro phosphat, Na2HPO4 khan Na2HPO4.12H2O 4.5 Kali bromua 4.6 Kali clorua 4.7 Kali dihydro phosphat, KH2PO4 4.8 Natri clorua 4.9 Natri hydroxit 4.10 Dung dịch axit clohydric, w(HCl) = 37 % phần khối lượng nước 4.11 Dung dịch axit clohydric, nồng độ mol c(HCl) = 0,1 mol/l Pha loãng 8,28 ml dung dịch axit clohydric (4.10) đến lít nước 4.12 Dung dịch natri hydroxit, c(NaOH) = 0,1 mol/l Hòa tan g natri hydoxit (4.9) lít nước 4.13 Dung dịch nước muối dung dịch đệm phosphat (PBS), c(NaCl) = 120 mmol/l, c(KCl) = 2,7 mmol/l, c(đệm phosphat) = 10 mmol/l, pH = 7,4 Hòa tan 8,0 g natri clorua (4.8), 1,2 g dinatri hydro phosphat khan 2,9 g Na 2HPO4.12H2O (4.4), 0,2 g kali dihydro phosphat (4.7) 0,2 g kali clorua (4.6) 900 ml nước Sau hòa tan, chỉnh pH đến 7,4 dung dịch axit clohydric (4.11) dung dịch natri hydroxit (4.12) cách thích hợp thêm nước đến lít Cách khác,có thể chuẩn bị dung dịch PBS với tỉ lệ tương đương từ nguyên liệu PBS có bán sẵn 4.14 Pyridinium hydrobromua perbromua (PBPB), [CAS: 39416-48-3] 4.15 Axetonitril CẢNH BÁO: Axetonitril chất độc trộn mẫu phải dùng máy nghiền trộn chống nổ đặt tủ hút Sau trộn, mẫu phải lọc bên tủ hút 4.16 Metanol, loại dùng cho HPLC 4.17 Metanol, loại kỹ thuật 4.18 Toluen 4.19 Dung môi chiết Trộn tám phần thể tích metanol (4.17) với hai phần thể tích nước 4.20 Axit nitric, c(HNO3) = mol/l 4.21 Pha động A dùng cho HPLC, để dùng với PBPB Trộn sáu phần thể tích nước với hai phần thể tích axetonitril (4.15) ba phần thể tích metanol (4.16) Khử khí pha động, ví dụ khí heli (4.2) 4.22 Pha động B dùng cho HPLC, để dùng với brom điều chế điện hóa Trộn sáu phần thể tích nước với hai phần thể tích axetonitril (4.15) ba phần thể tích metanol (4.16) Thêm 120 ml kali bromua (4.5) 350 μl axit nitric (4.20) lít pha động Khử khí pha động B, ví dụ khí heli (4.2) 4.23 Thuốc thử sau cột Hòa tan 50 mg PBPB (4.14) lít nước Được sử dụng với dung môi pha động A (4.21) Dung dịch bền đến bốn ngày bảo quản nơi tối nhiệt độ phòng 4.24 Hỗn hợp toluen axetonitril Trộn chín phần thể tích toluen (4.18) với phần thể tích axetonitril (4.15) 4.25 Cột lực miễn nhiễm Cột lực miễn nhiễm phải chứa kháng thể miễn nhiễm với aflatoxin B Cột phải có khả giữ đến 100 ng aflatoxin B1 phải cho độ thu hồi không nhỏ 80 % ng aflatoxin B sử dụng làm dung dịch chuẩn hỗn hợp gồm mười phần thể tích metanol 90 phần thể tích nước 4.26 Aflatoxin B1, dạng tinh thể dạng màng ampule dạng dung dịch aflatoxin B bán sẵn CẢNH BÁO: Aflatoxin bị phân hủy ánh sáng Bảo vệ khu vực thử nghiệm tránh ánh sáng tiến hành phân tích Có thể sử dụng giấy kim loại hấp thụ tia cực tím (UV) để