Tiêu chuẩn Quốc gia TCVN 10529:2014 qui định phương pháp xác định lượng protein chiết xuất được với nước trong găng tay cao su thiên nhiên (NR) để sử dụng trong y tế. Phương pháp có khả năng thích hợp để xác định protein chiết xuất được đối với các vật phẩm khác được làm từ latex cao su thiên nhiên; tuy nhiên các quy trình và thời gian chiết tách chưa được phê chuẩn và sẽ khác nhau với dạng vật phẩm được thử nghiệm.
TIÊU CHUẨN QUỐC GIA TCVN 10529:2014 ISO 12243:2003 WITH AMENDMENT 1:2012 GĂNG TAY Y TẾ LÀM TỪ LATEX CAO SU THIÊN NHIÊN - XÁC ĐỊNH PROTEIN CHIẾT XUẤT ĐƯỢC VỚI NƯỚC BẰNG PHƯƠNG PHÁP LOWRY CẢI BIẾN Medical gloves made from natural rubber latex - Determination of water-extractable protein using the modified Lowry method Lời nói đầu TCVN 10529:2014 hồn toàn tương đương ISO 12243:2003 Sửa đổi 1:2012 TCVN 10529:2014 Ban kỹ thuật tiêu chuẩn quốc gia TCVN/TC45 Cao su thiên nhiên biên soạn, Tổng cục Tiêu chuẩn Đo lường Chất lượng đề nghị, Bộ Khoa học Công nghệ công bố Lời giới thiệu Đã có vấn đề phản ứng dị ứng số người sử dụng găng tay y tế sản xuất từ latex cao su thiên nhiên TCVN 10529 (ISO 12243) quy định phương pháp xác định protein chiết xuất với nước găng tay y tế GĂNG TAY Y TẾ LÀM TỪ LATEX CAO SU THIÊN NHIÊN - XÁC ĐỊNH PROTEIN CHIẾT XUẤT ĐƯỢC VỚI NƯỚC BẰNG PHƯƠNG PHÁP LOWRY CẢI BIẾN Medical gloves made from natural rubber latex - Determination of water-extractable protein using the modified Lowry method CẢNH BÁO: Người sử dụng tiêu chuẩn phải có kinh nghiệm làm việc phòng thử nghiệm thông thường Tiêu chuẩn không đề cập đến tất vấn đề an toàn liên quan sử dụng Người sử dụng tiêu chuẩn phải có trách nhiệm thiết lập biện pháp an toàn bảo vệ sức khỏe phù hợp với quy định Phạm vi áp dụng Tiêu chuẩn qui định phương pháp xác định lượng protein chiết xuất với nước găng tay cao su thiên nhiên (NR) để sử dụng y tế Phương pháp có khả thích hợp để xác định protein chiết xuất vật phẩm khác làm từ latex cao su thiên nhiên; nhiên quy trình thời gian chiết tách chưa phê chuẩn khác với dạng vật phẩm thử nghiệm Đã có phương pháp xác định protein đặc thù cho găng tay y tế khác (xem Phụ lục C) chúng khả áp dụng chung Tiêu chuẩn liên quan đến phương pháp thử nghiệm, không liên quan đến việc lấy mẫu không đề cập đến biện pháp an toàn giá trị nhận yêu cầu việc ghi nhãn Nguyên lý Các protein tan nước chiết vào dung dịch đệm sau kết tủa để cô đặc tách chúng khỏi chất tan khác nước gây nhiễu cho việc xác định (xem Phụ lục A D) Các protein kết tủa hòa tan lại định lượng cách đo màu phương pháp Lowry cải biến sử dụng protein tiêu chuẩn ( Nguyên lý phương pháp, xem tài liệu tham khảo [1] Thư mục tài liệu tham khảo) Thuật ngữ định nghĩa Trong tiêu chuẩn này, áp dụng thuật ngữ định nghĩa sau: 3.1 Hệ số nồng độ (concentration factor) F Mức độ mà dịch chiết protein cô kết tủa, tiếp tái hòa tan thể tích nhỏ dung dịch natri hydroxyt CHÚ THÍCH: Theo đó, protein cm dung dịch kết tủa tái hòa tan thành 0,8 cm 3, hệ số nồng độ F 4/0,8 (= 5) 3.2 Protein (protein) Các protein hợp chất tương tự protein (ví dụ polypeptit) xuất vật phẩm làm từ latex cao su thiên nhiên chiết xuất nước 3.3 Phương pháp Lowry cải biến (modified Lowry method) Sự cải biến phương pháp thử nghiệm Lowry gốc, bao gồm việc kết tủa tách protein để giảm lượng hợp chất khác chiết xuất với nước ảnh hưởng đến phép xác định Thiết bị, dụng cụ Nếu khơng có quy định khác, tất dụng cụ thí nghiệm ( nghĩa bình, ống, v.v ) phải làm polypropylen polyetylen CHÚ THÍCH: Dụng cụ polypropylen polyetylen sử dụng nhiều dụng cụ thủy tinh để giảm thiểu hấp phụ bề mặt Phương pháp xác định khả liên kết protein mô tả Phụ lục B 4.1 Găng tay protein, làm từ latex cao su tổng hợp chất dẻo mà khơng có vật liệu bột vật liệu khác có khả truyền sang mẫu thử nghiệm dung dịch chiết 4.2 Máy ly tâm, có khả đạt gia tốc 60 000 m/s (6 000 x g) CHÚ THÍCH: Nên dùng máy ly tâm có làm lạnh nhiệt độ tăng đáng kể ly tâm thực thời gian dài 4.3 Ống ly tâm, dung tích 200 cm3, 50 cm3, 10 cm3, cm3 1,5 cm3, làm polypropylen polyetylen (nếu có sẵn) với khả liên kết protein thấp 4.4 Bình nón, dung tích 250 cm3 4.5 Micropipet 4.6 Máy lắc