Tiêu chuẩn Quốc gia TCVN 8131:2009 về vi sinh vật trong thực phẩm và thức ăn chăn nuôi - Phương pháp phát hiện Shigella spp qui định phương pháp phát hiện Shigella spp. Mời các bạn cùng tham khảo nội dung chi tiết.
TIÊU CHUẨN QUỐC GIA TCVN 8131 : 2009 ISO 21567 : 2004 VI SINH VẬT TRONG THỰC PHẨM VÀ THỨC ĂN CHĂN NUÔI - PHƯƠNG PHÁP PHÁT HIỆN SHIGELLA SPP Microbiology of food and animal feeding stuff - Horizontal method for the detection of Shigella spp Lời nói đầu TCVN 8131 : 2009 hoàn toàn tương đương với ISO 21567 : 2004; TCVN 8131 : 2009 Ban kỹ thuật tiêu chuẩn quốc gia TCVN/TC/F13 Phương pháp phân tích lấy mẫu biên soạn, Tổng cục Tiêu chuẩn Đo lường Chất lượng đề nghị, Bộ Khoa học Công nghệ cơng bố Lời giới thiệu Do tính đa dạng thực phẩm thức ăn chăn nuôi nên phương pháp khơng thích hợp đến chi tiết cho sản phẩm cụ thể Trong trường hợp này, sử dụng phương pháp khác đặc trưng cho sản phẩm, hồn tồn lý kỹ thuật Tuy nhiên, cần cố gắng áp dụng phương pháp Khi tiêu chuẩn sốt xét tiếp cần phải tính đến thơng tin sẵn có liên quan đến phạm vi mà phương pháp đếm đĩa tiến hành nguyên nhân gây sai lệch so với phương pháp trường hợp sản phẩm cụ thể Việc hài hòa phương pháp thử khơng thực vài nhóm sản phẩm tồn tiêu chuẩn và/hoặc tiêu chuẩn quốc gia mà không phù hợp với tiêu chuẩn Trong trường hợp có sẵn tiêu chuẩn sản phẩm cần thử nghiệm phải tn theo tiêu chuẩn Thơng thường, tiêu chuẩn nói sốt xét, chúng phải sửa đổi để phù hợp với tiêu chuẩn này, cho cuối sai lệch với phương pháp đếm đĩa lý kỹ thuật thật cần thiết VI SINH VẬT TRONG THỰC PHẨM VÀ THỨC ĂN CHĂN NUÔI - PHƯƠNG PHÁP PHÁT HIỆN SHIGELLA SPP Microbiology of food and animal feeding stuff - Horizontal method for the detection of Shigella spp CẢNH BÁO - Khi áp dụng tiêu chuẩn cần phải sử dụng vật liệu, thiết bị thao tác nguy hiểm Người sử dụng tiêu chuẩn phải tự thiết lập thao tác an tồn thích hợp xác định khả áp dụng giới hạn qui định trước sử dụng tiêu chuẩn Thận trọng thải bỏ tất vật liệu lây nhiễm Phạm vi áp dụng Tiêu chuẩn qui định phương pháp phát Shigella spp Tiêu chuẩn áp dụng cho: - sản phẩm dùng cho người dùng làm thức ăn chăn nuôi; - mẫu môi trường khu vực sản xuất chế biến thực phẩm Tài liệu viện dẫn Các tài liệu viện dẫn sau cần thiết cho việc áp dụng tiêu chuẩn Đối với tài liệu viện dẫn ghi năm công bố áp dụng phiên nêu Đối với tài liệu viện dẫn không ghi năm công bố áp dụng phiên nhất, bao gồm sửa đổi, bổ sung (nếu có) TCVN 6263 (ISO 8261), Sữa sản phẩm sữa - Hướng dẫn chung chuẩn bị mẫu thử, huyền phù ban đầu dung dịch pha loãng thập phân để kiểm tra vi sinh vật TCVN 6404 (ISO 7218), Vi sinh vật thực phẩm thức ăn chăn nuôi - Nguyên tắc chung kiểm tra vi sinh vật TCVN 6507-1 (ISO 6887-1), Vi sinh vật thực phẩm thức ăn chăn nuôi - Chuẩn bị mẫu thử, dung dịch huyền phù ban đầu dung dịch pha loãng thập phân để kiểm tra vi sinh vật Phần 1: Các nguyên tắc chung để chuẩn bị huyền phù ban đầu dung dịch pha loãng thập phân TCVN 6507-2 (ISO 6887-2), Vi sinh vật thực phẩm thức ăn chăn nuôi - Chuẩn bị mẫu thử, dung dịch huyền phù ban đầu dung dịch pha loãng thập phân để kiểm tra vi sinh vật Phần 2: Các nguyên tắc cụ thể để chuẩn bị mẫu thịt sản phẩm thịt TCVN 6507-3 (ISO 6887-3), Vi sinh vật thực phẩm thức ăn chăn nuôi - Chuẩn bị mẫu thử dung dịch huyền phù ban đầu dung dịch pha loãng thập phân để kiểm tra vi sinh vật Phần 3: Các nguyên tắc cụ thể để chuẩn bị mẫu thủy sản sản phẩm thủy sản TCVN 6507-4 (ISO 6887-4), Vi sinh vật thực phẩm thức ăn chăn nuôi - Chuẩn bị mẫu thử, dung dịch huyền phù ban đầu dung dịch pha loãng thập phân để kiểm tra vi sinh vật Phần 4: Các nguyên tắc cụ thể để chuẩn bị sản phẩm khác với sữa sản phẩm sữa, thịt sản phẩm thịt, thủy sản sản phẩm thủy sản TCVN 8128-1 : 2009 (ISO/TS 11133-1 : 2009), Vi sinh vật thực phẩm thức ăn chăn nuôi - Hướng dẫn chuẩn bị sản xuất môi trường cấy - Phần 1: Các hướng dẫn chung đảm bảo chất lượng cho việc chuẩn bị mơi trường cấy phòng thử nghiệm TCVN 8128-2 : 2009 (ISO/TS 11133-2 : 2009), Vi sinh vật thực phẩm thức ăn chăn nuôi - Hướng dẫn chuẩn bị sản xuất môi trường cấy - Phần 2: Các hướng dẫn thực hành thử hiệu môi trường cấy Thuật ngữ định nghĩa Trong tiêu chuẩn sử dụng thuật ngữ định nghĩa sau đây: 3.1 Shigella (shigella) Các vi sinh vật tạo thành khuẩn lạc phù hợp với mơ tả lồi mơi trường chọn lọc đặc sử dụng, cho thấy có đặc tính sinh hóa vào huyết học mô tả phép thử thực theo tiêu chuẩn 3.2 Phát Shigella spp (detection of Shighella spp.) Xác định có mặt hay khơng có mặt vi sinh vật phần khối lượng cụ thể mẫu thử phép thử