Tiêu chuẩn Quốc gia TCVN 6686-2:2007 - ISO 13366-2:2006 giới thiệu về sữa – định lượng tế bào xôma – phần 2: hướng dẫn vận hành máy đếm huỳnh quang điện tử. TCVN 6686-2:2007 do Ban kỹ thuật tiêu chuẩn TCVN/TC/F 12 Sữa và sản phẩm sữa biên soạn. Mời các bạn tham khảo.
TIÊU CHUẨN QUỐC GIA TCVN 6686-2:2007 ISO 13366-2:2006 SỮA – ĐỊNH LƯỢNG TẾ BÀO XÔMA – PHẦN 2: HƯỚNG DẪN VẬN HÀNH MÁY ĐẾM HUỲNH QUANG ĐIỆN TỬ Milk – Enumeration of somatic cells –Part 2: Guindance on the operation of fluoro-opto-electronic counters Lời nói đầu TCVN 6686-2:2007 thay TCVN 6686-2:2000; TCVN 6686-2:2007 hoàn toàn tương đương với ISO 13366-2:2006; TCVN 6686-2:2007 Ban kỹ thuật tiêu chuẩn TCVN/TC/F 12 Sữa sản phẩm sữa biên soạn, Tổng cục Tiêu chuẩn Đo lường Chất lượng đề nghị, Bộ Khoa học Công nghệ công bố TCVN 6686 (ISO 13366) Sữa – Định lượng tế bào xôma bao gồm phần sau: - TCVN 6686 – 1: 2000 (ISO 13366-1: 1997) Phương pháp dùng kính hiển vi (Phương pháp chuẩn); - TCVN 6686 – 2: 2007 (ISO 13366-2:2006) Hướng dẫn vận hành máy đếm huỳnh quang điện tử SỮA – ĐỊNH LƯỢNG TẾ BÀO XÔMA – PHẦN 2: HƯỚNG DẪN VẬN HÀNH MÁY ĐẾM HUỲNH QUANG ĐIỆN TỬ Milk – Enumeration of somatic cells –Part 2: Guindance on the operation of fluoro-optoelectronic counters Phạm vi áp dụng Tiêu chuẩn đưa hướng dẫn điều kiện vận hành máy đếm tế bào xôma sữa nguyên liệu sữa bảo quản hóa chất, sử dụng máy đếm tế bào xơma huỳnh quang điện tử, sử dụng kỹ thuật đĩa quay đo mật độ lưu lượng tế bào vùng đếm Hướng dẫn áp dụng để đếm tế bào xơma sữa bị ngun liệu Hướng dẫn áp dụng cho sữa nguyên liệu lấy từ loại động vật khác dê, cừu trâu, đáp ứng qui định Tài liệu viện dẫn Các tài liệu viện dẫn sau cần thiết cho việc áp dụng tiêu chuẩn Đối với tài liệu viện dẫn ghi năm ban hành áp dụng phiên nêu Đối với tài liệu viện dẫn khơng ghi năm ban hành áp dụng phiên nhất, bao gồm sửa đổi TCVN 6686-1 (ISO 13366-1) Sữa – Định lượng tế bào xơma – Phần 1: Phương pháp dùng kính hiển vi (Phương pháp chuẩn) ISO 8196-1, Milk – Definition and evaluation of the overall accuracy of indirect methods of milk analysis – Part 1: Analytical attributes of indirect methods (Sữa – Định nghĩa đánh giá độ xác tổng thể phương pháp phân tích gián tiếp – Phần 1: Thuộc tính phân tích phương pháp gián tiếp) ISO 8196-2, Milk – Definition and evaluation of the overall accuracy of indirect methods of milk analysis – Part 2: Calibration and quality control in the dairy laboratory (Sữa – Định nghĩa đánh giá độ xác tổng thể phương pháp phân tích gián tiếp – Phần 2: Hiệu chuẩn kiểm tra chất lượng phòng thử nghiệm sữa) ISO Guide 34, General requirements for the competence of reference material producers (ISO Hướng dẫn 34, Yêu cầu chung lực nhà sản xuất mẫu chuẩn) ISO Guide 34-1, Proficiency testing by interlaboratory comparisions – Part 1: Development and operation of proficiency testing schemes (ISO Hướng dẫn 43-1, Phần 1: Xây dựng thực kế hoạch thử nghiệm thành thạo) Thuật ngữ định nghĩa Trong tiêu chuẩn áp dụng thuật ngữ định nghĩa nêu ISO 8196-1, ISO 8196-2 thuật ngữ, định nghĩa sau đây: 3.1 Phương pháp chuẩn (Reference method) Phương