phủ lên kính cửa sổ kết hợp với việc sử dụng ánh sáng dịu (không để ánh nắng chiếu trực tiếp) rèm chắn che mờ kết hợp với ánh sáng nhân tạo (có thể sử dụng đèn ống huỳnh quang) Bảo vệ dung dịch chứa aflatoxin tránh ánh sáng (giữ bình nơi tối, dùng giấy nhơm bình thủy tinh màu hổ phách) 4.27 Dung dịch gốc aflatoxin B1, c ≈ 10 μg/ml Chuẩn bị dung dịch aflatoxin B1 hỗn hợp toluen axetonitril (4.24) để có dung dịch nồng độ khối lượng khoảng 10 μg/ml Để xác định nồng độ khối lượng xác, dùng máy đo phổ UV (5.14) ghi đường hấp thụ bước sóng từ 330 nm đến 370 nm cuvet thạch anh cm chứa hỗn hợp toluen axetonitril (4.24) làm dung dịch đối chứng Nhận biết bước sóng cho độ hấp thụ cực đại (trong khoảng từ 330 nm đến 370 nm) Tính nồng độ khối lượng aflatoxin B1, ρafl, tính μg/ml, theo Cơng thức (1): afl A max M 100 b Amax độ hấp thụ cực đại xác định đường hấp thụ (bước sóng từ 330 nm đến 370 nm); M khối lượng mol aflatoxin B1 (M = 312 g/mol), tính g/mol; ε hệ số hấp thụ mol aflatoxin B1, hỗn hợp toluen axetonitril (4.24) (1 930 m 2/mol, xem [5]) tính mét vuông mol (m2/mol); b chiều dài đường quang cuvet thạch anh, tính centimet (cm) Bảo quản dung dịch tủ lạnh nhiệt độ khoảng -18 oC Để cho dung dịch đạt nhiệt độ phòng trước mở Dung dịch bảo quản cách bền 12 tháng Nếu bảo quản 12 tháng cần kiểm tra lại nồng độ dung dịch 4.28 Dung dịch chuẩn aflatoxin B1, ρ = 5,00 ng/ml Dùng pipet lấy lượng dung dịch gốc aflatoxin B1 (4.27) chứa xác 1,00 μg aflatoxin B1 cho vào bình định mức dung tích 200 ml hiệu chuẩn, thêm hỗn hợp toluen axetonitril (4.24) đến vạch Dung dịch chứa 5,00 ng/ml aflatoxin B1 Bọc kín bình chứa mẫu giấy nhơm bảo quản nhiệt độ oC Trước sử dụng, không mở giấy nhôm lượng chứa bình đạt đến nhiệt độ phòng để tránh dung dịch hấp thụ nước ngưng tụ Dung dịch bảo quản theo cách bền tuần 4.29 Dung dịch aflatoxin B1 để bổ sung vào mẫu, ρ = 2 μg/ml Dùng pipet lấy lượng dung dịch gốc aflatoxin B1 (4.27) chứa xác 20 μg aflatoxin B1 cho vào bình định mức dung tích 10 ml hiệu chuẩn Cho bay hỗn hợp dung dịch toluen axetonitril dòng nitơ nhiệt độ phòng Thêm metanol (4.16) đến vạch lắc mạnh Nồng độ dung dịch thêm chuẩn aflatoxin B1 μg/ml Bọc kín bình chứa mẫu giấy nhôm bảo quản nhiệt độ oC Trước sử dụng, không mở giấy nhơm lượng chứa bình đạt đến nhiệt độ phòng để tránh dung dịch hấp thụ nước ngưng tụ Dung dịch bảo quản theo cách bền tháng Thiết bị, dụng cụ CẢNH BÁO - Mọi dụng cụ thủy tinh tiếp xúc với dung dịch aflatoxin phải rửa dung dịch axit trước sử dụng Cần ý có nhiều máy rửa dụng cụ thử nghiệm Cách khác, ngâm dụng cụ thủy tinh tiếp xúc với dung dịch aflatoxin