tiến hành theo tiêu chuẩn Nguyên tắc 4.1 Yêu cầu chung Việc phát Shigella cần đến bốn giai đoạn liên tiếp (xem Phụ lục A) 4.2 Tăng sinh môi trường lỏng chọn lọc Phần mẫu thử cấy vào canh thang Shigella có chứa novobioxin 0,5 µg/ml, ủ kỵ khí 41,5 oC ± oC 16 h đến 20 h 4.3 Đổ đĩa nhận biết khuẩn lạc Cấy dịch cấy tăng sinh thu vào ba môi trường phân biệt chọn lọc: thạch MacConkey có tính chọn lọc thấp; thạch XLD có tính chọn lọc trung bình thạch Hektoen có độ nhạy cao Tất đĩa ủ 37 oC 20 h đến 24 h 4.4 Khẳng định sinh hóa huyết học Chọn khuẩn lạc điển hình nghi ngờ môi trường từ ba môi trường thạch chọn lọc Các khuẩn lạc cấy khiết thạch dinh dưỡng, tiến hành phép thử sinh hóa huyết học mơ tả Môi trường nuôi cấy, thuốc thử kháng huyết (antisera) Về thực hành phòng thử nghiệm hành, xem TCVN 6404 (ISO 7218) TCVN 8128-1 : 2009 (ISO/TS 11133-1 : 2009) TCVN 8128-2 : 2009 (ISO/TS 11133-2 : 2003) cách chuẩn bị, sản xuất thử nghiệm hiệu môi trường nuôi cấy Chỉ sử dụng thuốc thử loại tinh khiết phân tích, nước cất nước loại khống nước có chất lượng tương đương, trừ có qui định khác Xem Phụ lục B mô tả tất môi trường, thuốc thử kháng huyết Các môi trường khô bán sẵn phải cho kết ổn định so với kết môi trường chuẩn bị từ thành phần chúng phòng thử nghiệm Thực xác hướng dẫn nhà sản xuất, thay đổi nhỏ việc chuẩn bị làm thay đổi đáng kể hiệu mơi trường Việc làm nóng mức môi trường thạch chọn lọc hấp áp lực, bảo quản làm nóng lại để sử dụng làm giảm độ nhạy mơi trường Thiết bị dụng cụ thủy tinh Có thể dùng thiết bị, dụng cụ dùng lần thay cho việc sử dụng lại dụng cụ thủy tinh chúng có qui định kỹ thuật tương tự Sử dụng thiết bị, dụng cụ phòng thử nghiệm phân tích vi sinh thơng thường [xem TCVN 6404 (ISO 7218)] cụ thể sau: 6.1 Thiết bị để khử trùng khô (tủ sấy) để khử trùng ướt (nồi hấp áp lực) Xem TCVN 6404 (ISO 7218) 6.2 Tủ sấy lò sấy, thơng gió đối lưu, có khả trì nhiệt độ 37 oC đến 55 oC 6.3 Tủ ấm, có khả trì nhiệt độ 37 oC ± oC 41,5 oC ± oC 6.4 Bình có mơi trường cải biến tủ cấy kỵ khí thiết bị liên quan để đạt điều kiện kỵ khí có thành phần khí O2 < % CO2 từ % đến 13 % Xem TCVN 6404 (ISO 7218) 6.5 Nồi cách thủy, trì nhiệt độ 47 oC ± oC để làm tan chảy môi trường trước đổ đĩa nồi cách thủy khác trì nhiệt độ 50 oC ± oC (Xem B.6.3.2 B.10.2.2) 6.6 Bộ đồng hóa kiểu nhu động (dạng túi) máy trộn quay Xem TCVN 6404 (ISO 7218) 6.7 Kim cấy que cấy vòng, platin/iridi niken/crom có đường kính khoảng mm kim cấy que cấy vòng chất dẻo sử dụng lần có yêu cầu thích hợp 6.8 Máy đo pH, xác hiệu chuẩn đến ± 0,1 đơn vị pH 25 oC 6.9 Bình cầu chai, có nắp đậy, có dung tích thích hợp cho việc chuẩn bị bảo quản canh thang tăng sinh thạch 6.10 Ống đong 6.11 Ống nghiệm, có đường kính khoảng 18 mm, dài 160 mm (có nút đậy nắp vặn), chai cấy có dung tích danh định 30 ml 10 ml, có nắp đậy kim loại khơng độc có lớp lót nắp đậy chất dẻo dùng lần 6.12 Đĩa Petri, có đường kính từ 90 mm đến 100 mm loại khác có đường kính 140 mm 6.10 Phiến kính kính, thích hợp cho phép thử ngưng kết Lấy mẫu Mẫu gửi đến phòng thử nghiệm phải mẫu đại diện Mẫu không bị hư hỏng biến đổi suốt trình vận chuyển bảo quản Việc lấy mẫu không qui định tiêu chuẩn Xem tiêu chuẩn cụ thể có liên quan đến sản phẩm Nếu chưa có tiêu chuẩn cụ thể liên quan đến sản phẩm bên có liên quan nên thỏa thuận với vấn đề Chuẩn bị mẫu thử Chuẩn bị mẫu thử theo phần thích hợp TCVN 6507 (ISO 6887) và/hoặc TCVN 6263 (ISO 8261) Phân tích mẫu nhanh tốt sống sót Shigella yếu Cách tiến hành (Xem sơ đồ Phụ lục A) 9.1 Phần mẫu thử Xem phần thích hợp TCVN 6507 (ISO 6887) và/hoặc TCVN 6263 (ISO 8261) tùy thuộc vào sản phẩm có liên quan 9.2 Tăng sinh Cho x g x ml phần mẫu thử vào 9x ml canh thang Shigella chứa novobioxin 0,5 µg/ml (B.1.2) để tạo dung dịch huyền phù mẫu thử 1:10 Đồng hóa phần mẫu thử canh thang dùng đồng hóa kiểu nhu động máy trộn quay (6.6) Chỉnh pH đến 7,0 ± 0,2 cách vô trùng, cần Ủ canh thang Shigella điều kiện kỵ khí (6.4) có nắp đậy nới lỏng nắp, có phận cho hiệu tương đương, cho việc trao đổi khí dễ dàng xảy mà không bị nhiễm bẩn nhiệt độ 41,5 oC ± oC (6.3) 16 h đến 20 h 9.3 Đổ đĩa chọn khuẩn lạc 9.3.1 Dùng dịch cấy thu 9.2, lắc nhẹ nhàng tay để trộn mẫu hạt to lắng xuống Dùng que cấy vòng (6.7) cấy lên bề mặt đĩa đựng môi trường thạch chọn lọc sau đây: thạch MacConkey (B.2.1) có tính chọc lọc thấp; thạch XLD (B.2.2) có tính chọn lọc trung bình thạch Hektoen (B.2.3) có độ nhạy cao nhất, để thu khuẩn lạc mọc tách biệt tốt: 9.3.2 Ủ đĩa tủ (6.3) 37 oC ± oC 20 h đến 24 h 9.3.3 Sự thể bên loài Shigella khác thay đổi đĩa