Tiêu chuẩn Quốc gia TCVN 10693:2015 - EN 1140:1994

Tiêu chuẩn Quốc gia TCVN 10693:2015 về Nước rau, quả - Xác định hàm lượng D-glucose và D-fructose sử dụng enzym - Phương pháp đo phổ qui định phương pháp đo phổ NADPH sử dụng enzym để xác định hàm lượng D-glucose và D-fructose trong nước rau, quả và các sản phẩm liên quan.

TIÊU CHUẨN QUỐC GIA TCVN 10693:2015 EN 1140:1994 NƯỚC RAU, QUẢ - XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG D-GLUCOSE VÀ D-FRUCTOSE SỬ DỤNG ENZYM PHƯƠNG PHÁP ĐO PHỔ NADPH Fruit and vegetable juices - Enzymatic determination of D-glucose and D-fructose content - NADPH spectrometric method Lời nói đầu TCVN 10693:2015 hồn tồn tương đương EN 1140:1994; TCVN 10693:2015 Ban kỹ thuật tiêu chuẩn quốc gia TCVN/TC/F10 Rau sản phẩm rau biên soạn, Tổng cục Tiêu chuẩn Đo lường Chất lượng thẩm định, Bộ Khoa học Công nghệ công bố NƯỚC RAU, QUẢ - XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG D-GLUCOSE VÀ D-FRUCTOSE SỬ DỤNG ENZYM PHƯƠNG PHÁP ĐO PHỔ NADPH Fruit and vegetable juices - Enzymatic determination of D-glucose and D-fructose content NADPH spectrometric method Phạm vi áp dụng Tiêu chuẩn qui định phương pháp đo phổ NADPH sử dụng enzym để xác định hàm lượng Dglucose D-fructose nước rau, sản phẩm liên quan Tài liệu viện dẫn Các tài liệu viện dẫn sau cần thiết cho việc áp dụng tiêu chuẩn Đối với tài liệu viện dẫn ghi năm cơng bố áp dụng phiên nêu Đối với tài liệu viện dẫn không ghi năm cơng bố áp dụng phiên nhất, bao gồm sửa đổi, bổ sung (nếu có) TCVN 4851:1989 (ISO 3696:1987), Nước dùng để phân tích phòng thí nghiệm - u cầu kỹ thuật phương pháp thử ISO 5725:1986*), Precision of test methods - Determination of repeatability and reproducibility for a standard test method by inter-laboratory tests (Độ chụm phương pháp thử - Xác định độ lặp lại độ tái lập phương pháp thử chuẩn phép thử liên phòng thử nghiệm) Ký hiệu chữ viết tắt Trong tiêu chuẩn sử dụng ký hiệu chữ viết tắt sau: ATP Adenosin-5' -triphosphat; ADP Adenosin-5'-diphosphat; NADP β-Nicotinamid-adenin-dinucleotidephosphat; NADPH β-Nicotinamid-adenin-dinucleotidephosphat (dạng khử); G-6-P Glucose-6-phosphat; F-6-P Fructose 6-phosphat; HK Hexokinase (EC1) 2.7.1.1); G6P-DH Glucose-6-phosphat dehydrogenase (EC1) 1.1.1.49); PGI Phosphoglucose-isomerase (EC1) 5.3.1.9); IU đơn vị quốc tế (IU) hoạt độ enzym, xúc tác để chuyển hóa µmol chất 25 °C; c nồng độ chất; nồng độ khối lượng Nguyên tắc phản ứng *) ISO 5725:1986, hủy thay tiêu chuẩn ISO 5725 (gồm phần) chấp nhận thành tiêu chuẩn TCVN 6910 (ISO 5725) 1) Hiệp hội enzym (EC): hệ thống phân loại Sổ tay enzym, Springer, Berlin 1969 4.1 Nguyên