ống nghiệm, vận hành từ Hz đến Hz 4.7 Máy trộn Vortex bồn siêu âm 4.8 Màng lọc dùng lần, có khả liên kết protein thấp kích cỡ lỗ tối đa 0,45 µm 4.9 Kẹp, để bịt găng tay kín nước chiết xuất Các cặp nhơm bọc cao su xốp, bắt vít với nhau, làm chất dẻo dài 170 mm sử dụng thẩm tách máu 4.10 Thiết bị quang phổ 4.10.1 Máy đo quang phổ, với cuvet dùng lần polystyren (cuvet thạch anh sử dụng yêu cầu phải làm cẩn thận) Hoặc 4.10.2 Bộ đọc vi đĩa, với đĩa vi chuẩn độ (phiến vi) đáy phẳng làm polystyren có 96 lỗ dung tích từ 0,25 cm3 đến 0,5 cm3 CHÚ THÍCH: Tốt lỗ có dung tích 0,5 cm Lỗ có dung tích nhỏ sử dụng làm giảm độ nhạy thử nghiệm 4.11 Cân, có độ xác đến 0,0001 g 4.15 Máy lắc Thuốc thử Trong thử nghiệm, sử dụng thuốc thử cấp tinh khiết phân tích nước cất nước khử ion 5.1 Dung dịch nhuộm: Bromophenol xanh (blue), muối natri, chuẩn bị cách hòa tan 0,1 g xanh bromophenol L nước Dung dịch sử dụng bốn tuần 5.2 Dung dịch chiết: Dung dịch đệm có khả trì độ pH 7,4 ± 0,4 suốt q trình chiết CHÚ THÍCH 1: Chất đệm thích hợp bao gồm dung dịch muối đệm phosphat (PBS) (0,01 mol/L) dung dịch muối hemisodium acid N-tris-(hydroxymetyl)-metyl-2-amino-etanesulfonic (TES) (0,1 mol/L) Chất đệm PBS chuẩn bị cách hòa tan viên PBS nước cất theo hướng dẫn nhà sản xuất Trong trường hợp, cuối giai đoạn chiết không đạt pH 7,4 ± 0,4, cần phải sử dụng dung dịch đệm đặc Dung dịch TES chuẩn bị cách hòa tan 24 g TES 500 cm3 nước định mức đến L CHÚ THÍCH 2: Các viên PBS TES ln có sẵn 5.3 Thuốc thử protein cho phương pháp Lowry cải biến 5.3.1 Thuốc thử A: Đồng xitrat kiềm, chuẩn bị hàng ngày cách trộn 10 phần thuốc thử C với 0,2 phần thuốc thử D Đồng tartrat kiềm coi phù hợp phải chuẩn bị hàng ngày Vật liệu có sẵn kit chứa chất bảo quản khơng cơng bố , ảnh hưởng đến việc xác định 5.3.2 Thuốc thử B: Pha loãng thuốc thử Folin chuẩn bị cách pha loãng 72 cm thuốc thử Folin N với 28 cm3 nước CHÚ THÍCH: Thuốc thử Folin N sẵn có thị trường Nồng độ số thuốc thử Folin thương mại khơng phải N 5.3.3 Thuốc thử C: Dung dịch g natri cacbonat 100 cm nước 5.3.4 Thuốc thử D: Dung dịch chứa 1,5 g đồng sulfat g natri xitrat 100 cm3 nước 5.3.5 Dung dịch natri hydroxit, c(NaOH) = 0,2 mol/L 5.3.6 Dung dịch natri deoxycholat (DOC), chuẩn bị cách hòa tan 0,15 g natri deoxycholat nước dùng nước pha loãng đến 100 cm3 Bảo quản dung dịch tủ lạnh, loại bỏ sau tuần 5.3.7 Dung dịch axit tricloacetic (TCA), chuẩn bị cách pha loãng 72 g axit tricloacetic đến 100 cm3 với nước lắc kỹ Bảo quản dung dịch tủ lạnh Dung dịch ổn định thời gian dài 5.3.8 Dung dịch axit phosphotungstic (PTA), chuẩn bị cách pha loãng 72 g axit phosphotungstic vào 100 cm3 nước khuấy kỹ Bảo quản dung dịch tủ lạnh, loại bỏ dung dịch sau tuần Có thể thuận tiện trộn trước dung dịch TCA PTA theo thể tích bổ sung chúng cách đồng thời 7.4.2 Hỗn hợp phải chuẩn bị ngày khơng có liệu thời gian lưu trữ 5.4 Dung dịch gốc protein lòng trắng trứng Việc sử dụng lòng trắng trứng chuẩn bị cách cất phân đoạn amoni sulfat kết tinh nhiều lần pH 4,5 Chuẩn bị dung dịch từ 100 mg lòng trắng trứng 100 cm dung dịch chiết thích hợp (5.2) để có nồng độ mg/cm3 Lọc dung dịch qua màng lọc có liên kết protein thấp với kích cỡ lỗ 0,45 µm nhỏ xác định độ hấp thụ 280 nm sử dụng máy đo quang phổ UV với cuvet có chiều dài đường đo cm sử dụng dung dịch chiết ( 5.2) dung dịch trắng Chia độ hấp thụ cho 0,641) để thu nồng độ xác dung dịch gốc lòng trắng trứng Dung dịch bền ngày bảo quản nhiệt độ không lớn °C tháng đông lạnh ± 10 °C Việc rã đông cần gia nhiệt đến 45 °C 15 1) Giá trị độ chụm hệ số “tiêu hủy” lòng trắng trứng phụ thuộc vào xác nhận CHÚ THÍCH: Thời gian làm lạnh có tính tích lũy Để tránh việc rã đông đông lạnh lặp lặp lại, khuyến cáo dung dịch gốc phải bảo quản theo phần nhỏ dạng lỏng, phần đủ để xây dựng đường chuẩn đơn để sử dụng quy trình kiểm tra xác nhận (xem Phụ lục A) Cách tiến hành 6.1 Nguyên lý Quy trình bao gồm việc chiết xuất tồn găng tay, sau làm đặc dịch chiết Nồng độ protein dịch chiết xác định cách tham chiếu đến đường chuẩn tiêu chuẩn xây dựng cách sử dụng dung dịch loãng dung dịch gốc protein (5.4 6.3) đặc theo cách Kỹ thuật phân tích