pháp mô tả TCVN 6686-1 (ISO 13366-1) đếm tế bào xôma 3.2 Tế bào xôma (Somatic cells) Các tế bào cho thấy có cường độ huỳnh quang mạnh việc nhuộm ADN nhân tế bào CHÚ THÍCH: Số lượng tế bào xôma biểu thị số tế bào mililit Nguyên tắc Các máy đếm huỳnh quang điện tử có chức hấp thu thuốc thử mẫu thử, vùng trộn vùng đếm Trong vùng trộn, mẫu thử trộn với dung dịch đệm dung dịch thuốc nhuộm Một phần hỗn hợp tạo thành chuyển sang vùng đếm đặt vào tiêu điểm Mỗi hạt nhuộm màu quan sát kính hiển vi huỳnh quang tạo xung điện, lọc, khuếch đại ghi lại Sự phân bố chiều cao xung tạo xử lý điện tử, nhờ mà phân biệt khác tín hiệu ồn xung tạo tế bào xôma nhuộm Mức độ phân biệt ổn định khơng ổn định Trong vùng trộn mẫu, thể tích mẫu thử dung dịch đệm/dung dịch nhuộm màu lấy theo liều lượng kiểm sốt chặt Việc trộn thực cốc, khoang trộn, ly tâm, ống mẫu ống dẫn vào cuvet dòng chảy Trong vùng đếm, sử dụng cách đếm đĩa đếm lưu lượng Trong trường hợp đếm đĩa, lớp màng mỏng hỗn hợp đưa qua ống phun vào đỉnh đĩa quay theo phương thẳng đứng Đối với kính hiển vi huỳnh quang bề mặt quay hoạt động giống tiêu điểm chuyển động Khi sử dụng cách đo lưu lượng tế bào, phần hỗn hợp đặt vào dòng dịch lỏng bao quanh cuvet với tốt độ cao Do gia tốc quay mà hỗn hợp tạo thành sợi dây mà tế bào xôma hội tụ xếp thành hàng thẳng Sợi sau qua vật kính hiển vi huỳnh quang Trong số thiết bị, vùng đếm có hai kênh Về mặt đảm bảo chất lượng phân tích, tình cần coi tương đương với hai phận riêng rẽ, nên đánh giá cần thực riêng biệt cho kênh Các yếu tố ảnh hưởng đến kết phép đo 5.1 Chai đựng mẫu Chai đựng mẫu phải phù hợp với mục đích sử dụng, nghĩa vận chuyển mẫu thử từ điểm lấy mẫu đến phịng thử nghiệm mà khơng làm thất hư hỏng Chú ý cho chia đựng mẫu phải kín tích trống thích hợp phía chai Thể tích trống q lớn tạo cream; thể tích trống q nhỏ gây khó khăn trộn 5.2 Lấy mẫu 5.2.1 Khái quát Dụng cụ lấy mẫu (nghĩa chai đựng mẫu, cốc có mỏ dụng cụ lấy mẫu) phải khô Khi sử dụng dụng cụ lấy mẫu tự động, chúng phải đánh giá thích hợp Tốt sau lấy mẫu, mẫu thử làm lạnh đến nhiệt độ từ °C đến °C giữ nhiệt độ bắt đầu đếm (xem 5.4) bảo quản Tránh làm kết đông Nếu cần thiết phải bảo quản, phương pháp thích hợp để bảo quản mẫu thử hóa chất mô tả 5.3 5.2.2 Mẫu sữa gộp chung Trộn kỹ mẫu sữa nguyên liệu gộp chung Khi khuấy trộn khơng đủ tế bào xơma tập trung lớp phía lớp phía 5.2.3 Mẫu sữa từ động vật riêng lẻ Việc giải phóng tế bào xơma q trình lấy sữa khơng Để có kết đếm đại diện cho tồn q trình lấy sữa, điều phải thu mẫu đại diện Để chẩn đốn, cần đến mẫu công đoạn lấy sữa 5.3 Bảo quản Nếu cần phải bảo quản mẫu thử hóa chất, bảo quản (5.2.1) sớm tốt, phải vòng 24 h sau lấy mẫu Trong trường hợp, mẫu thử phải giữ lạnh (0 °C đến °C) bổ sung chất bảo quản Các chất bảo quản thích hợp sau: a) Axit boric: nồng độ cuối có mẫu khơng vượt 0,6 g/100 ml Các mẫu bảo quản bảo quản tiếp 24 h °C đến 12 °C b) Natri azit: nồng độ cuối có mẫu khơng vượt q 0,024 g/100 ml Các mẫu bảo quản bảo quản tiếp 72 h °C đến 10 °C c) Bronopol (2-bromo-2-nitro-1,3-propandiol): nồng độ cuối có mẫu không vượt qúa 0,05 g/100 