tắc D-glucose D-fructose có mẫu thử pha lỗng phosphorin hóa vị trí cacbon số (C-6) phản ứng xúc tác enzym bao gồm ATP HK Trong phản ứng trùng hợp, glucose 6-phosphat chuyển thành 6-phosphogluconat có mặt NADP, phản ứng xúc tác enzym G-6-P-DH lượng NADPH tương đương với lượng D-glucose tạo thành (4.2) có mặt mẫu thử Hàm lượng D-fructose xác định cách cho phản ứng tiếp PGI xúc tác đồng phân hóa F-6-P thành G-6-P (4.3) Định lượng NAPDH tạo thành hàm lượng D-glucose và/hoặc D-fructose đo phổ 4.2 Phản ứng phép xác định D-glucose HK D-glucose + ATP G-6-P + NADP+ G-6-P + ADP G6P - DH 6-phosphogluconat + NADPH + H+ 4.3 Phản ứng phép xác định D-fructose HK D-fructose + ATP F-6-P PGI F-6-P + ADP G-6-P G-6-P + NADP+ G6P - DH 6-phosphogluconat + NADPH + H+ Thuốc thử 5.1 Yêu cầu chung Chỉ sử dụng thuốc thử loại tinh khiết phân tích nước đạt loại TCVN 4851:1989 (ISO 3696:1987) 5.2 Dung dịch đệm triethanolamin, pH = 7,6 Hòa tan 14,0 g triethanolamin clohydric 0,25 g magie sulfat ngậm bảy phân tử nước (MgSO 4.7H2O) 80 ml nước, điều chỉnh đến pH 7,6 dùng khoảng ml dung dịch natri hydroxit, c(NaOH) = mol/l thêm nước đến 100 ml Khi bảo quản °C dung dịch bền tuần 5.3 Dung dịch NADP Hòa tan 60 mg muối dinatri β-Nicotinamid-adeninedinucletoid phosphat (β-NADP-Na2) ml nước Khi bảo quản °C dung dịch bền tuần 5.4 Dung dịch ATP Hòa tan 300 mg muối dinatri adenosin-5'-triphosphat ngậm ba phân tử nước (ATP-Na 2H2.3H2O) 300 mg natri hydro cacbonat (NaHCO3) ml nước Khi bảo quản °C dung dịch bền tuần 5.5 Huyền phù enzym HK/G6P- DH Tạo huyền phù hexokinase, (HK) = mg/ml, khoảng 280 IU/ml (D-glucose làm chất với có mặt ATP) glucose-6-phosphat-dehydrogenase (G6P-DH) = mg/ml, khoảng 140 IU/ml với glucose 6-phosphat làm chất dung dịch amoni sulfat, c[(NH4)2SO4] = 3,2 mol/l Khi bảo quản °C dung dịch huyền phù bền năm 5.6 Huyền phù enzym PGI Tạo huyền phù phosphoglucose isomerase, (PGI) = mg/ml, khoảng 700 IU/ml (với fructose 6phosphat làm chất) dung dịch amoni sulfat, c[(NH4)2SO4] = 3,2 mol/l Khi bảo quản °C dung dịch huyền phù bền năm Thiết bị, dụng cụ Sử dụng thiết bị dụng cụ thơng thường phòng thử nghiệm thiết bị, dụng cụ sau: 6.1 Pipet dùng cho enzym, chia vạch dọc theo thân, có đầu phân phối dài khơng chia vạch 6.2 Pipet, có độ xác tương đương với 6.1 (có thể dùng thay cho 6.1), ví dụ: pipet mao quản dịch chuyển dương 6.3 Cuvet, thủy tinh chất dẻo, chiều dài đường quang 10 mm hấp thụ khơng đáng kể bước sóng 334 nm, 340 nm 365 nm 6.4 Máy đo phổ vạch, có đèn thủy ngân lọc để đo bước sóng 334 nm 365 nm 6.5 Máy đo phổ, (bước sóng thay đổi được) để đo bước sóng 340 nm (có thể dùng thay 6.4) Cách tiến