người phân tích phải kiểm tra xác nhận trước theo qui định Phụ lục A Việc chiết xuất tiến hành ba lần cách sử dụng ba găng tay ba đôi găng tay từ lô định trước; việc làm cô đặc dịch chiết phép xác định tiến hành riêng rẽ 6.2 Quy trình chiết xuất 6.2.1 Tổng quan Toàn bề mặt găng tay phải tiếp xúc với dung dịch chiết nhiệt độ 25 °C ± °C thời gian 120 ± Hai quy trình chiết xuất cho phép, gọi quy trình “găng cắt” quy trình “găng lồng găng” Trong trường hợp có tranh chấp, quy trình “găng cắt” ưu tiên quy trình dễ thực thời gian Trong quy trình “găng lồng găng”, có lỗ kim châm phải loại bỏ mẫu lặp lại quy trình chiết với đơi găng Quy trình sử dụng phải ghi lại báo cáo thử nghiệm tất mẫu mẫu cho trước phải chiết quy trình Việc chiết xuất phải tiến hành ba lần thực phép xác định riêng rẽ dịch chiết Sử dụng găng tay khơng có protein (5.1) để xử lý mẫu găng tay sử dụng để chiết xuất CHÚ THÍCH: Tần suất lấy mẫu găng tay trái phải không thuộc phạm vi áp dụng tiêu chuẩn 6.2.2 Quy trình A - Quy trình găng cắt 6.2.2.1 Báo cáo khối lượng găng tay (m) với độ xác khơng nhỏ 0,001 g 6.2.2.2 Cắt găng tay dọc theo đường biên Để thuận lợi cho việc chiết xuất, cắt găng tay thành mẩu nhỏ (nhưng xem 6.2.2.3) 6.2.2.3 Nếu kết ghi lại tính microgam đơn vị diện tích găng tay (ví dụ μg/dm2), xác định diện tích bề mặt găng tay sau: Cắt mẩu hình chữ nhật từ mặt sau găng tay với kích thước khoảng 0,5 dm × 0,5 dm đo kích thước xác đến 0,01 dm Tính diện tích A1 Xác định khối lượng (mp) mẩu hình chữ nhật xác đến 0,001 g Tổng diện tích bề mặt A hai mặt găng tay cho A = 2A1 x m/mp 6.2.2.4 Chuyển tất mẩu găng tay vào bình tam giác thích hợp (4.4) 6.2.2.5 Thêm xác thể tích V dung dịch chiết (5.2) Tổng thể tích V dung dịch chiết sử dụng phải nằm khoảng từ 10 cm đến 15 cm3 gam găng tay đủ để phủ kín mẫu 6.2.2.6 Chiết mẫu thử nghiệm nhiệt độ 25 °C ± °C 120 ± min, lắc lần đầu 15 s lần sau theo khoảng thời gian khơng lớn 30 Nếu có thể, tốt lắc chậm liên tục tốc độ khoảng 200 vòng/min 6.2.2.7 Gạn dịch chiết loại bỏ vật chất dạng hạt cách ly tâm tốc độ tối thiểu 20 000 m/s2 (2000 x g) 15 Dịch chiết thường sử dụng lưu giữ thời gian nhiều 48 h nhiệt độ không lớn °C đông lạnh thời gian nhiều 15 ngày nhiệt độ -10 °C 6.2.3 Quy trình B - Quy trình “găng lồng găng” 6.2.3.1 Lấy hai găng tay xác định khối lượng với độ xác khơng nhỏ 0,001 g (m1 m2) Đánh dấu găng tay điểm cổ cách đầu ngón tay 20 cm Lấy găng tay lồng vào bên cho chúng khít với (việc thực cách thuận lợi cách sử dụng que để lồng ngón vào ngón cái, v.v ; nhiên, cách thức để thực việc không quan trọng miễn găng tay thao tác mức tối thiểu) Lặp lại q trình với hai đơi găng tay có kích thước 6.2.3.2 Rót lượng dung dịch nhuộm vừa đủ (5.1) vào găng tay để làm đầy tất ngón tay Rót 25 cm3 dung dịch chiết (5.2) vào găng tay găng tay Thao tác nhẹ nhàng để loại bỏ bọt khí đóng kín găng tay kẹp ( 4.9) vị trí đánh dấu 20 cm 6.2.3.3 Cố định găng tay vào máy lắc lắc tốc độ khoảng 200 vòng/min 120 ± nhiệt độ 25 °C ± °C Nếu xuất giọt chất lỏng nhỏ bề mặt ngoài, khả lỗ châm kim găng tay ngoài, loại bỏ mẫu lặp lại việc chiết xuất với đôi găng tay 6.2.3.4 Loại bỏ kẹp thận trọng tách găng tay, cẩn thận không làm bẩn dịch chiết dung dịch nhuộm găng tay bên 6.2.3.5 Gạn dịch chiết từ găng tay ngồi vào ống ly tâm ( 4.3) Nếu có màu xanh (blue), biểu lộ lỗ châm kim nhiễm bẩn chéo Trong trường hợp vậy, loại bỏ dung dịch lặp lại việc chiết với đôi găng tay Làm dịch chiết cách quay ly tâm tốc độ tối thiểu 20 000 m/s2 (2 000 × g) 15 Dịch chiết thường sử dụng lưu giữ thời gian nhiều 48 h nhiệt độ không lớn °C đông lạnh thời gian nhiều 15 ngày nhiệt độ ± 10 °C 6.2.3.6 Cắt hai găng tay điểm đánh dấu 20 cm để loại bỏ cổ găng Loại bỏ chất lỏng dư thừa từ cổ găng cách thấm để khô nhiệt độ phòng Xác định khối lượng cổ găng (mc) với độ xác khơng nhỏ 0,001 g Tính khối lượng trung bình (ms) phần găng tay chiết: ms = (m1 + m2 - mc)/2, đó: m1 m2 khối lượng ban đầu găng tay mc tổng khối lượng phần cổ găng không chiết 6.2.3.7 Nếu kết ghi lại tính microgam đơn vị diện tích găng tay (ví dụ μg/dm2), tiến hành theo 6.2.2.3 6.3 Chuẩn bị dung dịch protein tiêu chuẩn Chuẩn