thạch chọn lọc Xem Phụ lục C mô tả khuẩn lạc Shigella đĩa thạch phân biệt chọn lọc sử dụng Các lồi Shigella tạo thành tỷ lệ nhỏ hệ vi khuẩn tổng số có nhiễm bẩn mẫu thực phẩm sau tăng sinh Trong trường hợp này, việc cấy vạch trực tiếp canh thang tăng sinh lên đĩa thạch chọn lọc làm cho phát sai khuẩn lạc Shigella Do đó, thích hợp (ví dụ: phát thực phẩm gây ngộ độc) cần xem xét nuôi cấy hai đĩa Petri đường kính 90 mm đĩa Petri lớn (140 mm) (6.12) để tăng khả phát Vẻ bên số khuẩn lạc số chủng Enterobacteriacea giống với khuẩn lạc Shigella Mọi khuẩn lạc điển hình nghi ngờ phải khẳng định (xem 9.4) xem có phải lồi Shigella hay khơng Cũng số trường hợp (ví dụ: thực phẩm gây ngộ độc), kiểm tra nhiều năm khuẩn lạc từ đĩa để tăng mức độ tin cậy việc khơng có mặt Shigella mẫu thực phẩm thử nghiệm Đánh dấu tất khuẩn lạc điển hình nghi ngờ tìm thấy đĩa Nếu khơng thấy khuẩn lạc điển hình vi sinh vật khác mọc yếu (cụ thể thạch có độ nhạy cao nhất), ủ lại đĩa thêm 24 h Kiểm tra lại đĩa khuẩn lạc Shigella điển hình Tiến hành qui trình khẳng định 9.4 9.4 Khẳng định khuẩn lạc 9.4.1 Yêu cầu chung Có thể sử dụng thử nhận biết (có bán sẵn) người sử dụng cho thấy đáng tin cậy nhận biết loài Shigella khác Thực xác theo hướng dẫn nhà sản xuất Để khẳng định, cấy truyền từ đĩa đựng môi trường chọn lọc (xem 9.3) năm khuẩn lạc điển hình nghi ngờ đánh dấu Nếu đĩa có năm khuẩn lạc điển hình nghi ngờ, lấy tất khuẩn lạc có mặt để thử khẳng định Sử dụng dịch cấy khiết để khẳng định sinh hóa huyết 9.4.2 Cấy khiết khuẩn lạc Cấy vạch khuẩn lạc chọn lên bề mặt đĩa thạch dinh dưỡng (B.3) cho thu khuẩn lạc mọc tách biệt tốt Ủ đĩa tủ (6.3) 37 oC ± oC 18 h đến 24 h Nếu khuẩn lạc thạch dinh dưỡng mọc lẫn cấy truyền khuẩn lạc nghi ngờ lên đĩa thạch dinh dưỡng khác ủ 37 oC ± oC 18 h đến 24 h để thu khuẩn lạc khiết Shigella sonnei cho hai kiểu khuẩn lạc đĩa thạch: khuẩn lạc dạng lồi, tròn, trơn nhẵn (giai đoạn 1) khuẩn lạc dẹt bề mặt mờ đục (giai đoạn 2) CHÚ THÍCH: Nếu có thể, trước tiên thử khuẩn lạc đặc trưng từ đĩa thạch chọn lọc Nếu dương tính, khơng cần thiết phải kiểm tra khuẩn lạc khác Nếu âm tính, tiến hành kiểm tra khuẩn lạc khác tìm thấy tất âm tính dương tính 9.4.3 Khẳng định sinh hóa 9.4.3.1 Yêu cầu chung Dùng kim cấy (6.7) cấy dịch cấy thu 9.4.1 vào môi trường qui định 9.4.3.2 đến 9.4.3.9 ghi lại kết 9.4.3.2 Thạch sắt ba đường (thạch nghiêng TSI) (B.4) Cấy đâm sâu cấy vạch bề mặt thạch nghiêng Ủ đĩa tủ (6.3) 37 oC ± oC 24 h ± h Diễn giải thay đổi môi trường sau: Vùng cấy Cấy đâm sâu Cấy bề mặt nghiêng Bề Cho thấy Màu vàng Lên men glucoza: dương tính Màu đỏ khơng đổi màu Khơng lên men glucoza: âm tính Màu đen Sinh hydro sulfua: dương tính Có bọt khí rạn nứt Sinh khí Màu vàng Sử dụng lactoza và/hoặc sacaroza: dương tính Màu đỏ khơng đổi màu Khơng sử dụng lactoza sacaroza: âm tính Các chủng cấy Shigella điển hình cho thấy có màu vàng cấy đâm sâu (sinh axit) khơng có bọt khí, không đổi màu cấy bề mặt nghiêng (không sử dụng lactoza sacaroza) không sinh hydro sulfua (xem Bảng 1) 9.4.3.3 Thạch dinh dưỡng nửa đặc để dùng cho phép thử tính di động (B.5) Dùng kim cấy (6.7) cấy đâm sâu khuẩn lạc vào thạch dinh dưỡng nửa đặc Ủ tủ (6.3) 37 oC ± oC 18 h đến 24 h Kiểm tra đường cấy phát triển lan rộng Các vi sinh vật không di động cho đường rời rạc; chủng di động phát triển phân tán xung quanh đường cấy Tất loài Shigella không di động 9.4.3.4 Thạch ure (B.6) Cấy ria bề mặt thạch Ủ tủ (6.3) 37 oC ± oC 24 h ± h Nếu ure bị thủy phân, có màu hồng đến hồng đậm giải phóng amoniac từ việc phân hủy ure với đổi màu chất thị pH Khi khơng có đổi màu thạch chứng tỏ phản ứng âm tính Các lồi Shigella khơng thủy phân ure 9.4.3.5 Môi trường L-Lysin decacboxylaza (B.7) Cấy phía bề mặt canh thang Ủ tủ (6.3) 37 oC ± oC 24 h ± h Sau ủ thấy đục đỏ tía chứng tỏ phản ứng dương tính Màu vàng phản ứng âm tính Các lồi Shigella khơng khử nhóm carboxyl lysin CHÚ THÍCH: Sử dụng parafin phủ lên ống đảm bảo điều kiện kỵ khí 9.4.3.6 Mơi trường L-Ornithin decacboxylaza (B.8) Cấy bề mặt canh thang Ủ tủ (6.3) 37 oC ± oC 24 h ± h Sau ủ có màu đỏ tía chứng tỏ phản ứng dương tính; màu vàng chứng tỏ phản ứng âm tính Shigella sonnei khử nhóm carboxyl ornithin, lồi Shigella khác khơng (xem Bảng 1) Bảng - Khẳng định phân biệt sinh hóa loài Shigella với Escheriachia coll, loài Hafnia Providencia Phép thử Escherichia Các loài Providencia Shigella Shigella Shigella Shigella coli Hafnia sonnei flexneri dysenteriae bodil Sinh H2S từ TSI - - - - - - - Sinh khí từ glucoza (TSI) + V + - - -e -e Tính di động + V V - - - - Ureaza - - V - - - - L-Lysin decacboxylaza V + - - - - -i L-Ornithin V + - + - - - decacboxylaza Sinh indol + - + - Vd (61 %) Vd (44 %) Vd (29 %) β-galactosidaza + V - + (95 %) - Vf (50 %) Vf (11 %) Axit từ: Dulcitol V V - Glucoza + + - Lactoza V V - Mannitol + + V Melibioza V V V Raffinoza V V - Salixin V V - Sorbitol + - - - Vg (9,4 %) Vg (4,5 %) +(100 %) + (100 %) -c + (100 %) + (100 %) - -a - + (98 %) V V - - -a + (99 %) + b (94 %) - Vg (6,7 %) V -c (25 %) V (53 %) - - - - - V (31 %) V (29 %) V (42 %) - - c Sacaroza V - V - (15 %) - Xyloza + + - - - Vh (4,0 %) V (57 %) V: chủng khác serovar loài đưa theo (x %) cho thấy phần trăm chủng dương tính1) a số chủng S flexneri serovar 2a S boydii sinh axit b số chủng S flexneri serovar 6b không sinh axit c Shigella sonnei sinh axit sau ủ vài ngày d số chủng Shigella dysenteriae, S flexneri serovar S boydii âm tính e chủng S flexneri S boydii serovar 13 14 sinh axit sinh khí f chủng S dysenteriae serovar S boydii serovar 13 ln dương tính g chủng S dysenteriae serovar S flexneri serovar dương tính h chủng S dysenteriae serovar 10 dương tính và thay đổi khác i có chủng S boydii serovar 13 dương tính 9.4.3.7 Phát hình thành Indol (B.9) Cấy dịch cấy khiết vào ống chứa ml môi trường tryptophan/trypton (B.9.1) Ủ tủ (6.3) 37 oC ± oC 24 h ± h Sau ủ, thêm ml thuốc thử Kovac (B.9.2) Sự hình thành vòng màu đỏ vòng 10 cho thấy có sinh indol màu nâu/vàng chứng tỏ phản ứng âm tính Shigella sonnei âm tính chủng khác cho phản ứng khác (xem Bảng 1) 9.4.3.8 Phát β-galactosidaza (B.10) Theo Ewing W.H Lindberg A.A Serology of the Shigella Trong: Methods in Microbiology (Ed Bergan T.), Vol 14, Acacdemic Press, 1984 Hòa vòng đầy dịch cấy khiết từ thạch dinh dưỡng vào ống nghiệm chai có chứa 0,25 ml dung dịch muối (B.12), vặn nắp chai ống nghiệm Thêm giọt toluen lắc kỹ ống Đặt ống vào tủ ấm (6.7) đặt 37 oC để vài phút Thêm 0,25ml thuốc thử để phát -galactosidaza lắc Đặt lại ống vào tủ ấm (6.7) để 37 ºC để 24 h ± h, kiểm tra ống thường xuyên Màu vàng chứng tỏ sinh β-galactosidaza, phản ứng thường xuất 20 Shigella sonnei dương tính, B dysenteriae S boydii cho phản ứng khác S flexneri âm tính (xem Bảng 1) 9.4.3.9 Sử dụng cacbohydrat (B.11) Cấy lượng nhỏ dịch cấy vào canh thang cacbohydrat chuẩn bị Ủ tủ (6.3) 37 oC ± oC 24 h ± h Phản ứng dương tính cacbohydrat dùng để đổi màu chất thị pH từ màu tía sang màu vàng Bảng đưa phản ứng loài Shigella khác 9.4.3.10 Diễn giải kết sinh hóa Các chủng thuộc số lồi Shigella khác phản ứng sinh hóa (xem Bảng 1), việc diễn giải dựa vào kết sinh hóa khó cần phải khẳng định kiểu huyết Shigella trực khuẩn Gram âm, có kích thước từ µm đến µm ± 0,5 µm, thường dạng vi khuẩn hình cầu ngắn điển hình khơng sinh khí từ glucoza Chúng khơng di động, khơng sinh khí hydro sulfua lysin khử nhóm cacboxyl âm tính lactoza 24 h Các phép thử khác mô tả cho phản ứng khác khác phản ứng theo loài Trong giống Shigella, mannitol phân biệt Shigella dysenteriae (âm tính) với lồi khác LOrnithin decacboxylaza phân biệt Shigella sonnei (dương tính) với lồi khác 9.4.4 Phân biệt sinh hóa bổ sung 9.4.4.1 Yêu cầu chung Khuyến cáo thực bổ sung phép thử phân biệt sinh hóa để nhận biết tốt chủng: số chủng Escherichia coli giống loài Shigella 9.4.4.2 Natri axetat Cấy vạch chủng cấy khiết (9.4.1) vào bề mặt nghiêng môi trường natri axetat (B.13) Dùng kim cấy thẳng để giảm tối đa môi trường bị chuyển sang với dịch cấy, dùng kim cấy Ủ điều kiện hiếu khí ngày 37 oC ± oC Kiểm tra môi trường xanh phát triển: môi trường chuyển sang màu xanh da trời chứng tỏ phản ứng dương tính Kiểm tra phát triển, có màu xanh da trời cho thấy phản ứng dương tính Nếu khơng thấy phát triển, ủ thêm ngày 37 oC ± oC Kiểm tra lại mơi trường Các lồi Shigella khơng phát triển phát triển yếu Các chủng E coli cho khuẩn lạc màu xanh da trời bao quanh môi trường xanh da trời/xanh 9.4.4.3 Christensen xitrat Dùng kim cấy, cấy dịch cấy khiết (9.4.1) vào bề mặt nghiêng Christensen xitrat (B.14) Hạn chế tối đa môi trường bị chuyển sang với dịch cấy Ủ điều kiện hiếu khí ngày 37 oC ± oC Kiểm tra để phát phát triển màu kem/hồng Trong trường hợp này, môi trường chuyển sang màu đỏ Nếu không thấy phát triển ủ thêm ngày kiểm tra lại mơi trường Các lồi Shigella khơng phát triển 9.4.4.4 Natri mucat Cấy dịch cấy khiết (9.4.1) vào canh thang thử nghiệm (B.15.1) canh thang kiểm chứng (B.15.2) Ủ điều kiện hiếu khí ngày 37 oC ± oC Kiểm tra môi trường phát triển đổi màu Màu xanh da trời chứng tỏ phản ứng âm tính màu vàng rơm/vàng chứng tỏ phản ứng dương tính Nếu khơng thấy