hành 7.1 Chuẩn bị mẫu thử Thông thường mẫu không cần xử lý trước phép phân tích theo phương pháp nên dựa vào thể tích, kết biểu thị lít mẫu Đối với mẫu đặc, tiến hành phân tích dựa vào thể tích, sau pha lỗng đến tỷ trọng tương đối biết Trong trường hợp này, tỷ trọng tương đối phải nêu rõ Dựa vào lượng mẫu cân hệ số pha lỗng, kết biểu thị kg mẫu Đối với sản phẩm có độ nhớt cao và/hoặc có chứa lượng thịt cao thường tiến hành phép xác định theo khối lượng mẫu thử Trộn kỹ nước đục Pha loãng mẫu thử cho nồng độ D-glucose D-glucose + D-fructose khoảng từ 0,1 g/l đến 1,0 g/l Dung dịch dùng để xác định kể dung dịch có màu đậm 7.2 Qui trình thử nghiệm 7.2.1 Yêu cầu chung Phép xác định phải tiến hành nhiệt độ không đổi khoảng từ 20 °C đến 25 °C Sử dụng nhiệt độ không đổi dải từ 25 °C đến 37 °C thu kết tương tự NADPH hấp thụ tối đa bước sóng 340 nm Khi sử dụng máy đo phổ có bước sóng thay đổi đo độ hấp thụ tối đa Khi sử dụng đèn thủy ngân sử dụng máy đo dải phổ để đo bước sóng 334 nm 365 nm Không dùng pipet vạch để lấy dung dịch Các dung dịch enzym, coenzym dung dịch đệm bổ sung từ pipet tự động thích hợp Dùng pipet dùng cho enzym (6.1) loại tương đương (6.2) để lấy dung dịch mẫu Phép xác định tiến hành sử dụng kít thử kết hợp có bán sẵn thị trường Nếu chất cần xác định có bán sẵn dạng tinh khiết phù hợp, nên dùng chất làm dung dịch chuẩn 7.2.2 Dung dịch mẫu trắng Dùng pipet lấy 1,00 ml dung dịch đệm (5.2), 0,10 ml dung dịch NADP (5.3), 0,10 ml dung dịch ATP (5.4), 2,00 ml nước cho vào cuvet Trộn sau khoảng min, đọc độ hấp thụ (A1) dung dịch so với khơng khí (khơng có cuvet đường quang) 7.2.3 Dung dịch mẫu thử Dùng pipet lấy 1,00 ml dung dịch đệm (5.2), 0,10 ml dung dịch NADP (5.3), 0,10 ml dung dịch ATP (5.4), 0,10 ml mẫu thử 1,90 ml nước cho vào cuvet Trộn sau khoảng min, đọc độ hấp thụ (A1) dung dịch so với khơng khí (khơng có cuvet đường quang) 7.2.4 Phản ứng enzym định lượng Thực qui trình sau cho dung dịch (7.2.2 7.2.3) riêng rẽ: Thêm 0,02 ml huyền phù enzym [HK/G6P-DH; (5.5)] Trộn đều, đợi phản ứng kết thúc (10 đến 15 min) đọc độ hấp thụ (A2) dung dịch Kiểm tra việc kết thúc phản ứng cách đọc độ hấp thụ A2 lần Nếu phản ứng chưa kết thúc sau 15 min, ngoại suy độ hấp thụ ngược trở lại thời điểm bổ sung huyền phù enzym (HK/G6P-DH) (5.5) Sau đó, thêm 0,02 ml huyền phù enzym (PGI) (5.6) Trộn đều, đợi phản ứng kết thúc (10 đến 15 min) đọc độ hấp thụ (A3) dung dịch Kiểm tra việc kết thúc phản ứng cách đọc độ hấp thụ A3 lần Nếu phản ứng chưa kết thúc sau 15 độ hấp thụ tăng đều, ngoại suy độ hấp thụ ngược trở lại thời điểm bổ sung huyền phù enzym (PGI) (5.6) Tính kết Dựa vào phản