bị dung dịch protein tiêu chuẩn cách làm loãng dung dịch protein gốc (5.4) dung dịch chiết (5.2), để tạo dung dịch với nồng độ, ví dụ : 40 μg/cm3, 20 μg/cm3, 10 μg/cm3, μg/cm3, 2,5 μg/cm3 Sử dụng dung dịch chiết (5.2) dung dịch trắng Các dung dịch ổn định ngày làm lạnh (xem Chú thích) CHÚ THÍCH: Các nồng độ thấp chuẩn bị dễ dàng cách pha loãng hai lần liên tiếp dung dịch đặc thích hợp Các dung dịch tiêu chuẩn phải bao trùm khoảng rộng giá trị nồng độ biết nồng độ dung dịch gốc xác định xác (xem 5.4) Các dung dịch cần thiết cho việc kiểm tra quy trình mơ tả Phụ lục A 6.4 Kết tủa cô đặc protein 6.4.1 Qui định chung Thực phép xác định riêng rẽ nhiệt độ 25 °C ± °C 6.4.2 Chuyển xác cm3 loại dung dịch chiết (5.2) (là dung dịch trắng), dung dịch protein tiêu chuẩn (xem 6.3) dịch chiết ba găng tay vào ống ly tâm dung tích 10 cm3 (4.3) Thêm 0,4 cm3 DOC (5.3.6), trộn để yên 10 min, sau thêm 0,4 cm3 TCA (5.3.7) trộn Thêm 0,4 cm3 PTA (5.3.8), trộn (xem Chú thích) để n 30 CHÚ THÍCH: Phải lấy lượng cân cho đảm bảo đủ dùng cho cuvet sử dụng phân tích Nếu đọc vi đĩa sử dụng, khối lượng giảm theo tỷ lệ Nếu gồm có số lượng mẫu lớn, điều quan trọng đặc biệt bảo đảm ống ly tâm nhận dạng rõ ràng 6.4.3 Quay ly tâm tốc độ tối thiểu 60 000 m/s2 (6 000 x g) thời gian 30 Điều quan trọng protein ép chặt mức Nếu cần thiết, kéo dài thời gian ly tâm Gạn chất lỏng bề mặt làm khô cách úp ngược ống ly tâm tờ giấy thấm Thêm 0,8 cm3 dung dịch natri hydroxit nồng độ 0,2 mol/L (5.3.5) vào ống, kể mẫu trắng, để tái hòa tan protein kết tủa Sử dụng máy trộn vortex bồn siêu âm ( 4.7) cần Bảo đảm protein tái hòa tan hồn tồn thành dung dịch Nếu số kết tủa protein, đong lượng định dung dịch natri hydroxit để bổ sung tiếp, nhiều 3,2 cm3 (nghĩa tổng cộng 4,0 cm3) Phải sử dụng lượng natri hydroxit dung dịch Lượng dung dịch natri hydroxit khuyên dùng (0,8 cm3) cho hệ số nồng độ F Nếu không sử dụng lượng natri hydroxit mẫu, dẫn đến F mẫu khác nhau: F= Dung dịch protein tái hòa tan thường phải sử dụng ngày Nếu phép xác định thực ngay, viên protein lưu giữ thời gian khơng q 24 h nhiệt độ không °C Trong trường hợp khơng đạt hòa tan hồn toàn sau thêm 4,0 cm3 NaOH, quay ly tâm tốc độ 60 000 m/s2 (6 000 x g) 15 dung dịch protein 6.5 Sự phát triển màu 6.5.1 Bật máy đo quang phổ điều chỉnh “0” theo hướng dẫn nhà sản xuất 6.5.2 Thêm 0,3 cm3 thuốc thử A (5.3.1) vào 0,8 cm3 dung dịch protein tái hòa tan, kể mẫu trắng từ 6.4.2, khuấy kỹ Thêm 0,1 cm thuốc thử B (5.3.2), trộn, để n 15 khơng lâu h trước đo độ hấp thụ CHÚ THÍCH: Chỉ 0,8 cm3 dung dịch protein tái hòa tan sử dụng để tạo màu, không cần quan tâm đến thể tích cuối dung dịch protein tái hòa tan Nếu kết tủa xuất để yên có mặt số chất gây nhiễu, quay ly tâm để có dung dịch suốt trước đo màu 6.5.3 Phép đo quang phổ Chuyển dung dịch chuẩn bị 6.5.2 vào cuvet đo độ hấp thụ so với mẫu trắng bước sóng 750 nm (ưu tiên) bước sóng cụ thể nằm khoảng từ 600 nm đến 750 nm thời gian h với bổ sung thuốc thử B Để có kết quán, mức thời gian, thiết bị bước sóng chọn phải quán Xác định hàm lượng protein, tính microgam gam găng tay, mơ tả 7.3 Hoặc 6.5.4 Phép đo sử dụng đọc vi đĩa Chuyển 0,49 cm3 dung dịch chuẩn bị 6.5.2 vào đĩa vi chuẩn độ (phiến vi) đáy phẳng (xem 4.10.2) đo độ hấp thụ so với mẫu trắng bước sóng cụ thể nằm khoảng từ 600 nm đến 750 nm thời gian h với bổ sung thuốc thử B Xác định hàm lượng protein, tính microgam gam găng tay, mơ tả 7.3 Tính kết 7.1 Đường chuẩn Chuẩn bị đường chuẩn cách vẽ đồ thị nồng độ dung dịch protein ban đầu (xem 6.3) phụ thuộc vào mức hấp thụ chúng sau kết tủa tái hòa tan (xem 6.5.3 6.5.4) CHÚ THÍCH: Một số protein bị q trình đặc Phương pháp giả định mẫu chuẩn mẫu thử nghiệm lượng phần trăm đặc 7.2 Tính nồng độ Xác định nồng độ c mẫu ba mẫu chiết, tính microgam centimét khối dung dịch chiết, cách sử dụng độ hấp thụ để đọc trực tiếp từ đường chuẩn Báo cáo giá trị trung bình CHÚ THÍCH: Trong trường hợp đường chuẩn khơng tuyến tính, giá trị tính hồi quy đa thức Việc sử dụng phần mềm máy tính thương mại để điều chỉnh đường chuẩn tính nồng độ chưa biết thiết thực 7.3 Tính hàm lượng protein chiết xuất 7.3.1 Quy trình