ml Các mẫu bảo quản bảo quản tiếp ngày °C đến 12 °C d) Kali dicromat: nồng độ cuối có mẫu khơng vượt 0,2 g/100 ml Các mẫu bảo quản bảo quản tiếp ngày °C đến 12 °C Các vết màu kèm cho thấy thích hợp là: - Parent Blue V, có nồng độ cuối mẫu thử đến 0,15 mg/100 ml, - Yellow Orange S (E110), có nồng độ cuối mẫu thử đến mg/100 ml - Hỗn hợp Patent Blue V Eosin B, có nồng độ cuối mẫu thử đến 0,03 mg/100 ml 0,45 mg/100 ml, tương ứng Có thể sử dụng chất bảo quản vết màu khác với điều kiện tính hiệu lực điều kiện sử dụng đánh giá đầy đủ Trong trường hợp, trước sử dụng cần đánh giá có mặt chất gây nhiễu thiết bị đếm Trong trường hợp máy đếm tế bào huỳnh quang điện tử kết hợp với máy phân tích sữa để đo thành phần mẫu thử khác, ý chất bảo quản vết màu không ảnh hưởng đến kết đếm 5.4 Bảo quản vận chuyển mẫu Các mẫu thử chưa bảo quản cần giữ °C đến °C phải đếm 96 h sau lấy mẫu Không làm kết đông mẫu thử Bảo quản nhiệt độ cao và/hoặc lâu khoảng thời gian định cho số đếm không đại diện Việc đo mẫu sau cấp đơng rã đơng làm cho số đếm thấp (10 % đến 20 %) Thời gian mẫu để trạng thái đóng băng kiểu rã đơng ảnh hưởng đến kết đếm 5.5 Chất gây nhiễu Tránh sử dụng chất gây nhiễu đếm Các chất biết gây nhiễu thiết bị đếm là: a) Các chất bảo quản vết màu nồng độ cao qui định 5.3 b) Xanh metylen nồng độ cao, ví dụ: > 0,06 mg/100 ml 5.6 Chất lượng mẫu phân tích Việc phá vỡ tế bào xơma (phân giải) làm tăng mảnh tế bào nhỏ Mật độ thấp huỳnh quang sau nhuộm hạt gây nên thay đổi phân bố chiều cao xung sang bên trái Điều cản trở việc phân biệt xung tiếng ồn dẫn đến số đếm thấp CHÚ THÍCH: Trong số kiểu loại thiết bị, có sẵn điểm đặc trưng để đánh giá vị trí hình dạng phân bố chiều cao xung Xem hướng dẫn có liên quan dẫn nhà sản xuất Sau xử lý mẫu có vấn đề, cần kiểm tra làm đường dòng chảy Cần kiểm tra chức thiết bị trước sử dụng tiếp Các mẫu thử có vấn đề là: a) mẫu sữa lấy từ vú động vật bị nhiễm bệnh nặng, nghĩa có vón cục, b) mẫu sữa có tạp chất bẩn, c) mẫu sữa có số lượng hồng cầu cao, d) sữa non, e) sữa cuối thời kì tiết sữa f) sữa bị chua Tránh phân tích mẫu có vấn đề, 5.7 Hóa chất sử dụng Tất thuốc thử sử dụng phải loại phân tích có chất lượng dùng cho phân tích vi sinh Nước sử dụng phải nước loại khoáng (độ dẫn điện < 10 µS/cm) nước có độ tinh khiết tương đương Chuẩn bị dung dịch làm việc, thời gian bảo quản tối đa yêu cầu bảo quản theo hướng dẫn nhà sản xuất Các điều kiện liên quan đến sử dụng thải bỏ hóa chất sử dụng nước thải phải tuân thủ quy định 5.8 Điều kiện thiết bị 5.8.1 Các điểm chung cần lưu ý là: a) chức máy trộn máy khuấy, b) khả nhiễu điểm lấy mẫu hệ thống dòng chảy cản trở tạp chất, mảng khối tắc nghẽn máy trộn phận ủ ấm c) điều kiện chức nguồn ánh sáng phận nhân bản, kết thu chất lượng tín hiệu 5.8.2 Với máy đếm đĩa tế bào, điểm cụ thể cần ý là: a) vị trí màng đĩa quay, b) độ tiêu điểm chức miếng xốp làm sạch; thay miếng xốp lúc cần thiết c) xả hết bình thu nhận dịch tráng rửa cách 5.8.3 Điểm ý cụ thể máy đếm dòng tế bào khác đặc điểm sợi mẫu cuvet dòng dòng chất lỏng bao quanh Một số nhà sản xuất thiết bị đưa chương trình đặc biệt