axit sulfuric (c = mol/l) (ví dụ 15 h) tráng kỹ (ít lần) nước để loại hết vết axit Dùng giấy pH để kiểm tra xem có axit hay không Việc xử lý cần thiết việc dùng dụng cụ khơng rửa axit làm thất aflatoxin Trong thực tế, việc xử lý cần thiết bình đáy tròn, bình định mức, ống đong, lọ ống nghiệm dùng cho dung dịch hiệu chuẩn dịch chiết cuối (đặc biệt lọ lấy mẫu tự động) pipet Pasteur, chúng dùng để chuyển dung dịch hiệu chuẩn dịch chiết Sử dụng thiết bị, dụng cụ thủy tinh phòng thử nghiệm thông thường cụ thể sau: 5.1 Cân phân tích, cân xác đến 0,0001 g 5.2 Cân phòng thử nghiệm, cân xác đến 0,01 g 5.3 Máy lắc dọc máy lắc ngang 5.4 Giấy lọc, ví dụ đường kính 24 cm, gấp nếp 5.5 Bình nón, dung tích 500 ml, có nắp vặn nắp thủy tinh 5.6 Màng lọc vi sợi thủy tinh, cỡ hạt giữ lại 1,6 μm nhỏ 5.7 Bình chứa, dung tích 75 ml có ống đầu nối để nối với cột lực miễn nhiễm (IAC) 5.8 Bơm tay, xyranh 20 ml có đầu nối nút cao su để nối với IAC 5.9 Bình định mức, dung tích ml, 10 ml, 20 ml, 150 ml 200 ml có sai số lớn 0,5 % 5.10 Bộ lọc xyranh dùng lần, cỡ lỗ 0,45 μm Trước sử dụng, cần kiểm tra xác nhận aflatoxin không bị thất q trình lọc (thử nghiệm độ thu hồi) CHÚ THÍCH: Các chất liệu lọc khác có khả giữ aflatoxin khác 5.11 Pipet định mức, dung tích ml 10 ml 5.12 Xyranh microlit hiệu chuẩn pipet microlit, có dung tích từ 25 μl đến 500 μl 5.13 Thiết bị HPLC, gồm có phận sau: 5.13.1 Hệ thống bơm mẫu, bơm, ví dụ 1000 μl Nên dùng bơm vòng Trong trường hợp dùng thể tích khác nhau, cần bảo đảm giới hạn phát (LOD) hệ thống ≤ 0,05 μg/kg (tỷ lệ tín hiệu/nhiễu = 3) giới hạn định lượng (LOQ) ≤ 0,1 μg/kg aflatoxin B1 Việc đo LOQ thực cách bơm nhiều lần (n = 10) dung dịch chuẩn aflatoxin B (nồng độ tương đương với mức nhiễm 0,1 μg/kg) Độ lệch chuẩn tương đối (RSD) tín hiệu thu khơng vượt 10 % Dữ liệu phải nêu báo cáo thử nghiệm 5.13.2 Bơm pha động, có khả trì tốc độ dòng thể tích 1,0 ml/min 5.13.3 Detector huỳnh quang, có lọc bước sóng kích thích λ = 360 nm lọc bước sóng phát xạ λ > 420 nm, loại tương đương (ví dụ: detector có ánh sáng đơn sắc chỉnh được) 5.13.4 Máy ghi, máy tích phân máy vi tính có hệ thống xử lý liệu 5.13.5 Cột tách HPLC pha đảo phân tích, ví dụ Cột C18 ODS-2 cột bảo vệ pha đảo tương ứng phù hợp Cột phải bảo đảm cho đường có độ phân giải tách pic aflatoxin B khỏi pic khác Mức tối đa pic chồng lên phải nhỏ 10 % chiều cao tối đa pic Do cần chỉnh (tốc độ) pha động đủ để phân giải đường Cần sử dụng tiền cột thích hợp 5.13.6 Hệ thống dẫn xuất sau cột, có PBPB (chỉ để sử dụng với pha động A, xem 4.21) Gồm có bơm HPLC khơng xung thứ hai, thể tích khoang chết hình chữ T, ống phản ứng polytetrafloetylen (PTFE) dài tối thiểu 45 cm đường kính 0,5 mm 5.13.7 Hệ thống dẫn xuất có brom điều chế điện hóa, ví dụ KOBRA cell® 1) (chỉ để sử dụng với pha động B, xem 4.22) Nên cài đặt detector bước sóng 365 nm (bước sóng kích thích) 435 nm (bước sóng phát xạ) băng thơng 18 nm 5.13.8 Máy khử khí (tùy chọn) 5.14 Máy đo phổ UV, có cuvet thạch anh phù hợp Cách tiến hành 6.1 Chiết mẫu Trộn kỹ mẫu trước lấy phần mẫu thử phân tích Cân 50 g phần mẫu thử thức ăn cho trẻ nhỏ (công thức dành cho trẻ sơ sinh), xác đến 0,1 g, cho vào bình nón dung tích 500 ml (5.5) Thêm g natri clorua (4.8) 250 ml dung môi chiết (4.19) Đầu tiên dùng tay lắc mạnh bình nón từ 15 s đến 30 s, sau dùng máy (5.3) lắc 30 Dùng giấy lọc gấp nếp (5.4) lọc dịch chiết dùng pipet (5.11) lấy 10 ml dịch lọc cho vào bình định mức hiệu chuẩn (5.9) dung tích 100 ml thêm PBS (4.13) đến vạch Lọc lại qua lọc vi sợi thủy tinh (5.6) chuyển 50 ml đến 100 ml dịch lọc vào bình hứng (5.7), bình nối với cột lực miễn nhiễm bảo ôn (xem 4.25) Chuyển dung dịch lên cột mô tả 6.2 6.2 Làm cột lực miễn nhiễm Có thể làm cột chân khơng với áp suất dương cho thể tích quy định chảy qua cột trọng lực Không vượt qua tốc độ dòng quy định tối đa Đặc biệt ý dùng hút chân không Chuẩn bị cột lực miễn nhiễm (4.25) theo hướng dẫn nhà sản xuất, ý khơng để cột bị khơ, có quy định Cột phải đạt đến nhiệt độ phòng trước bảo ôn Cho dịch chiết chạy qua cột tốc độ khoảng ml/min (khoảng giọt/giây) Không để tốc độ dòng vượt ml/min Rửa cột khoảng15 ml PBS (4.13), tiến hành vài lần lần khoảng ml với tốc độ tối đa ml/min sau làm khơ hút chân khơng nhẹ s đến 10 s cách dùng xyranh bơm khơng khí qua cột lực miễn nhiễm 10 s 6.3 Chuẩn bị dung dịch mẫu thử 1) KOBRA cell® tên thương mại sản phẩm phù hợp bán sẵn Thông tin đưa tạo thuận tiện cho người sử dụng tiêu chuẩn không ấn định phải sử dụng chúng Có thể sử dụng sản phẩm tương tự cho kết tương đương Rửa giải aflatoxin B1 cách chuyển 0,50 ml metanol (4.16) lên cột metanol qua cột trọng lực Thu lấy chất rửa giải vào bình định mức hiệu chuẩn dung tích ml (5.9) Chờ cho thêm 0,75 ml metanol (4.16) lên cột Thu lấy dịch chiết nhiều tốt cách ép khí qua cột Thêm nước vào bình đến vạch lắc kỹ Nếu dung dịch dùng trực tiếp để phân tích HPLC Nếu dung dịch khơng lọc dung dịch qua lọc sử dụng lần (5.10) trước bơm vào cột HPLC CHÚ THÍCH: Các phương pháp nạp mẫu lên cột lực miễn nhiễm có khác rửa cột rửa giải nhà sản xuất cột phải tuân thủ hướng dẫn nhà sản xuất kèm theo 6.4 Quy trình thêm chuẩn Để xác định độ thu hồi, tiến hành quy trình thêm chuẩn, dùng dung dịch thêm