phát triển, ủ thêm ngày 37 oC ± oC Kiểm tra lại môi trường Shigella sonnei cho phản ứng khác lồi Shigella khác âm tính Các chi tiết phản ứng loài Shigella, xem Bảng Bảng - Các phép thử sinh hóa bổ sunga để phân biệt số chủng Shigella spp Escherichia coli Phản ứng sinh hóa (phát triển) thời gian ủ xác định Loài Natri axetat Christensen xitrat Natri mucat + % ngày + % sau ngày + % ngày + % sau ngày + % ngày + % sau ngày S dysenteriae - (0) - (0) - (0) - (0) - (0) - (0) S flexneri - (0) - (0) - (0) - (0) - (0) - (0) S boydii - (0) - (0) - (0) - (0) - (0) - (0) S sonnei - (0) - (0) - (0) - (0) V (6,4) V (36,7) V (83,8) + (93,5) V (> 15,3) V (> 34,2) + (91,6) + (93,0) E coli + > 90 % chủng dương tính - > 90 % chủng âm tính V kết chủng dương tính dao động từ 10 % đến 89 % % phần trăm kết dương tính xác định sau ủ a lấy từ Sổ tay Phân tích Sinh hóa, xuất lần thứ (soát xét năm 1997), FDA, USA 9.5 Khẳng định huyết 9.5.1 Phân biệt kháng ngun Các lồi Shigella khơng di động khơng có kháng ngun lơng Việc phân biệt loài phụ thuộc vào phép phân tích kháng ngun thân nhóm "O" kháng ngun kiểu "O" cụ thể (xem Bảng 3) Việc định kiểu serovar tốt Phòng thử nghiệm Chuẩn thực Cần đến chủng cấy phát triển thạch dinh dưỡng (xem 9.4.1) Tiến hành phép thử ngưng kết phiến kính kính (6.13) có kích thước phù hợp Bảng - Phân biệt tính kháng ngun lồi Shigella Các lồi Shigella Nhóm kháng nguyên Serovar (chỉ kháng nguyên cụ thể) S dysenteriae A 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13 S flexneri B 1a, 1b, 2a, 2b, 3a, 3b, 4a, 4b, 5a, 5b, 6, X, Y S boydii C 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18 S sonnei D CHÚ THÍCH 1: Các nhóm kháng nguyên (A, B, C, D) chứa kháng nguyên nhỏ mà phản ứng chéo với kháng nguyên nhóm khác, điều tránh cách sử dụng kháng huyết hấp thụ và/hoặc pha loãng đến mức qui định Một số lồi, cụ thể Shigella dysenteriae có kháng ngun vỏ mà che nhóm che kháng nguyên serovar tránh làm ngưng kết với kiểu kháng huyết cụ thể Kháng nguyên vỏ loại cách đun nóng huyền phù đến 100 oC thời gian từ 15 đến 60 CHÚ THÍCH 2: Các Shigella sonnei nhóm kháng nguyên D có mặt hai dạng khuẩn lạc trơn nhẵn thô ráp khơng có phản ứng chéo với nhóm kháng nguyên Shigella khác Không giống Enterobacteriae khác, dạng khuẩn lạc thô S sonnei không tự ngưng kết Shigella sonnei khơng có kháng ngun vỏ 9.5.2 Phép thử ngưng kết Thực xác hướng dẫn nhà sản xuất chuẩn bị kháng huyết phép thử ngưng kết Cho giọt kháng huyết nhóm giọt dung dịch muối (B.12) riêng rẽ phiến kính (6.13) Phân tán phần khuẩn lạc cần thử giọt nước muối phần khuẩn lạc giọt dung dịch kháng huyết cho để thu huyền phù đồng đục giọt Lắc nhẹ phiến kính 30 s đến 60 s Quan sát kết đen, sử dụng kính lúp, cần Nếu khuẩn lạc giọt kháng huyết kết thành mảng gồm nhiều hạt khác biệt khơng có ngưng kết giọt nước muối, khuẩn lạc phân lập dương tính nhóm thử nghiệm Nếu ngưng kết nước muối, chủng coi tự ngưng kết không sử dụng tiếp Cần kiểm tra khuẩn lạc khác từ chủng cấy khuẩn lạc phân lập khác từ môi trường thạch chọn lọc ban đầu lấy để kiểm tra có phản ứng hóa sinh cho thấy có mặt Shigella Nếu tất khuẩn lạc tự ngưng kết, cần Phòng thử nghiệm chuẩn tư vấn để nhận biết khuẩn lạc phân lập Nếu tất phép thử âm tính phép thử sinh hóa cho thấy đặc trưng Shigella đun nóng huyền phù chủng khiết nồi cách thủy 100 oC 60 lặp lại phép thử ngưng kết 9.5.3 Khẳng định cuối Để khẳng định và/hoặc phân tích ngồi yếu tố "nhóm" (xem Bảng 3), khuẩn lạc phân lập phải gửi đến Phòng thử nghiệm Chuẩn công nhận để khẳng định typ Khi gửi để định dạng phải kèm theo tất thông tin liên quan đến khuẩn lạc phân lập 10 Biểu thị kết Theo diễn giải kết quả, báo cáo có mặt hay khơng có mặt lồi Shigella x g x ml phần mẫu thử 11 Báo cáo thử nghiệm Báo cáo thử nghiệm phải rõ: a) thông tin cần thiết để nhận biết đầy đủ mẫu thử; b) phương pháp lấy mẫu sử dụng, biết; c) phương pháp thử nghiệm dùng, viện dẫn tiêu chuẩn này; d) chi tiết thao tác khác với quy định tiêu chuẩn điều coi tùy ý cố mà ảnh hưởng đến kết e) kết thử nghiệm thu Phụ lục A (Quy định) Lưu đồ quy trình thử nghiệm Phụ lục B (Quy định) Thành phần chuẩn bị môi trường nuôi cấy thuốc thử B.1 Canh thang tăng sinh chọn lọc B.1.1 Canh thang Shigella B.1.1.1 Thành phần Dịch thủy phân casein enzym 20,0 g Kalihydrophosphat (khan) 2,0 g Kali dihydrophosphat (khan) 2,0 g Natri clorua 5,0 g D (+)-Glucoza 1,0 g Polyoxyetylensorbitan monooleat (Tween 80) Nước 1,5 ml 000 ml B.1.1.2 Chuẩn bị Hòa tan thành phần (hoặc mơi trường hồn chỉnh khơ) nước cách đun nóng nhẹ, cần Chỉnh pH cho sau khử trùng