để kiểm tra điều này, phải rõ giải pháp hợp lý trường hợp sai lệch 5.9 Hệ số làm việc Hệ số làm việc số lượng mà qua số lượng tế bào xơma thực tế đếm thiết bị nhân lên để đạt số đếm tế bào xôma mẫu thử Về lý thuyết, đặc trưng độ chụm độ cần thu từ hệ số làm việc thấp 5.10 Thể tích thử nghiệm Tỷ lệ thể tích dung dịch đệm/dung dịch thuốc nhuộm thể tích mẫu thử yếu tố cần thiết cho việc đếm Hiệu chuẩn 6.1 Chất chuẩn 6.1.1 Khái quát Các chất chuẩn cần tạo điều kiện kiểm soát nghiêm ngặt; nghĩa thực với hệ thống đảm bảo chất lượng thực yêu cầu liệt kê ISO Guide 34 Các chất chuẩn là: a) chất chuẩn chứng nhận (CRMs) tổ chức thức cơng nhận cung cấp, b) chất chuẩn thứ cấp (SRMs) nhà cung cấp bên cung cấp, c) chất chuẩn nội (IRMs) phịng thử nghiệm tự tạo, việc truy nguyên tuân theo CRMs, SRMs theo nghiên cứu thành thạo liên phịng thử nghiệm, CHÚ THÍCH: Các CRMs để đếm tế bào xơma khơng có sẵn Các ví dụ nhà sản xuất thích hợp chuẩn bị IRMs liệt kê Các IRMs có thành phần giống với thành phần sữa tự nhiên tốt 6.1.2 Chuẩn bị mẫu hiệu chuẩn 6.1.2.1 Chuẩn bị cách thêm huyền phù bạch cầu bò a) Trộn 1000 ml sữa tiệt trùng sữa xử lí UHT có số đếm tế bào xôma thấp với ml polypropylen 2000 0,4 g bronopol b) Thêm lượng cần thiết huyền phù bạch cầu thích hợp vào phần khác hỗn hợp để thu phạm vi đếm thích hợp 6.1.2.2 Chuẩn bị vi lọc a) Thu lấy sữa tươi thêm bronopol đến phần khối lượng cuối 0,02 % b) Tách chất béo sữa tách cream đến thu chất béo nhỏ 0,1 % phần khối lượng c) Cô đặc sữa tách chất béo 20 lần cách sử dụng vi lọc màng có cỡ lỗ 0,8 µm, tạo phần có hàm lượng tế bào cao (HCM) phần có hàm lượng tế bào thấp (LCM) d) Trộn cream, HCM LCM theo lượng cần thiết để thu phần đến phần sữa với chất béo chiếm 3,5 % phần khối lượng có mức khác số đếm tế bào bao trùm phạm vi đếm quan tâm 6.1.2.3 Chuẩn bị ly tâm a) Thu lấy sữa tươi bronopol đến phần khối lượng cuối 0,02 % b) Lọc dung dịch sữa thu qua lọc kim loại có cỡ lỗ 0,5 mm c) Tách chất béo sữa lọc cách cho ly tâm gia tốc quay 40 g 10 để thu cream, sữa gầy viên nhỏ d) Trộn sữa gầy viên nhỏ theo lượng cần thiết để thu phần đến phần sữa có mức khác số đếm tế bào bao trùm phạm vi đếm cần quan tâm e) Bổ sung cream cho thu phần có chất béo 3,3 % ± 0,3 % phần khối lượng, cần f) Tách phần thu thành mẫu riêng lẻ gia nhiệt 120 °C áp suất 10 Pa 6.1.3 Chỉ định giá trị đối chứng Các giá trị đối chứng cần xác định phân tích kép sử dụng phương pháp chuẩn qui định TCVN 6686-1 (ISO 13366-1), tốt thực hai phòng thử nghiệm khác Việc đếm kép đồng thời với mẫu chuẩn phương pháp đo máy, hiệu chuẩn xác mẫu hiệu chuẩn trước cịn hiệu lực, đóng vai trị hỗ trợ có giá trị việc ngăn chặn dao động mức đếm qua thời gian Sự tương hợp hồn tồn cần có thường xun; chênh lệch tối đa kết phương pháp chuẩn số đếm thu máy mẫu hiệu chuẩn riêng lẻ nhỏ 10 % Khi đó, giá trị thu phương pháp chuẩn số đếm máy kết hợp, kết phương pháp chuẩn cần phải tính đến hệ số trọng lượng 0,5 giá trị đối chứng định Trong trường hợp kết đếm mẫu thử sử dụng để kiểm tra giới hạn thức, việc phê chuẩn từ quan có thẩm quyền cần hướng tới qui trình định giá trị