chuẩn metanol (4.29) Mức thêm chuẩn phải dải hiệu chuẩn (tốt giá trị tương ứng khoảng đường chuẩn) Chú ý không cho ml (5.11) dung mơi thêm chuẩn q trình làm bay sau xảy nơi tối kéo dài khoảng 0,5 h đến h Phân tích HPLC 7.1 Điều kiện vận hành HPLC Aflatoxin B1 tách sắc ký lỏng hiệu cao pha đảo đẳng dòng (RP-HPLC) nhiệt độ mơi trường có cột pha đảo (5.13.5) pha động phù hợp (xem 4.21 4.22) Thể tích bơm 1000 μl (để đảm bảo bơm vòng (xem 5.13.1) có độ chụm cao nhất, cần theo hướng dẫn nhà sản xuất van bơm HPLC cổng bơm) Đối với cột có đường kính 4,6 mm, tốc độ dòng pha động nên ml/min Có thể sử dụng kích thước cột khác, với điều kiện đảm bảo giới hạn định lượng yêu cầu Điều kiện phải kiểm chứng Vì vậy, tốc độ dòng điều chỉnh theo kích thước cột Aflatoxin B1 rửa giải với thời gian lưu khoảng 11 tách khỏi chất gây nhiễu, có Pha động chỉnh cách thêm nước, metanol (4.16) axetonitril (4.15) để phân giải pic tối đa hiệu Sắc đồ điển hình nêu Phụ lục A 7.2 Tạo dẫn xuất sau cột Khi dùng PBPB, lắp hệ thống tạo dẫn xuất sau cột (xem 5.13.6), sau vận hành theo thơng số sau đây: - tốc độ dòng pha động 1,0 ml/min; - tốc độ dòng thuốc thử tạo dẫn xuất 0,30 ml/min (tốc độ điều chỉnh theo tốc độ pha động) Khi sử dụng brom điều chế điện hóa (KOBRA cell ® 2)), lắp đặt cuvet vận hành theo hướng dẫn nhà sản xuất, sử dụng thông số sau đây: - tốc độ dòng pha động 1,0 ml/min; - cường độ dòng điện 100 μA 7.3 Chuẩn bị dung dịch hiệu chuẩn HPLC Dùng pipet lấy dung dịch aflatoxin B1 (4.28) với thể tích Bảng cho vào bình định mức dung tích 10 ml hiệu chuẩn, cho bay hỗn hợp dung dịch toluen axetonitril đến khơ dòng nitơ nhiệt độ phòng Cho vào bình 3,5 ml metanol (4.16), thêm nước đến 10 ml lắc kỹ để hòa tan aflatoxin B1 Các dung dịch bao trùm dải nồng độ aflatoxin B từ 0,05 μg/kg đến 0,35 μg/kg điều kiện tiêu chuẩn CHÚ THÍCH: Metanol nước trộn với thể tích chúng bị giảm Bảng - Chuẩn bị dung dịch hiệu chuẩn HPLC 2) KOBRA cell® tên thương mại sản phẩm phù hợp bán sẵn Thông tin đưa tạo thuận tiện cho người sử dụng tiêu chuẩn không ấn định phải sử dụng chúng Có thể sử dụng sản phẩm tương tự cho kết tương đương Dung dịch hiệu chuẩn HPLC Thể tích lấy từ dung dịch chuẩn Nồng độ khối lượng aflatoxin B1 dung dịch hiệu chuẩn aflatoxin B1, ρ = 5,00 ng/ml (xem 4.28) ng/ml μl 20 0,01 40 0,02 60 0,03 80 0,04 100 0,05 120 0,06 140 0,07 Việc chuẩn bị dung dịch hiệu chuẩn thực cách sử dụng pipet dụng cụ thủy tinh hiệu chuẩn sẵn có 7.4 Đường chuẩn Chuẩn bị đường chuẩn cách bơm 000 μl dung dịch hiệu chuẩn nêu Bảng vào hệ thống HPLC bắt đầu ngày phân tích Vẽ diện tích pic dựa vào khối lượng