A - Quy trình găng cắt Hàm lượng protein chiết xuất E, tính microgam gam găng tay, theo công thức sau: V c E= F m V thể tích dung dịch chiết sử dụng, tính centimét khối; c protein nồng độ dung dịch protein tái hòa tan, tính microgam centimet khối; F hệ số nồng độ; m khối lượng, tính gam, găng tay CHÚ THÍCH: Giá trị 5/F trừ cần phải sử dụng lượng natri hydroxyt khác với lượng khuyên dùng = xem dẫn giải 7.4.3 Protein chiết xuất từ găng tay, tính microgam, nhận cách nhân kết nhận với m: Protein chiết xuất từ găng tay = E x m 7.3.2 Quy trình B — Quy trình “găng lồng găng” Hàm lượng protein chiết xuất E, tính microgam gam găng tay, theo công thức sau: V c F ms E= V thể tích dung dịch chiết sử dụng, tính centimét khối; c protein nồng độ dung dịch protein tái hòa tan, tính microgam centimet khối; F hệ số nồng độ; ms khối lượng, tính gam, mẫu găng tay chiết (xem 6.2.3.6) CHÚ THÍCH: Giá trị 5/F trừ cần phải sử dụng lượng natri hydroxyt khác với lượng khuyên dùng - xem dẫn giải 7.4.3 Protein chiết xuất từ găng tay, tính microgam, nhận cách nhân kết nhận với m: Protein chiết xuất từ găng tay = E x m đó: m khối lượng, tính gam, găng tay [= (m1 + m2)/2] m1 m2 khối lượng đôi găng tay ban đầu 7.3.3 Chuyển đổi thành khối lượng diện tích bề mặt đơn vị Các qui định hành yêu cầu kết biểu thị theo thuật ngữ diện tích bề mặt, ví dụ: microgam đơn vị diện tích Chuyển đổi thành giá trị sau: V c Protein chiết xuất tính μg/dm2 = F A đó: A tổng diện tích bề mặt găng tay (xem 6.2.2.3), tính decimet vng Báo cáo thử nghiệm Báo cáo thử nghiệm phải bao gồm thơng tin sau đây: a) viện dẫn tiêu chuẩn này; b) thơng tin đầy đủ để nhận biết hồn tồn mẫu thử nghiệm; c) ngày kết thử nghiệm; d) xuất xứ nhận dạng protein tiêu chuẩn sử dụng; e) chất chất đệm sử dụng: f) theo quy trình chiết xuất (quy trình A quy trình B); g) tên địa phòng thử nghiệm thử nghiệm, khác với nhà sản xuất găng tay; h) ứng xử bất thường ghi nhận sai khác với quy trình quy định trước PHỤ LỤC A (qui định) Kiểm tra xác nhận A.1 Tổng quan Các hóa chất chất hoạt động bề mặt, chất xúc tiến chất chống oxi hóa bổ sung vào latex cao su thiên nhiên q trình sản xuất găng tay ảnh hưởng đến tiến triển màu tiến hành xác định; số hóa chất làm giảm tiến triển màu chất khác làm tăng Mục đích q trình đặc protein cách kết tủa tái hòa tan để làm protein cách làm cho khỏi chất gây nhiễu Điều khơng tránh khỏi trình lượng protein định bị giả thiết mục đích thử nghiệm, dung dịch protein tiêu chuẩn dịch chiết mẫu thử nghiệm bị số phần trăm Để bảo đảm việc xử lý thực với thất tối thiểu, trình độ kỹ thuật phòng thử nghiệm thao tác viên phải kiểm tra xác nhận cách xác định mức thu hồi phục thực tế đạt kết tủa tái hòa tan protein tiêu chuẩn, mô tả A.2 Nguyên lý Các dung dịch protein tiêu chuẩn cô đặc hai lần dung dịch thu tạo thành sau thử nghiệm hai lần để đánh giá tính ổn định công việc người vận hành A.3 Cách tiến hành A.3.1 Chuẩn bị dung dịch protein tiêu chuẩn không bị kết tủa Sử dụng protein dung dịch gốc (6.4), chuẩn bị dung dịch loãng 0,2 mol/l dung dịch natri hydroxyt (6.3.5) dung dịch protein tiêu chuẩn có nồng độ 80 μg/cm3, 40 μg/cm3, 20 μg/cm3, 10pg/cm3 μg/cm3 A.3.2 Chuẩn bị dung dịch protein tiêu chuẩn để kết tủa Tương tự, sử dụng dung dịch protein gốc (6.4), chuẩn bị dung dịch loãng sử dụng dung dịch chiết (6.2) dung dịch protein tiêu chuẩn có nồng độ 40 μg/cm3, 20 μg/cm3, 10 μg/cm3, μg/cm3 2,5 μg/cm3 A.3.3 Kết tủa cô đặc protein Thực quy trình hai lần Sử dụng quy trình mơ tả 7.4, kết tủa dung dịch protein tiêu chuẩn làm loãng dung dịch chiết (xem A.3.2) Tái hòa tan protein kết tủa natri hydroxyt 0,2 mol/l (6.3.5) để thu hai dung dịch nồng độ có hệ số nồng độ F = A.3.4 Sự tiến triển màu phép xác định Thực quy trình hai lần Sử dụng quy trình mơ tả 7.5, thực phép xác định dung dịch protein không bị kết tủa (xem A.3.1) dung dịch dung dịch thu từ protein kết tủa tái hòa tan (xem A.3.3) A.3.5 Tính tốn Chuẩn bị đường chuẩn cách vẽ đồ thị mức hấp thụ trung bình dung dịch protein tiêu chuẩn không kết tủa phụ thuộc vào nồng độ (xem A.3.1) sử dụng đường chuẩn hình thành để xác định nồng độ c dung dịch protein sau