đối chứng 6.1.4 Điều kiện bảo quản thời gian lưu giữ Điều kiện bảo quản thời gian lưu giữ chất chuẩn chuẩn bị phải đánh giá Thời hạn tháng coi tối thiểu Khi bảo quản hóa chất, việc định cần tìm chủng loại nồng độ chất bảo quản dùng cho mẫu thử (xem 5.3) 6.2 Qui trình hiệu chuẩn 6.2.1 Hiệu chuẩn Trước hiệu chuẩn, cần chắn thiết bị vận hành đáp ứng đầy đủ yêu cầu liên quan đến kiểm tra mẫu trắng (9.1), ảnh hưởng việc mang sang (9.2), tỷ lệ thể tích (9.3) độ lặp lại (9.6) Tính chất hồi qui tuyến tính áp dụng cho mục đích hiệu chuẩn Áp dụng qui trình hiệu chuẩn theo ISO 8196-2, sử dụng năm mẫu hiệu chuẩn bao trùm phạm vi số đếm tế bào xơma có liên quan Các giá trị biểu thị phạm vi đếm tế bào xơma có liên quan mẫu hiệu chuẩn đưa bảng Bảng – Các giá trị biểu thị phạm vi hiệu chuẩn có liên quan Loại sữa Phạm vi Tế bào/ml Sữa bò (của đàn) Từ 100000 đến 1000000 Sữa bò (của vật) Từ 100000 đến 2000000 Sữa dê Từ 200000 đến 2000000 Sữa cừu Từ 100000 đến 2000000 Sữa trâu Từ 100000 đến 2000000 Việc hiệu chuẩn cần kiểm tra tháng lần 6.2.2 Kiểm tra độ tuyến tính Mối liên quan số đọc thiết bị giá trị đối chứng cần phải tuyến tính phạm vi đo có liên quan số đếm tế bào xơma Sai lệch khỏi tuyến tính xuất phát từ tín hiệu khơng đặc thù tác động ngẫu nhiên Trước hết kiểm tra độ tuyến tính theo bề ngồi cách sử dụng số thích hợp cho thu tranh rõ nét hình đạng mối quan hệ Khi có chứng trệch khỏi tuyến tính, sử dụng thơng số định lượng phép kiểm tra để nhận dạng mà không quan tâm đến chiều hướng quan sát chấp nhận hay khơng Để thực điều đó, sử dụng sữa có số đếm tế bào cao pha loãng hàng loạt với sữa có số đếm thấp, tạo thành dãy năm mẫu bao trùm dải nồng độ Đo sữa có số đếm cao sữa có số đếm thấp theo điều bốn lần giống tính kết trung bình cho mẫu Tính giá trị mẫu trung gian từ tỷ lệ hỗn hợp mẫu dùng đưa đến giá trị mong đợi mẫu sau đó, đo tất mẫu theo điều bốn lần giống tính kết trung bình cho mẫu, tương đương với giá trị đo mẫu Sử dụng hồi qui tuyến tính với giá trị dự đoán mẫu trục x giá trị đo mẫu trục y Tính ei = yi – (bxi + a) từ đường hồi qui Dựng đồ thị giá trị e i (trục y) giá trị dự đoán (trục x) Việc kiểm tra mắt thường điểm thường cho đủ thơng tin độ tuyến tính tín hiệu Mọi điểm nằm ngồi dẫn đến loại bỏ kết tính tốn lại trước thử nghiệm tiếp Khi quan sát, độ cong biểu thị tỷ số, r c, sử dụng cơng thức sau đây: Trong emax giá trị số dư tối đa từ đường hồi qui; emin giá trị số dư tối thiểu từ đường hồi qui; Mmax giá trị đo loạt mẫu liên quan; Mmin giá trị đo loạt mẫu liên quan Tỷ lệ rc, phải nhỏ % Nếu giá trị bị loại bỏ, thu hiệu suất tốt cách thực phép hiệu chuẩn riêng rẽ phạm vi đếm riêng biệt CHÚ THÍCH: Nhìn chung, kết hợp việc kiểm tra tuyến tính qui định với việc hiệu chuẩn Lấy mẫu Mẫu gửi đến phòng thử nghiệm phải mẫu đại diện Mẫu không bị hư hỏng thay đổi chất lượng trình vận chuyển bảo quản Các điểm cụ thể liệt kê 5.2 đến 5.6 Việc lấy mẫu không qui định tiêu chuẩn Nên lấy mẫu theo TCVN 6400 (ISO 707) Cách tiến hành Trước phân tích, mẫu thử (5.2.2 5.2.3) cần làm nóng từ từ đến 40 °C ± °C cần trộn cách đảo chiều hộp chứa mẫu Mẫu thử