aflatoxin B bơm kiểm tra đường chuẩn độ tuyến tính Chuẩn bị đường chuẩn thích hợp trường hợp hàm lượng aflatoxin B mẫu nằm dải hiệu chuẩn Cách khác, dung dịch bơm để phân tích HPLC pha lỗng đến hàm lượng aflatoxin B thích hợp cho đường chuẩn thiết lập 7.5 Xác định aflatoxin B1 dung dịch mẫu thử Bơm phần dịch lỏng dung dịch mẫu thử (6.3) vào hệ thống HPLC, sử dụng điều kiện dùng chuẩn bị đường chuẩn 7.6 Khẳng định aflatoxin B1 Để khẳng định aflatoxin B1, tháo cột HPLC khỏi thiết bị brom hóa nối HPLC trực tiếp với detector huỳnh quang Tín hiệu aflatoxin B1 giảm đáng kể (10 lần nhiều hơn) tháo hệ thống tạo dẫn xuất khỏi HPLC Khơng ngắt dòng điện thiết bị brom hóa kết nối brom sót lại màng cuvet Cách khác: áp dụng kỹ thuật nhận biết đo khối phổ cách tiến hành phân tích sắc ký lỏng khối phổ (LC-MS) sắc ký lỏng với khối phổ hai lần (LC-MS/MS) Tính kết Xác định nồng độ khối lượng aflatoxin B1, biểu thị nanogam mililit (ng/ml) dung dịch bơm từ đường chuẩn Tính phần khối lượng, wafla, aflatoxin B1 biểu thị nanogam gam (ng/g), theo Công thức (2): w afla V1 V3 V2 ms afla (2) Trong đó: ρafla nồng độ aflatoxin B1 dung dịch thử bơm thu từ đường chuẩn, tính nanogam mililit (ng/ml); V1 thể tích dung mơi lấy để chiết (ở 250 ml), tính mililit (ml); V2 thể tích dịch chiết mẫu chưa pha loãng lấy để làm cột lực miễn nhiễm (trong trường hợp ml đến 10 ml), tính mililit (ml); V3 thể tích thu sau rửa giải khỏi cột lực miễn nhiễm (trong trường hợp ml), tính mililit (ml); ms khối lượng mẫu lấy để phân tích (trong trường hợp 50 g) tính gam (g) Độ chụm 9.1 Yêu cầu chung Các chi tiết phép thử liên phòng thử nghiệm độ chụm phương pháp nêu Bảng B.1 Các giá trị thu từ phép thử liên phòng thử nghiệm khơng áp dụng cho dải nồng độ dải nồng độ phân tích chất khác với dải nồng độ phân tích chất nêu Phụ lục B 9.2 Độ lặp lại Chênh lệch tuyệt đối hai kết thử nghiệm riêng rẽ thu vật liệu thử giống hệt nhau, người thực hiện, sử dụng thiết bị, thực khoảng thời gian ngắn nhất, không % giá trị giới hạn lặp lại Các giá trị thực phẩm dành cho trẻ nhỏ (thức ăn theo công thức dành cho trẻ sơ sinh) là: x = 0,10 μg/kg r = 0,011 μg/kg (đã bổ sung aflatoxin B1) x = 0,18 μg/kg r = 0,067 μg/kg (đã bổ sung aflatoxin B1) x = 0,07 μg/kg r = 0,028 μg/kg x = 0,09 μg/kg r = 0,020 μg/kg x = 0,17 μg/kg r = 0,059 μg/kg 9.3 Độ tái lập Chênh lệch tuyệt đối hai kết thử nghiệm riêng rẽ thu sử dụng phương pháp, tiến hành thử vật liệu thử giống hệt nhau, báo cáo từ hai phòng thử nghiệm khơng q % giá trị giới hạn tái lập R Giá trị thực phẩm dành cho trẻ nhỏ (thức ăn theo công thức dành cho trẻ sơ sinh) là: x = 0,10 