pH 7,0 ± 0,2 25 oC, dùng máy đo pH (6.8), cần Phân phối lượng 225 ml mơi trường vào bình chai (6.9) có dung tích thích hợp, vật chứa lớn phân tích Khử trùng 15 nồi hấp áp lực (6.1) 121 oC Nếu môi trường chưa sử dụng ngay, bảo quản oC ± oC, loại bỏ sau tháng chưa sử dụng B.1.2 Dung dịch Novobioxin B.1.2.1 Thành phần Novobioxin 25,0 mg Nước cất 000 ml B.1.2.2 Chuẩn bị Hòa tan Novobioxin nước Lọc để khử trùng qua màng lọc 0,2 µm [xem TCVN 6404 (ISO 7218)] Bảo quản dung dịch oC ± oC loại bỏ dung dịch chưa sử dụng vòng tháng B.1.3 Mơi trường hồn chỉnh Ngay sử dụng, cho thêm ml dung dịch novobioxin (B.1.2) vào 225 ml canh thang Shigella (B.1.1) 22 ml dung dịch novobioxin lít canh thang Shigella chuẩn bị thể tích lớn Trộn kỹ Mơi trường có nồng độ novobioxin cuối 0,5 µg/ml canh thang sau bổ sung 25 g 25 ml mẫu thử B.2 Các môi trường thạch phân biệt chọn lọc B.2.1 Thạch MacConkey Dịch thủy phân casein mô động vật enzym 20,0 g Lactoza 10,0 g Muối mật Số 1,5 g Natri clorua 5,0 g Đỏ trung tính 0,03 g Tím tinh thể 0,001 g Thạch g đến 18 ga Nước 000 ml a Tùy thuộc vào sức đông thạch B.2.2 Chuẩn bị Hòa tan thành phần mơi trường hồn chỉnh khơ nước cách đun nóng thời gian vừa đủ để hòa tan thành phần Chỉnh pH cho sau khử trùng 7,1 ± 0,2 25 oC, cần Khử trùng 15 nhiệt độ 121 oC nồi hấp áp lực (6.1), theo dẫn nhà sản xuất Làm nguội môi trường tan chảy nồi cách thủy (6.5) để 47 oC Rót mơi trường với lượng 15 ml vào đĩa Petri đông đặc lại mặt phẳng mát, nằm ngang Ngay trước sử dụng, làm khô đĩa thạch cách cẩn thận, tháo bỏ nắp úp bề mặt thạch xuống cho vào tủ sấy (6.2) để nhiệt độ từ 37 oC đến 55 oC bề mặt thạch khô để buồng sấy để bề mặt thạch hướng lên Nếu đĩa thạch chuẩn bị trước, đĩa chưa khơ gói vào túi chất dẻo (hoặc tương tự) để tránh bị khô bảo quản oC ± oC Loại bỏ đĩa chưa sử dụng vòng tuần B.2.2 Thạch deoxycolat lysin xyloza (thạch XLD) CHÚ THÍCH: Các công thức môi trường bán sẵn thay đổi tùy thuộc vào môi trường hấp áp lực 121 oC hay đun sôi B.2.2.1 Thành phần Chất chiết nấm men 3,0 g L-lysin HCl 5,0 g Xyloza 3,75 g Lactoza 7,5 g Sacaroza 7,5 g Natri clorua 5,0 g Natri deoxycholat 1,0 g Natri thiosulfat 6,8 g Sắt (III) amoni xitrat 0,8 g Đỏ phenol 0,08 g Thạch g đến 18 g a Nước 000 ml a Tùy thuộc vào sức đông thạch B.2.2.2 Chuẩn bị Hòa tan thành phần thành phần hồn chỉnh khơ nước cách đun sơi thời gian ngắn hòa tan Chỉnh pH (6.8) cho sau khử trùng 7,4 ± 0,2 25 oC, cần Làm nguội môi trường tan chảy nồi cách thủy (6.5) để 47 oC Rót mơi trường với lượng 15 ml vào đĩa Petri đông đặc lại mặt phẳng mát, nằm ngang Ngay trước sử dụng, làm khô đĩa thạch cách cẩn thận, tháo bỏ nắp úp bề mặt thạch xuống cho vào tủ sấy (6.2) để nhiệt độ từ 37 oC đến 55 oC bề mặt thạch khô để buồng sấy để bề mặt thạch hướng lên Nếu đĩa thạch chuẩn bị trước, đĩa chưa khơ gói vào túi chất dẻo (hoặc tương tự) để tránh bị khô bảo quản oC ± oC Loại bỏ đĩa chưa sử dụng vòng tuần B.2.3 Thạch Hektoen (HE) B.2.3.1 Thành phần Sản phẩm thủy phân thịt enzym Chất chiết nấm men 12,0 g 3,0 g Lactoza 12,0 g Sacaroza 12,0 g Salixin 2,0 g Muối mật Số 9,0 g Natri clorua 5,0 g Natri thiosulfat 5,0 g Sắt (III) amoni xitrat 1,5 g Axit fucxin 0,1 g Xanh bromothymol 0,065 g Thạch 12 g đến 18 g a Nước 000 ml a Tùy thuộc vào sức đơng thạch B.2.3.2 Chuẩn bị Hòa tan thành phần thành phần hồn chỉnh khơ nước cách đun sôi thời gian ngắn hòa tan thạch theo hướng dẫn nhà sản xuất Chỉnh pH (6.8) cho sau khử trùng 7,5 ± 0,2 25 oC, cần Làm nguội môi trường tan chảy nồi cách thủy (6.5) để 47 oC Rót mơi trường với lượng 15 ml vào đĩa Petri động đặc lại mặt phẳng mát, nằm ngang Ngay trước sử dụng, làm khô đĩa thạch cách cẩn thận, tháo bỏ nắp úp bề mặt thạch xuống cho vào tủ sấy (6.2) để nhiệt độ từ 37 oC đến 55 oC bề mặt thạch khô để buồng sấy để bề mặt thạch hướng lên Nếu đĩa thạch chuẩn bị trước, đĩa chưa khơ gói vào túi chất dẻo (hoặc tương tự) để tránh bị khô bảo quản oC ± oC Loại bỏ đĩa chưa sử dụng vòng tuần B.3 Thạch dinh dưỡng B.3.1 Thành phần Chất chiết thịt 3,0 g Sản phẩm thủy phân casein enzym 5,0 g Thạch 12 g đến 18 g a Nước 000 ml a Tùy thuộc vào sức đông thạch B.3.2 Chuẩn bị Hòa tan thành phần mơi trường hồn chỉnh khơ nước, đun nóng cần Chỉnh pH (6.8) cho sau khử trùng 7,0 ± 0,2 25 oC, cần Chuyển môi trường cấy vào bình chai có dung tích thích hợp Khử trùng 15 nồi hấp áp lực (6.1) 121 oC B.3.3 Chuẩn bị đĩa thạch dinh dưỡng Chuyển khoảng 15 ml môi trường tan chảy, làm nguội đến 47 oC vào đĩa Petri Ngay trước sử dụng, làm khô đĩa thạch cách cẩn thận, tháo bỏ nắp úp bề mặt thạch xuống cho vào tủ sấy (6.2) để nhiệt độ từ 37 oC đến 55 oC bề mặt thạch khô để buồng sấy để bề mặt thạch hướng lên Nếu đĩa thạch chuẩn bị trước, đĩa chưa khơ gói vào túi chất dẻo (hoặc tương tự) để tránh bị khô bảo quản oC ± oC Loại bỏ đĩa chưa sử dụng vòng tuần B.4 Thạch TSI Thạch sắt ba đường B.4.1 Thành phần Chất chiết thịt 3,0 g Chất chiết nấm men 3,0 g Pepton Natri clorua 20,0 g 5,0 g Lactoza 10,0 g Sacaroza 10,0 g Glucoza 1,0 g Sắt (III) xitrat 0,3 g Natri thiosulfat 0,3 g Đỏ phenol 0,024 g Thạch g đến 18 g a Nước 000 ml a Tùy thuộc vào sức đông thạch B.4.2 Chuẩn bị Hòa tan thành phần mơi trường hồn chỉnh khơ nước, đun nóng cần Chỉnh pH (6.8) cho sau khử trùng 7,4 ± 0,2 25 oC, cần Phân phối môi trường lượng 10 ml vào ống nghiệm đĩa (6.11) có dung tích thích hợp Khử trùng 15 nồi hấp áp lực (6.1) 121 oC Đặt nghiêng để thạch có bề dày từ 2,5 cm đến cm Nếu chưa sử dụng bảo quản o C ± oC Loại bỏ vòng tháng chưa sử dụng B.5 Thạch dinh dưỡng nửa đặc B.5.1 Thành phần Chất chiết thịt 3,0 g Sản phẩm thủy phân mô động vật enzym 5,0 g Thạch g đến g a Nước 000 ml a Tùy thuộc vào sức đơng thạch B.5.2 Chuẩn bị Hòa tan thành phần nước cách đun nóng Chỉnh pH (6.8) cho sau khử trùng 7,5 ± 0,2 25 oC, cần Chuyển 10 ml môi trường tan chảy vào ống chai có nắp vặn (6.11) có dung tích thích hợp Khử trùng 15 nồi hấp áp lực (6.1) 121 oC Nếu chưa sử dụng bảo quản oC ± oC Loại bỏ vòng tháng chưa sử dụng B.6 Thạch ure (môi trường Christensen) B.6.1 Môi trường B.6.1.1 Thành phần Sản phẩm thủy phân mô động vật enzym 1,0 g Glucoza 1,0 g Natri clorua 5,0 g Kali dihydro phosphat (KH2PO4) 2,0 g Đỏ phenol 0,012 g Thạch g đến 18 ga Nước 000 ml a Tùy thuộc vào sức đơng thạch B.6.1.2 Chuẩn bị Hòa tan thành phần mơi trường hồn chỉnh khơ nước, đun nóng cần Chỉnh pH (6.8) cho sau khử trùng 6,8 ± 0,2 25 oC, cần Khử trùng 15 nồi hấp áp lực (6.1) 121 oC B.6.2 Dung dịch ure B.6.2.1 Thành phần Ure Nước vừa đủ 400 g 000 ml B.6.2.2 Chuẩn bị Hòa tan ure nước Lọc để khử trùng kiểm tra độ vô trùng Xem TCVN 6404 (ISO 7218) B.6.3 Mơi trường hồn chỉnh B.6.3.1 Thành phần Môi trường (B.6.1) Dung dịch ure (B.6.2) 900 ml 50 ml B.6.2.3 Chuẩn bị Trong điều kiện vô trùng, cho dung dịch ure vào môi trường bản, làm tan chảy trước sau để nguội đến nhiệt độ 47 oC (6.5) Phân phối lượng 10 ml mơi trường hồn chỉnh vào ống đĩa (6.11) có kích thước phù hợp Đặt nghiêng ống nghiệm B.7 Môi trường L-lysin khử nhóm carboxyl B.7.1 Thành phần L-lysin monohydroclorua 5,0 g Chất chiết nấm men 3,0 g Glucoza 1,0 g Bromocresol đỏ tía Nước 0,015 g 000 ml B.7.2 Chuẩn bị Hòa tan thành phần nước, đun nóng cần Chỉnh pH (6.8) cho sau khử trùng 6,8 ± 0,2 25 oC, cần Chuyển lượng môi trường từ ml đến ml vào ống cấy hẹp (6.11) có nắp vặn Khử trùng 15 nồi hấp áp lực (6.1) 121 oC B.8 Mơi trường L-Ornithin khử nhóm carboxyl Tiến hành theo B.7, thay 5,0 g L-lysin monohydroclorua 0,5 g L-Ornithin monohydroclorua B.9 Thuốc thử cho phản ứng indol B.9.1 Môi trường trypton/DL-tryptophan B.9.1.1 Thành phần Sản phẩm thủy phân casein enzym tuyến tụy 10,0 g Natri clorua 5,0 g DL-Tryptophan 1,0 g Nước 000 ml B.9.1.2 Chuẩn bị Hòa tan thành phần nước cách đun sôi Chỉnh pH (6.8) cho sau khử trùng 7,5 ± 0,2 25 oC, cần Phân phối lượng ml môi trường vào ống cấy hẹp chai có nắp vặn (6.11) Khử trùng 15 nồi hấp áp lực (6.1) 121 oC Nếu chưa sử dụng bảo quản oC ± oC Loại bỏ vòng tháng chưa sử dụng B.9.2 Thuốc thử Kovacs cho phản ứng indol B.9.2.1 Thành phần 4-Dimetylaminobenzaldehyt 5,0 g Axit clohydric, (ρ = 1,18 g/ml đến 1,19 g/ml) 25 ml 2-Metylbutan-2-ol 75 ml B.9.2.2 Chuẩn bị Trộn thành phần Bảo quản oC ± oC sử dụng tháng B.10 Thuốc thử β-galactosidaza B.10.1 Dung dịch đệm B.10.1.1 Thành phần Natri dihydro phosphat (NaH2PO4) Natri hydroxit, dung dịch 10 mol/l 6,9 g khoảng ml Nước vừa đủ 50 ml B.10.1.2 Chuẩn bị Hòa tan natri dihydro phosphat khoảng 45 ml nước đựng bình định mức 50 ml Chỉnh pH (6.8) đến 7,0 ± 0,2 25 oC, dung dịch natri hydroxit Thêm nước vừa đủ 50 ml B.10.2 Dung dịch ONPG B.10.2.1 Thành phần o-Nitrophenyl β-D-galactopyransosit (ONPG) 0,08 g Nước 15 ml B.10.2.2 Chuẩn bị Hòa tan ONPG nước khoảng 50 oC (6.5) làm nguội dung dịch B.10.3 Thuốc thử hoàn chỉnh B.10.3.1 Thành phần Dung dịch đệm (B.10.1) Dung dịch ONPG (B.10.2) B.10.3.2 Chuẩn bị Cho dung dịch đệm vào dung dịch ONPG Bảo quản oC ± oC sử dụng tháng ml 15 ml B.11 Canh thang đỏ tía Bromocresol B.11.1 Thành phần Sản phẩm thủy phân mô động vật enzym 10,0 g Chất chiết thịt 3,0 g Natri clorua 5,0 g Cacbohydrat alcol a 10,0 g Đỏ tía bromocresol 0,04 g Nước 000 ml a Các loại cacbohydrat cồn sau