giữ nhiệt độ phòng thử nghiệm, với điều kiện mẫu thử nghiệm vòng 30 đạt tới 40 °C ± °C Mẫu cần trộn kỹ lại trước thử nghiệm Đo mẫu thử theo hướng dẫn nhà sản xuất thiết bị CHÚ THÍCH: Đối với vài loại thiết bị, việc kéo dài thời gian đếm tùy ý, trùng khớp với việc làm giảm hệ số làm việc (xem 5.9) Điều tăng độ lặp lại độ xác phép đo 9 Kiểm tra hiệu suất vận hành thông thường 9.1 Kiểm tra mẫu trắng Kiểm tra mẫu trắng có nghĩa kiểm tra nhiễm bẩn đường ống toàn thiết bị Trước bắt đầu, cần kiểm tra mẫu trắng năm lần Giá trị trung bình khơng vượt q 3000 tế bào/ml tất kết riêng lẻ cần phải nhỏ 8000 tế bào/ml Trong phép thử thông thường, tối đa sau 100 mẫu sau h cần tiến hành kiểm tra mẫu trắng 9.2 Ảnh hưởng việc mang sang Phần mẫu thử lấy từ mẫu thử ảnh hưởng đến kết mẫu tiếp sau Ảnh hưởng việc mang sang cần kiểm tra tháng lần cách đo năm dãy mẫu thử có số đếm tế bào xơma 750000/mililit, hai mẫu trắng Tính giá trị mang sang, CO phần trăm, theo công thức sau đây: Trong B1 số đọc mẫu trắng thứ nhất; B2 số đọc mẫu trắng thứ hai; M số đọc mẫu thử Ảnh hưởng việc mang sang phải nhỏ % Nhìn chung, giá trị ảnh hưởng việc mang sang tính được bù tự động thử nghiệm mẫu thơng thường CHÚ THÍCH: Trong vài loại thiết bị, ảnh hưởng việc mang sang xuất mẫu khơng liên tiếp, ví dụ sử dụng bánh xe có cốc ủ ấm 9.3 Tỷ lệ thể tích thuốc thử thể tích mẫu thử Để đếm đúng, cần có tỷ lệ thích hợp thể tích dung dịch đệm/thuốc nhuộm mẫu sữa thử nghiệm Điều cần kiểm tra thường xuyên máy đếm tế bào đĩa quay Đối với phép thử này, sử dụng chai ống biết trước khối lượng chứa thể tích dung dịch đệm/thuốc nhuộm mẫu thử Sau cân, tỷ lệ tính Tỷ lệ cần thống với giá trị qui định khoảng ± % 9.4 Kiểm tra thí điểm 9.4.1 Khái quát Phép đo mẫu thí điểm với giá trị sữa thí điểm ấn định để kiểm tra ổn định thiết bị thời gian ngắn Sử dụng mẫu sữa thí điểm với số đếm tế bào xơma trung bình cao (> x trung bình) phạm vi đếm có liên quan 9.4.2 Sữa thí điểm Để thu sữa thí điểm thích hợp, áp dụng qui trình chuẩn bị chất chuẩn (xem 6.1) Một qui trình thay lựa chọn mẫu thử thích hợp từ mẻ phân tích thường lệ chuẩn bị loại sữa gộp lại có bổ sung chất bảo quản thích hợp (xem 5.3) Bảo quản mẫu nhiệt độ từ °C đến °C sử dụng Tránh làm đông lạnh mẫu sữa thí điểm Cũng cần phải ghi lại thời gian sử dụng mẫu chưa bảo quản thường giới hạn từ đến hai ngày sau chuẩn bị 9.4.3 Chỉ định giá trị sữa thí điểm Phân tích 10 mẫu thí điểm hai lần giống thiết bị hiệu chuẩn Tính giới hạn lặp lại r từ kết thu theo ISO 8196-2 Với điều kiện giá trị tính thấp giá trị độ lặp lại mục tiêu 11.1, tính giá trị trung bình kết thu định giá trị giá trị thí điểm 9.4.4 Sử dụng mẫu sữa thí điểm Cần kiểm tra thí điểm trước ngày làm việc ba lần phân tích mẫu thường lệ Các mẫu sữa thí điểm phải đại diện cho sữa cần phân tích cần tn theo qui trình xử lý sơ mẫu phân tích mẫu thử nghiệm Đối với việc kiểm soát ổn định thiết bị, sử dụng đồ thị kiểm sốt theo ISO 8196-2 Do đó, giá trị định sữa thí điểm coi giá trị chuẩn Cần có hành động thích hợp nhiều giá trị thu nằm giới hạn kết riêng lẻ giá trị trung bình 9.5 Giám sát thêm thiết