μg/kg r = 0,034 μg/kg (đã bổ sung aflatoxin B1) x = 0,18 μg/kg r = 0,118 μg/kg (đã bổ sung aflatoxin B1) x = 0,07 μg/kg r = 0,048 μg/kg x = 0,09 μg/kg r = 0,022 μg/kg x = 0,17 μg/kg r = 0,109 μg/kg 10 Báo cáo thử nghiệm Báo cáo thử nghiệm phải nêu rõ: a) thông tin cần thiết để nhận biết đầy đủ mẫu (loại mẫu, nguồn gốc mẫu, ký hiệu); b) viện dẫn tiêu chuẩn này; c) ngày lấy mẫu quy trình lấy mẫu (nếu biết); d) ngày nhận mẫu; e) ngày thử nghiệm; f) kết thử nghiệm đơn vị biểu thị kết quả; g) điểm đặc biệt quan sát trình thử nghiệm; h) chi tiết thao tác khác với quy định tiêu chuẩn tùy chọn cố ảnh hưởng đến kết Phụ lục A (tham khảo) Sắc đồ điển hình CHÚ DẪN: X thời gian (phút) Y huỳnh quang (mV) aflatoxin B1 Các điều kiện vận hành: Cột LC-18 Supelcosil® 3), đường kính 4,6 mm, dài 25 cm Tốc độ dòng ml/min Pha động HPLC pha động B, xem 4.22 Nhiệt độ cột Nhiệt độ phòng Thể tích bơm 1000 μl Dẫn xuất Brom điều chế phương pháp điện hóa Detector 18 nm Huỳnh quang, bước sóng kích thích 365 nm, bước sóng phát xạ 435 nm, dải thơng Hình A.1 - Sắc đồ điển hình aflatoxin B1, thức ăn theo công thức dành cho trẻ sơ sinh sau làm cột lực miễn nhiễm (mức nhiễm aflatoxin B 0,1 μg/kg) 3) Supelcosil cell® tên thương mại sản phẩm phù hợp bán sẵn Thông tin đưa tạo thuận tiện cho người sử dụng tiêu chuẩn không ấn định phải sử dụng chúng Có thể sử dụng sản phẩm tương tự cho kết tương đương Phụ lục B (tham khảo) Dữ liệu độ chụm Dữ liệu sau (xem Bảng B.1) thu nghiên cứu liên phòng thử nghiệm Chương trình Tiêu chuẩn, đo lường thử nghiệm [6] Ủy ban châu Âu tổ chức, thực phù hợp với TCVN 69102 (ISO 5725-2) [1], TCVN 6910-4 (ISO 5725-4) [2] TCVN 6910-6 (ISO 5725-6) [3] Mẫu thử thức ăn dành cho trẻ nhỏ (thức ăn theo công thức dành cho trẻ sơ sinh), gồm mẫu nhiễm aflatoxin B tự nhiên mẫu thêm chuẩn có aflatoxin B1 Giới hạn định lượng phương pháp xác định 0,05 μg/kg, tùy thuộc vào thiết bị sử dụng Bảng B.1 - Dữ liệu độ chụm nghiên cứu liên phòng thử nghiệm thực phẩm dành cho trẻ nhỏ (thức ăn theo công thức dành cho trẻ sơ sinh) 3a 4a 5a 1999 1999 1999 1999 1999 Số lượng phòng thử nghiệm 14 14 14 14 14 Số lượng mẫu kép 1 1 Số lượng phòng thử nghiệm lại sau trừ ngoại lệ 11 14 14 11 13 Số lượng ngoại lệ (phòng thử nghiệm) 0 Số lượng kết chấp nhận 11 14 14 11 13 Giá trị trung bình, x , μg/kg 0,10 0,18 0,07 0,09 0,17 Độ lệch chuẩn lặp lại, sr, μg/kg 0,004 0,024 0,010 0,007 0,021 3,5 13 14 12 Giới hạn lặp lại, r[r = 2,8 x sr], μg/kg 0,011 0,067 0,028 0,020 0,059 Độ lệch chuẩn tái lập, sR, μg/kg 0,012 0,042 0,017 0,008 0,039 12 23 23 23 0,034 0,118 0,048 0,022 0,109 Độ thu hồi, % 101 