ứng, thực phép xác định, có tỷ lệ tuyến tính lượng NADPH tạo thành (do chênh lệch độ hấp thụ ΔA) nồng độ D-glucose D-fructose ΔAD-glucose = (A2 - A1)mẫu - (A2 - A1)mẫu trắng ΔAD-fructose = (A3 - A2)mẫu - (A3 - A2)mẫu trắng Việc tính nồng độ chất dung dịch pha loãng phương pháp hấp thụ nguyên tử dựa theo định luật Beer-Lambert Hàm lượng D-glucose và/hoặc D-fructose, tính gam lit mẫu, tính theo Công thức sau: M x V1 x F x x V2 x 1000 Trong đó: x A M khối lượng phân tử glucose fructose = 180,16 gam mol (g/mol); V1 tổng thể tích dung dịch cuvet, tính mililit (ml); V2 thể tích dung dịch mẫu thử bổ sung vào cuvet, tính mililit (ml); F hệ số pha lỗng dung dịch mẫu (xem 7.1); đường quang cuvet, tính xentimet (cm); hệ số tắt NADPH; 340 nm = 6,3 ℓ mmol -1 cm-1; Hg 365 nm = 3,5 ℓ mmol -1 cm-1; Hg 334 nm = 6,18 ℓ mmol -1 cm-1 Nếu thể tích cho 7.2.2 7.2.3 khơng thay đổi hàm lượng D-glucose D-fructose mẫu, tính gam/lit, tính theo Cơng thức sau: (D-glucose) = 5,801 x F x ΔAD-glucose (D-fructose) = 5,837 x F x ΔAD-fructose Khi sử dụng kít thử có bán sẵn hệ số (5,801 5,837) cơng thức khác tổng thể tích phân tích khác (V1) Trong phép tính kết quả, cần tính đến hệ số pha lỗng mối liên hệ với khối lượng thể tích Nếu mẫu đặc pha lỗng đến nồng độ đơn (nồng độ ban đầu) phải ghi lại tỷ trọng tương đối mẫu có nồng độ đơn Báo cáo hàm lượng D-glucose D-fructose, gam lít, đến chữ số thập phân Độ chụm Chi tiết phép thử liên phòng thử nghiệm độ chụm phương pháp nêu Phụ lục A Các giá trị thu từ phép thử liên phòng thử nghiệm khơng áp dụng cho dải nồng độ mẫu khác với dải nồng độ mẫu nêu Phụ lục A 9.1 Độ lặp lại Chênh lệch tuyệt đối hai kết thử nghiệm đơn lẻ thu tiến hành thử vật liệu thử giống hệt người phân tích, sử dụng thiết bị, khoảng thời gian ngắn, không % trường hợp lớn giới hạn lặp lại r Các giá trị là: glucose: r = 0,42 + 0,027 g/l fructose: r = 0,15 + 0,033 g/l Trong đó: hàm lượng đo được, trung bình hai kết thử đơn lẻ 9.2 Độ tái lập Chênh lệch tuyệt đối hai kết thử nghiệm đơn lẻ thu tiến hành thử vật liệu thử giống hệt nhau, hai phòng thử nghiệm phân tích, khơng q % trường hợp lớn giới hạn tái lập R Các giá trị là: glucose: R = 1,00 + 0,042 g/l fructose: R = 1,05 + 0,045 g/l Trong đó: hàm lượng đo được, trung bình hai kết thử đơn lẻ 10 Báo cáo thử nghiệm Báo cáo thử nghiệm phải bao gồm: - thông tin cần thiết để nhận biết mẫu (loại mẫu, nguồn gốc mẫu, ký hiệu); - viện dẫn tiêu chuẩn này; - ngày kiểu quy trình lấy mẫu (nếu có thể); - ngày nhận mẫu; - ngày thử nghiệm; - kết thử nghiệm đơn vị biểu thị; - độ lặp lại phương pháp đánh giá; - điểm cụ thể quan sát trình thử nghiệm; - thao tác không qui