bị Một số nhà sản xuất thiết bị cung cấp mẫu hạt nhân tạo để hỗ trợ việc giám sát thiết bị hàng ngày 9.6 Độ lặp lại Trước ngày làm việc cần kiểm tra độ lặp lại theo hướng dẫn nhà sản xuất Có thể sử dụng mẫu sữa thí điểm Khi kiểm tra thường lệ lượng lớn mẫu thử thiết bị có cơng suất cao, bắt đầu nên thực 10 phép xác định lặp lại hai lần mẫu thí điểm Vả lại, nên kiểm tra 20 mẫu thử riêng lẻ khác hai lần giống hệt mẻ chạy liên tiếp khoảng đặn, ví dụ: tuần lần Độ lệch chuẩn tương đối lặp lại cần tính theo ISO 8196-2 Cần có hành động thích hợp giá trị thu lớn giá trị qui định 11.1 9.7 Độ tái lập phòng thử nghiệm Đối với thiết bị cần hệ thống hiệu chuẩn, điển hình phịng thử nghiệm có vài thiết bị, độ tái lập (11.2) phịng thử nghiệm cần kiểm tra Thuật ngữ “độ tái lập phòng thử nghiệm” liên quan đến phép phân tích thực phòng thử nghiệm, sử dụng phương pháp thực vật liệu thử giống hệt nhau, người khác phân tích, sử dụng thiết bị khác thời điểm khác (trong vài giờ) Có thể dùng kết sữa thí điểm riêng lẻ có sẵn từ việc kiểm tra độ lặp lại (xem 9.6) để kiểm tra độ tái lập phịng thử nghiệm Cần có hành động thích hợp giá trị thu lớn giá trị qui định 11.2 9.8 So sánh bên Sự tham gia nghiên cứu liên phòng thử nghiệm theo ISO Guide 43-1 hai lần năm phần hệ thống đảm bảo chất lượng việc đếm tế bào xôma huỳnh quang điện tử Số lượng đơn vị tham gia cần nhỏ 10 Phạm vi đếm liên quan cần bao trùm 10 mẫu, cung cấp cho phép phân tích lặp lại hai lần, hai mẫu lấy từ chai mẫu 10 Nhận xét cụ thể sử dụng sữa từ loài khác 10.1 Khái quát Nên kiểm tra việc không bị ảnh hưởng đáng kể chất béo protein, ví dụ: cách cho thêm cream phần lại sau siêu lọc Nếu quan sát thấy có ảnh hưởng đáng kể, chỉnh thiết bị và/hoặc qui trình đếm theo hướng dẫn nhà sản xuất thiết bị Có thể cần phải điều chỉnh sau: a) pha loãng sơ mẫu thử; b) sử dụng thuốc nhuộm màu đậm đặc hơn; c) điều chỉnh lượng dung dịch đệm/dung dịch thuốc nhuộm; d) thay đổi nhiệt độ mẫu thử; e) kéo dài thời gian qua cuvet dòng; f) điều chỉnh việc xử lý xác phân bố chiều cao xung thu 10.2 Sữa bò Đối với giống bị cho sữa có hàm lượng chất béo protein cao, kiểm tra khả gây cản trở cho việc đếm tế bào xôma 10.3 Sữa dê Lượng tế bào xôma sữa dê nhỏ nhiều so với sữa bò Tế bào bổ sung, hạt dạng tế bào chất tạo thêm tạp Điều cần ý đặc biệt để phân biệt Tuy nhiên, tùy thuộc vào thiết bị hàm lượng chất rắn tổng số khơng q cao, sữa dê phân tích sử dụng máy đếm huỳnh quang điện tử dùng đường hiệu chuẩn sữa bò, với điều kiện phạm vi số đếm tế bào xơma có liên quan bao trùm dây hiệu chuẩn [4] Số đếm tế bào xôma sữa dê biến thiên chúng, ví dụ, giai đoạn lấy sữa, nhìn chung cao so với sữa bị bị ảnh hưởng tình trạng sức khỏe động vật cho sữa 10.4 Sữa cừu Trong trình xử lý số đếm huỳnh quang điện tử, tế bào xơma sữa cừu có biểu bên ngồi giống với sữa bị Tùy thuộc vào loại thiết bị hàm lượng chất rắn tổng số khơng q cao, phân tích sữa cừu máy đếm huỳnh quang điện tử sử dụng đường hiệu chuẩn sữa bò, với điều kiện phạm vi số đếm tế bào xôma có liên quan bao trùm dãy hiệu chuẩn [4] Số đếm tế bào xơma sữa cừu mức tương tự sữa bò