kết tủa cô đặc (xem A.3.3) Giá trị c trung bình nhóm gồm bốn phép xác định (mỗi protein tiêu chuẩn kết tủa hai lần phần cô đặc thu được thử nghiệm hai lần để nhận bốn kết protein tiêu chuẩn) A.3.6 Phần trăm thu hồi Phần trăm thu hồi c/F, biểu thị phần trăm nồng độ dung dịch protein tiêu chuẩn ban đầu (xem A.3.2) trước kết tủa Vẽ đồ thị phần trăm thu hồi phụ thuộc vào nồng độ ban đầu VÍ DỤ: Protein từ dung dịch loãng ban đầu 50 μg/cm3 kết tủa tái hòa tan để có nồng độ 5x (F = 5) c xác định 200 μg/cm3 Như c/F = 40 μg/cm3 chênh lệch với nồng độ ban đầu 50 μg/cm3 phản ánh hao hụt vật liệu trình Việc diễn đạt giá trị dạng phần trăm giá trị thực, (40/50) x 100 = 80 %, đưa phần trăm thu hồi A.3.7 Yêu cầu Phần trăm thu hồi không nhỏ 80 % mức nồng độ nhỏ 100 μg/cm3 Nếu không đạt giá trị này, lặp lại quy trình, đặc biệt ý vào kỹ thuật Kỹ thuật người thao tác phải thẩm định trước thực xác định mẫu găng tay PHỤ LỤC B (qui định) Sự hấp phụ protein ống polypropylen polyetylen B.1 Tổng quan Các ống polypropylen polyetylen sử dụng suốt q trình có khả liên kết protein thấp Để kiểm tra hấp phụ thực tế, phương pháp sau thích hợp Thử nghiệm phải bắt đầu hồn thành khơng q ngày B.2 Cách tiến hành B.2.1 Chuẩn bị 50 cm3 dung dịch tiêu chuẩn chứa 10 μg/cm3 lòng trắng trứng cách làm loãng dung dịch tiêu chuẩn (6.4) với dung dịch chiết (6.2) B.2.2 Chuyển 10 cm3 phần thử nghiệm dung dịch lòng trắng trứng chuẩn bị B.2.1 vào ống hai ống polypropylen ống polyetylen (5.3) lắc ống máy lắc ống nghiệm (5.6), bảo đảm toàn bề mặt ống làm ướt Sau 30 min, chuyển dung dịch đến hai ống lắc chúng Lặp lại quy trình phần 10 cm3 tiếp xúc với năm ống Bảo quản dung dịch thử nghiệm lại B.2.3 Xác định nồng độ protein dung dịch tiêu chuẩn chuẩn bị theo B.2.1 hai dung dịch thử nghiệm chuẩn bị theo B.2.2 ba lần sử dụng phương pháp nêu 7.5 B.3 Tính tốn Tính khối lượng trung bình lòng trắng trứng hấp phụ ống, tính microgam, theo cơng thức: 10 Lòng trắng trứng hấp phụ ống = R T = x (R- T) đó: R giá trị trung bình ba phép xác định hàm lượng lòng trắng trứngcủa dung dịch tiêu chuẩn; T hàm lượng lòng trắng trứng trung bình dung dịch thử nghiệm sau chuyển qua ống (nghĩa trung bình sáu giá trị) B.4 Yêu cầu Giá trị nhận albumin hấp phụ phải nhỏ 10 μg/ống Nếu giá trị nhận vượt giá trị này, ống khơng thích hợp phép xác định PHỤ LỤC C (tham khảo) Các phương pháp phân tích khác C.1 Tổng quan Phải thừa nhận việc xác định protein chiết xuất nước theo phương pháp Lowry cải biến có khó khăn cố hữu Các chất hoạt động bề mặt số chất xúc tiến làm nhiễu q trình xác định, dẫn đến làm sai kết cao hoặc, đôi khi, làm sai kết thấp Tiêu chuẩn này, bao gồm quy định việc kết tủa tái hòa tan protein chiết được, nhằm mục đích giảm nhẹ vấn đề này, điều khơng phải lúc thỏa đáng, đặc biệt với số chất xúc tiến[4] Cũng có khả thất kết tủa thu hồi phân đoạn protein, quy trình phân tích kết hợp với việc kiểm tra kỹ thuật nhằm mục đích bù đắp thất thoát Một phương pháp khả quan để giảm vấn đề gây nhiễu "trừ nền” (xem Phụ lục D) Còn có phương pháp khác để lập và/hoặc xác định protein sử dụng phương pháp để kiểm tra chéo trường hợp kết nhận theo tiêu chuẩn bị nghi sai Hai số phương pháp mô tả vắn tắt Một phương pháp sở cho phương pháp phân tích ưu việt tương lai, chúng có thiếu sót C.2 ELISA (Thử nghiệm hấp thụ miễn dịch liên kết enzym (Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay)) Phương pháp phụ thuộc vào phản ứng protein đặc thù với kháng thể đặc trưng kết hợp với tác động dị ứng Các vấn đề với phương pháp tương đối chậm dù đặc trưng Cách lý tưởng để tiến hành thử nghiệm cho dòng protein với phân tử lượng đặc trưng phản ứng với kháng thể đơn bào (tức đơn dòng) Tuy nhiên, nhiều phân đoạn protein gây nên tác động dị ứng phân lập từ latex cao su thiên nhiên cô đặc, tất người dễ nhạy cảm phản ứng với phân đoạn giống Do vậy, người biểu lộ phản ứng ít, người khác nghiêm trọng Cách tiếp cận ngược lại, nghĩa sử dụng hỗn hợp không đồng kháng thể từ serum gộp lại, khơng thỏa mãn, tỷ lệ với dòng protein có phân tử lượng khác khơng thiết phải cố định Tỷ lệ khác khác biệt mức độ dễ dàng việc chiết xuất mà khác