định tiêu chuẩn này, xem tùy chọn, với tình bất thường ảnh hưởng đến kết thử nghiệm Phụ lục A (Tham khảo) Các kết thống kê phép thử liên phòng thử nghiệm Các thơng số sau thu phép thử liên phòng thử nghiệm phù hợp với ISO 5725:1986 (Đối với tài liệu để đánh giá phương pháp, xem Thư mục Tài liệu tham khảo) Phép thử Viện Max von Pettenkofer Tổ chức Y tế liên bang, Cục hóa thực phẩm, Berlin, Đức tổ chức thực Năm tiến hành phép thử liên phòng thử nghiệm 1983 Số lượng phòng thử nghiệm 22 Số lượng mẫu Bảng A.1 - Glucose Mẫu A B C D Số lượng phòng thử nghiệm giữ lại sau trừ ngoại lệ 19 17 15 16 Số lượng phòng thử nghiệm ngoại lệ Số lượng kết chấp nhận 105 94 80 84 Giá trị trung bình ( x ) (g/l) 26,2 34,9 53,5 79,9 Độ lệch chuẩn lặp lại (sr) (g/l) 0,389 0,562 0,539 0,959 Độ lệch chuẩn tương đối lặp lại (RSDr) [%] 1,48 1,61 1,01 1,20 Giới hạn lặp lại (r) (g/l) 1,1 1,6 1,5 2,7 Độ lệch chuẩn tái lập (sR) (g/l) 0,754 1,003 1,140 1,403 Độ lệch chuẩn tương đối tái lập (RSDR), % 2,88 2,87 2,13 1,75 Giới hạn tái lập (R) (g/l) 2,1 2,8 3,2 3,9 THƯ MỤC TÀI LIỆU THAM KHẢO [1] Determination of glucose and fructose: Enzymatic method: No 55, 1985 - In: Analyses [Collection]/International Federation of Fruit Juice Producers - Loose-leaf edition, as of 1989, - Zug: Swiss Fruit Union [2] Untersuchung von Lebensmitteln: Bestimmung von Glucose und Fructose in Fruchtsaften: L31.0012, 1980-05 [Food Analysis; Determination of glucose and fructose in fruit juices: L31.00-12, 1980-05 In: Amtliche Sammlung von Untersuchungsverfahren nach § 35 LMBG: Verfahren zur Probenahme und Untersuchung von Lebensmitteln, Tabakerzeugnissen, kosmetischen Mitteln und Bedarfsgegenstanden/Bundesgesundheitsamt [In: Collection of official methods under article 35 of the German Federal Foods Act: Methods of sampling and analysis of foods, tobacco products, cosmetics and commodity goods/Federal Health Office] - Loseblattausgabe, Stand 31.12.1991, Bd.l [Loose-leaf edition, as of 1991-12-31, Vol.1] - Berlin, Koln: Beuth Verlag GmbH  ... D-fructose + ATP F-6-P PGI F-6-P + ADP G-6-P G-6-P + NADP+ G6P - DH 6-phosphogluconat + NADPH + H+ Thuốc thử 5.1 Yêu cầu chung Chỉ sử dụng thuốc thử loại tinh khiết phân tích nước đạt loại TCVN. .. lượng D-glucose và/hoặc D-fructose đo phổ 4.2 Phản ứng phép xác định D-glucose HK D-glucose + ATP G-6-P + NADP+ G-6-P + ADP G6P - DH 6-phosphogluconat + NADPH + H+ 4.3 Phản ứng phép xác định D-fructose... tác enzym G-6-P-DH lượng NADPH tương đương với lượng D-glucose tạo thành (4.2) có mặt mẫu thử Hàm lượng D-fructose xác định cách cho phản ứng tiếp PGI xúc tác đồng phân hóa F-6-P thành G-6-P (4.3)