cao 10.5 Sữa trâu Trong trình xử lý số đếm huỳnh quang điện tử, tế bào xơma sữa trâu có biểu bên ngồi giống với sữa bị Hàm lượng chất béo protein cao đáng kể, cần kiểm tra khả gây nhiễu việc điều chỉnh cần thiết 11 Độ chụm CHÚ THÍCH: Các giá trị nêu độ chụm liệt kê từ nghiên cứu sữa bò Các giá trị sữa lấy từ lồi khác thích hợp 11.1 Độ lặp lại Chênh lệch tuyệt đối kết thu hai lần thử nghiệm độc lập riêng rẽ (r), thu sử dụng phương pháp, phân tích nguyên liệu, người tiến hành phòng thử nghiệm, dùng thiết bị, khoảng thời gian ngắn, không % trường hợp lớn giá trị nêu bảng Bảng – Giá trị độ lặp lại Mức số đếm tế bào sr r tế bào/ml % tế bào/ml 150000 25000 300000 42000 450000 50000 750000 63000 1500000 126000 11.2 Độ tái lập phòng thử nghiệm Chênh lệch tuyệt đối kết hai lần thử nghiệm độc lập riêng rẽ (R intra), thu sử dụng phương pháp, phân tích nguyên liệu giống hệt nhau, người khác phân tích, tiến hành phịng thí nghiệm, dùng thiết bị khác nhau, thời điểm khác (trong vịng vài giờ), khơng q % trường hợp lớn giá trị nêu bảng Bảng – Giá trị độ tái lập phòng thử nghiệm Mức số đếm tế bào sR intra Rintra tế bào/ml % tế bào/ml 150000 29000 300000 50000 450000 63000 750000 84000 1500000 168000 11.3 Độ tái lập Chênh lệch tuyệt đối hai kết thu hai lần thử nghiệm độc lập riêng rẽ (R), thu sử dụng phương pháp, phân tích nguyên liệu thử giống hệt nhau, người khác thực phòng thử nghiệm khác nhau, khoảng thời gian ngắn, không % trường hợp lớn giá trị nêu bảng Bảng – Giá trị độ lặp lại Mức số đếm tế bào sR R tế bào/ml % tế bào/ml 150000 38000 300000 67000 450000 88000 750000 126000 1500000 252000 12 Báo cáo thử nghiệm Báo cáo thử nghiệm phải ghi rõ: a) thông tin cần thiết để nhận biết đầy đủ mẫu thử; b) phương pháp lấy mẫu sử dụng, biết; c) ngày lấy mẫu; d) kiểu loại mẫu; e) phương pháp thử dùng; f) chi tiết thao tác sai lệch so với qui định tiêu chuẩn mà ảnh hưởng tới kết quả; g) kết thu tính theo đơn vị hàng nghìn tế bào mililit đáp ứng yêu cầu độ lặp lại ghi kết cuối thu THƯ MỤC TÀI LIỆU THAM KHẢO [1] TCVN 6400 (ISO 707) Sữa sản phẩm sữa – Hướng dẫn lấy mẫu [2] TCVN 6910-1 (ISO 5725-1), Độ xác (độ độ chụm) phương pháp đo kết đo Phần 1: Nguyên tắc định nghĩa chung [3] TCVN 6910-2 (ISO 5725-2) Độ xác (độ độ chụm) phương pháp đo kết đo Phần 2: Phương pháp xác định độ lặp lại độ tái lập phương pháp đo tiêu chuẩn [4] Programme FAIR CT 95-0881:2002, Strategies de contrôle en fermes des comptage de cellules somatiques du lait de brebis et de chervre ... testing schemes (ISO Hướng dẫn 4 3-1 , Phần 1: Xây dựng thực kế hoạch thử nghiệm thành thạo) Thuật ngữ định nghĩa Trong tiêu chuẩn áp dụng thuật ngữ định nghĩa nêu ISO 819 6-1 , ISO 819 6-2 thuật ngữ,... phẩm sữa – Hướng dẫn lấy mẫu [2] TCVN 691 0-1 (ISO 572 5-1 ), Độ xác (độ độ chụm) phương pháp đo kết đo Phần 1: Nguyên tắc định nghĩa chung [3] TCVN 691 0-2 (ISO 572 5-2 ) Độ xác (độ độ chụm) phương... mẫu riêng lẻ gia nhiệt 120 °C áp suất 10 Pa 6.1.3 Chỉ định giá trị đối chứng Các giá trị đối chứng cần xác định phân tích kép sử dụng phương pháp chuẩn qui định TCVN 668 6-1 (ISO 1336 6-1 ), tốt thực