biệt dòng cao su khác Điều hàm chứa cần phải kết hợp kết phản ứng kháng thể khác với dòng protein có phân tử lượng khác C.3 HPLC (Sắc ký lỏng hiệu cao) Phương pháp thực cách sử dụng phân tách gel protein chiết được, chúng thủy phân xác định dạng axit amin Trong hai trường hợp, kỹ thuật chậm tốn Phương pháp tách tất chất gây nhiễu dòng protein có phân tử lượng khác Tuy nhiên, cần phải nhận dạng dòng tách để hợp phân đoạn phù hợp Nếu protein thủy phân xác định dạng axit amin, biểu thị chúng liên quan đến protein PHỤ LỤC D (tham khảo) Sự trừ D.1 Tổng quan Một phương pháp phát triển tạo tương quan mức cao với có mặt chất gây nhiễu dịch chiết găng tay Thử nghiệm dựa quan sát Lowry cộng [5] tiến triển màu có liên quan với protein có mặt thuốc thử Folin phần lớn phụ thuộc vào có mặt đồng, ngược lại vật liệu gây nhiễu tiến triển màu với thuốc thử Folin khơng có đồng Phương pháp đưa vào có ích cho người muốn xác định định lượng chất gây nhiễu găng tay D.2 Nguyên lý Dịch chiết protein tái hòa tan từ găng tay kết tủa chia thành hai phần riêng biệt Một hai phần này, việc tiến triển màu thực mô tả 7.5 Ở phần thứ hai, tiến triển màu thực cách bỏ đồng sunfat khỏi thuốc thử D (6.3.4) Giá trị hấp thu nhận từ dung dịch gọi “nền" trừ từ giá trị phép xác định đ ầy đủ bao gồm đồng dung dịch D.3 Thuốc thử D.3.1 Thuốc thử DA: Natri xitrat kiềm, chuẩn bị ngày cách trộn 10 phần thuốc thử C với 0,2 phần thuốc thử DD D.3.2 Thuốc thử B, theo qui định 6.3.2 D.3.3 Thuốc thử C, theo qui định 6.3.3 D.3.4 Thuốc thử DD: dung dịch chứa g natri xitrat 100 cm nước D.4 Quy trình D.4.1 Phân tích tiến hành hai lần cách đồng thời với tiêu chuẩn xác định mô tả 7.5 Lượng dung dịch protein tái hòa tan phải đủ cho bốn phép xác định (hai lần đúp) Phụ thuộc vào thiết bị sử dụng, cần phải tăng lượng dịch chiết protein kết tủa, với hệ tăng lượng dung dịch natri hydroxyt sử dụng để tái hòa tan protein D.4.2 Thực quy trình dung dịch protein tiêu chuẩn chuẩn bị 7.3 lúc, sử dụng phương pháp mô tả 7.5 D.4.3 Để xác định nền, làm theo quy trình 7.5 thay thuốc thử DA (D.3.1) cho thuốc thử A (6.3.1 Đo hấp thu bước sóng cụ thể nằm khoảng từ 600 nm đến 750 nm thời gian h Tính giá trị trung bình phép xác định đúp D.5 Biểu thị kết D.5.1 Đường chuẩn Chuẩn bị đường chuẩn cách vẽ đồ thị nồng độ dung dịch protein tiêu chuẩn chuẩn bị 7.3 phụ thuộc vào mức hấp thụ chúng trừ mức hấp thụ đường chúng D.5.2 Tính tốn Trừ giá trị giá trị hấp thụ từ giá trị xác định dịch chiết protein với có mặt đồng ghi lại giá trị điều chỉnh, tính microgam centimet khối, trực tiếp từ đường chuẩn Bằng cách sử dụng giá trị hấp thu dung dịch không chứa đồng (D.3.4) với đường chuẩn, nhận giá trị đương lượng protein chất gây nhiễu PHỤ LỤC E (tham khảo) Độ chụm E.1 Khái quát Chương trình thử nghiệm liên phòng (ITP) để đánh giá độ chụm phương pháp tiến hành năm 2002 sử dụng quy trình độ chụm hướng dẫn mơ tả ISO/TR 9272:1986 Cả hai quy trình chiết xuất đánh giá: quy trình “găng cắt” quy trình “găng lồng găng” ITP tiến hành với bốn vật liệu với mức đo tăng dần Bảy phòng thử nghiệm tham gia ITP, độ chụm kiểu đánh giá Kết thử nghiệm giá trị trung bình ba phép đo lặp lại vào ngày hai ngày thử nghiệm riêng biệt, độ chụm đưa với kết thử nghiệm, ví dụ giá trị trung bình ngày hai ngày thử nghiệm Kết độ chụm xác định ITP không áp dụng cho thử nghiệm chấp nhận loại bỏ nhóm vật liệu sản phẩm mà không đưa tài liệu chứng tỏ kết đánh giá độ chụm thực tế áp dụng cho sản phẩm vật liệu thử nghiệm E.2 Kết độ chụm E.2.1 Tổng quan Đối với loại bốn vật liệu, kết độ chụm hai quy trình nêu Bảng Các kết nhận cách sử dụng quy trình thay giá trị ngoại biên quy trình loại bỏ giá trị ngoại biên mô tả ISO 9272 Các báo cáo tổng quát việc sử dụng kết độ chụm nêu Chúng đưa theo độ chụm tuyệt đối, r R, độ chụm tương đối, (r) (R) Xem dẫn giải bổ sung E.2.2 Độ lặp lại Độ lặp lại, hay độ chụm phạm vi cục bộ, quy trình quy trình thiết lập giá trị có Bảng 1, mức đo (đối với vật liệu) liệt kê bảng Hai kết thử nghiệm trung bình đơn lẻ (nhận việc sử dụng cách tiêu chuẩn này) mà khác với kết bảng r, tính theo đơn vị phép đo, (r), tính phần trăm, coi đáng ngờ, ví