92 - - - Giá trị HorRat, theo [7] 0,19 0,39 0,34 0,14 0,39 Giá trị HorRatR, theo [8] 0,55 1,05 1,01 0,41 1,05 Mẫu Năm tiến hành phép thử liên phòng thử nghiệm Độ lệch chuẩn tương đối lặp lại, RSDr, % Độ lệch chuẩn tương đối tái lập, RSDR, % Giới hạn lặp lại, R[R = 2,8 x sR], μg/kg a Mẫu nhiễm tự nhiên THƯ MỤC TÀI LIỆU THAM KHẢO [1] TCVN 6910-2 : 2001 (ISO 5725-2 : 1994) Độ xác (độ độ chụm) phương pháp đo kết đo - Phần 2: Phương pháp xác định độ lặp lại độ tái lập phương pháp đo tiêu chuẩn [2] TCVN 6910-4 : 2001 (ISO 5725-4 : 1994) Độ xác (độ độ chụm) phương pháp đo kết đo - Phần 4: Phương pháp xác định độ phương pháp đo tiêu chuẩn [3] TCVN 6910-6 : 2002 (ISO 5725-6 : 1994) Độ xác (độ độ chụm) phương pháp đo kết đo - Phần 6: Sử dụng giá trị độ xác thực tế [4] Castegnaro M.; Barek J.; Fremy J.M; Lafontaine M; Sansone Ε.B.; Telling G.M., Laboratory decontamination and destruction of carcinogens in laboratory wastes: some mycotoxins IARC Scientific Publication No 113, International Agency for Research on Cancer, Lyon (France), 1991, p.63 [5] Nesheim, S.; Trucksess, M.W.; Page, S.W., Molar absorptivities of aflatoxin B-1, B-2, G(1), and G(2) in acetonitrile, methanol, and toluene-acetonitrile (9+1) (modification of AOAC official method 971.22): Collaborative study, Journal of AOAC international, 1999, 82 (2), p 251-258 [6] Stroka, J.; Anklam, Ε.; Joerissen, U.; Gilbert, J., Immunoaffinity column clean-up with liquid chromatography using post-column bromination for the determination of aflatoxin B in baby food: Collaborative study Journal of AOAC International, 2001, 84, p 1116 [7] Horwitz, W.; Albert, R., The Horwitz Ratio (HorRat): A useful Index of Method Performance with Respect to Precision Journal of AOAC International, 2006, 89, p 1095-1109 [8] Thompson M., Recent trends in inter-laboratory precision at ppb and sub-ppb concentrations in relation to fitness for purpose criteria in proficiency testing, Analyst, 2000, 125, p 385-386 ... nghiệm Chương trình Tiêu chuẩn, đo lường thử nghiệm [6] Ủy ban châu Âu tổ chức, thực phù hợp với TCVN 69102 (ISO 572 5-2 ) [1], TCVN 691 0-4 (ISO 572 5-4 ) [2] TCVN 691 0-6 (ISO 572 5-6 ) [3] Mẫu thử thức... pháp đo kết đo - Phần 2: Phương pháp xác định độ lặp lại độ tái lập phương pháp đo tiêu chuẩn [2] TCVN 691 0-4 : 2001 (ISO 572 5-4 : 1994) Độ xác (độ độ chụm) phương pháp đo kết đo - Phần 4: Phương... International, 2006, 89, p 109 5-1 109 [8] Thompson M., Recent trends in inter-laboratory precision at ppb and sub-ppb concentrations in relation to fitness for purpose criteria in proficiency testing, Analyst,