dụ bị lẫn từ tập hợp khác Việc phân xử cho thấy cần phải tiến hành kiểm tra thích hợp E.2.3 Độ tái lập Độ tái lập, hay độ chụm phạm vi toàn cục, quy trình quy trình thiết lập giá trị có Bảng 1, mức đo (đối với vật liệu) liệt kê bảng Hai kết thử nghiệm trung bình đơn lẻ nhận phòng thử nghiệm khác (do việc sử dụng cách tiêu chuẩn này) mà khác với kết bảng R, tính theo đơn vị phép đo, (R), tính phần trăm, coi đáng ngờ, ví dụ bị lẫn từ tập hợp khác Việc phân xử cho thấy cần phải tiến hành kiểm tra thích hợp Bảng E.1 - Dữ liệu độ chụm Quy trình găng cắt (quy trình A) Vật liệu Giá trị trung bình μg/g Trong phòng thử nghiệm Liên phòng thử nghiệm sr r (r) sR R (R) Số phòng thử nghiệm 14,3 3,48 9,7 68,3 7,57 21,2 148,5 68,3 6,46 18,1 26,5 12,6 35,2 51,5 162,2 6,79 19,0 11,7 25,1 70,3 43,3 200,6 13,6 37,9 18,9 28,2 78,9 39,3 Quy trình “găng lồng găng” (quy trình B) Vật liệu Giá trị trung bình μg/g Trong phòng thử nghiệm Liên phòng thử nghiệm sr r (r) sR R (R) Số phòng thử nghiệm 13,8 1,66 4,64 33,6 4,70 13,2 95,2 53,1 4,97 13,93 26,3 16,3 45,6 86,0 140,0 5,25 14,70 10,5 21,7 60,9 43,5 164,2 11,21 31,40 19,1 32,6 91,4 55,6 Ký hiệu sử dụng: sr độ lệch chuẩn phòng thử nghiệm (tính theo đơn vị phép đo); r độ lặp lại, nghĩa độ chụm phòng thử nghiệm (tính theo đơn vị phép đo); (r) độ lặp lại (tính phần trăm mức trung bình); sR độ lệch chuẩn liên phòng thử nghiệm (đối với tồn thay đổi liên phòng thử nghiệm tính theo đơn vị phép đo); R độ tái lập, nghĩa độ chụm liên phòng thử nghiệm (tính theo đơn vị phép đo); (R) độ tái lập (tính phần trăm mức trung bình); Số phòng thử nghiệm số sau loại bỏ phòng thử nghiệm có giá trị ngoại biên nhiều E.3 Các dẫn giải bổ sung Đối với quy trình găng cắt, phân tích cho thấy hai phòng thử nghiệm có giá trị ngoại biên nhiều Mặc dù giá trị ngoại biên thực phép thay thế, sử dụng quy trình ISO/TR 9272:1986, độ lặp lại độ tái lập tồi tệ Các kết thể Bảng E.1 quy trình “găng cắt” từ phân tích hai phòng thử nghiệm có nhiều giá trị ngoại biên xóa khỏi sở liệu, nghĩa cho năm phòng thử nghiệm tham gia Đối với quy trình “găng lồng găng”, hai phòng thử nghiệm có giá trị ngoại biên nhiều, nên lại tạo độ chụm Các kết nêu Bảng E.1 quy trình “găng lồng găng” kết phân tích phòng thử nghiệm bị xóa khỏi sở liệu, nghĩa cho sáu phòng thử nghiệm tham gia E.4 Độ chệch Độ chệch khác biệt kết thử nghiệm trung bình đo giá trị đối chứng giá trị thật phép đo tiến hành Các giá trị đối chứng không hữu quy trình Độ chệch đánh giá Thư mục tài liệu tham khảo [1] Markell, Anal Biochem (Phân tích sinh hóa), 87, trang 206, (1978) [2] ISO 9272, Rubber and rubber products — Determination of precision for test method standards (in preparation) (Cao su sản phẩm cao su — Xác định độ chụm tiêu chuẩn phương pháp thử (đang biên soạn)) [3] ISO/TR 9272:1986, Rubber and rubber products — Determination of precision for test method standards (Cao su sản phẩm cao su — Xác định độ chụm tiêu chuẩn phương pháp thử) [4] Chen, S.F., cộng sự, J Allergy Clin Immunol (Tạp chí Dị ứng Miễn dịch học lâm sàng), 100 (3), pp 713-4 (1997) [5] Lowry cộng sự, J Biol Chem (Tạp chí Hóa sinh), 199, p 265 (1951) MỤC LỤC Lời nói đầu Lời giới thiệu Phạm vi áp dụng Nguyên lý Thuật ngữ định nghĩa Thiết bị, dụng cụ Thuốc thử Cách tiến hành Tính kết Báo cáo thử nghiệm Phụ lục A (qui định) Kiểm tra xác nhận Phụ lục B (qui định) Sự hấp phụ protein ống polypropylen polyetylen Phụ lục C (tham khảo) Các phương pháp phân tích khác Phụ lục D (tham khảo) Sự trừ Phụ lục E (tham khảo) Độ chụm Thư mục tài liệu tham khảo ... hemisodium acid N-tris-(hydroxymetyl)-metyl-2-amino-etanesulfonic (TES) (0,1 mol/L) Chất đệm PBS chuẩn bị cách hòa tan viên PBS nước cất theo hướng dẫn nhà sản xuất Trong trường hợp, cuối giai... nm đến 750 nm thời gian h Tính giá trị trung bình phép xác định đúp D.5 Biểu thị kết D.5.1 Đường chuẩn Chuẩn bị đường chuẩn cách vẽ đồ thị nồng độ dung dịch protein tiêu chuẩn chuẩn bị 7.3 phụ... A.3.1 Chuẩn bị dung dịch protein tiêu chuẩn không bị kết tủa Sử dụng protein dung dịch gốc (6.4), chuẩn bị dung dịch loãng 0,2 mol/l dung dịch natri hydroxyt (6.3.5) dung dịch protein tiêu chuẩn