dùng riêng rẽ: dulcitol, glucoza, lactoza, mannitol, melibioza, raffinoza, salicin, sorbitol, sacaroza, xyloza B.11.2 Chuẩn bị Hòa tan thành phần mơi trường hồn chỉnh khơ nước, đun nóng cần Chỉnh pH (6.8) cho sau khử trùng 7,0 ± 0,2 25 oC, cần Lọc để khử trùng qua màng lọc 0,2 µm vào hộp chứa vơ trùng Phân phối lượng ml môi trường vào ống chai vơ trùng (6.11) có kích thước phù hợp Kiểm tra vài ống nghiệm đựng môi trường hồn chỉnh độ vơ trùng cách ủ 37 oC 24 h Canh thang bền đến tuần bảo quản oC ± oC B.12 Dung dịch nước muối B.12.1 Thành phần Natri clorua Nước 8,5 g 000 ml B.12.2 Chuẩn bị Hòa tan natri clorua nước Chỉnh pH (6.8) cho sau khử trùng 7,0 ± 0,2 25 oC, cần Phân phối lượng 10 ml dung dịch vào bình chai có nắp vặn Khử trùng 15 nồi hấp áp lực (6.1) 121 oC B.13 Thạch natri axetat B.13.1 Thành phần Natri axetat 2,0 g Natri clorua 5,0 g Magie sulfat (khan) 0,2 g Amoni phosphat 1,0 g Kali dihydro phosphat (K2HPO4) 1,0 g Xanh bromothymol 0,08 g Thạch g đến 18 g a Nước 000 ml a Tùy thuộc vào sức đông thạch B.13.2 Chuẩn bị Hòa tan thành phần nước, trừ magie sulfat, đun nóng trộn, sau thêm magie sulfat theo hướng dẫn nhà sản xuất mơi trường hồn chỉnh khơ Chỉnh pH (6.8) cho sau khử trùng 6,7 ± 0,2 25 oC, cần Phân phối lượng khoảng ml môi trường vào ống nghiệm (6.11) Khử trùng 15 nồi hấp áp lực (6.1) 121 oC Đặt nghiêng để thạch có bề mặt nghiêng cm B.14 Thạch Christensen xitrat B.14.1 Thành phần Natri xitrat 3,0 g Glucoza 0,2 g Chất chiết nấm men 0,5 g Xystein mono hydro clorua 0,1 g Sắt amoni xitrat 0,4 g Kali dihydro phosphat (K2HPO4) 1,0 g Natri clorua 5,0 g Natri thiosulfat 0,08 g Đỏ phenol 0,012 g Thạch g đến 18 g a Nước 000 ml a Tùy thuộc vào sức đông thạch B.14.2 Chuẩn bị Hòa tan thành phần mơi trường hồn chỉnh khơ nước, đun nóng cần Chỉnh pH (6.8) cho sau khử trùng 6,9 ± 0,2 25 oC, cần Phân phối môi trường vào ống nghiệm (6.11) đến phần ba ống, đậy nắp Khử trùng 15 nồi hấp áp lực (6.1) 121 oC Đặt nghiêng để thạch có bề mặt nghiêng cm đến cm có lớp thạch dày từ cm đến cm B.15 Canh thang mucat B.15.1 Canh thang thử nghiệm B.15.1.1 Thành phần Sản phẩm thủy phân casein enzyma 10,0 g Axit mucic 10,0 g Xanh bromothymol Nước a Cách khác, sử dụng 25,0 g canh thang dinh dưỡng số B.15.1.2 Chuẩn bị 0,024 g 000 ml Hòa tan axit mucic cách thêm lượng nhỏ dung dịch natri hydroxit mol/l, trộn Hòa tan sản phẩm thủy phân casein enzym nước, sau thêm axit mucic Chỉnh pH (6.8) cho sau khử trùng 7,4 ± 0,2 25 oC, cần Phân phối lượng ml môi trường vào ống nghiệm (6.11) Khử trùng 15 nồi hấp áp lực (6.1) 121 oC B.15.2 Canh thang kiểm chứng B.15.2.1 Thành phần Sản phẩm thủy phân casein enzym 10,0 g Xanh bromothymol 0,024 g Nước 000 ml B.15.2.2 Chuẩn bị Hòa tan thành phần nước cất Chỉnh pH (6.8) cho sau khử trùng 7,4 ± 0,2 25 oC, cần Phân phối lượng ml môi trường vào ống nghiệm (6.11) Khử trùng 15 nồi hấp áp lực (6.1) 121 oC B.16 Các loài Shigella kháng huyết Cần đến kháng huyết nhóm (kiểu A, B, C D, xem Bảng 3) Các loại sẵn có Phòng thử nghiệm chuẩn có bán sẵn Thực theo hướng dẫn nhà cung cấp liên quan đến việc chuẩn bị sử dụng Phụ lục C (Quy định) Mơ tả hình thái màu sắc khuẩn lạc Shigella thạch chọn lọc, mục đích nhận biết kiểm sốt chất lượng Tất Enterobacteriae tất môi trường có khuẩn lạc tròn có bề mặt trơn nhẵn viền mép liền Kích thước khuẩn lạc phân lập tốt thường > mm Xem chi tiết Bảng C.1 Bảng C.1 - Mơ tả hình thái khuẩn lạc Shigella màu sắc thạch chọn lọc Các loài vi khuẩn Thạch chọn lọc Thạch MacConkey Shigella sonnei a Thạch XLD Thạch Hektoen Không màu đến hồng Trong mờ, có tâm màu Màu xanh nhạt, mờ, lactoza đỏ/đỏ hồng, màu giống khuẩn lạc tăng ẩm âm tính thạch ướt Shigella, lồi khác Khơng màu, mờ, lactoza âm tính Trong mờ, có tâm màu Màu xanh ẩm ướt đỏ/đỏ hồng, màu giống thạch Escherichia coli Màu đỏ, có kết tủa đục Màu vàng, mờ đục bao Màu đỏ/hồng da cam thạch quanh kết tủa vàng trongcó vùng kết tủa thạch thạch Enterobacter cloacae Màu đỏ, có kết tủa đục Màu vàng, mờ đục bao Màu đỏ/hồng da cam thạch quanh kết tủa vàng trongcó vùng kết tủa thạch thạch Kiebseilla pneumoniae Màu đỏ, có kết tủa đục Màu vàng, mờ đục vi Màu đỏ/hồng da cam thạch khuẩn nhầy bao quanh có vùng kết tủa kết tủa vàng thạch Salmonella Không màu mờ, Màu đỏ có tâm đen thạch xung quanh khuẩn lạc có màu vàng Xanh lục lam, có khơng có tâm đen Proteus mirabills Không màu mờ, Màu vàng, tâm đen, thạch xung quanh khuẩn thạch màu vàng có kết lạc có màu vàng tủa Xanh lục lam, có khơng có tâm đen Enterococcus faecalis Màu đỏ, khuẩn lạc tròn nhỏ a Khơng có phát Khơng có phát triển yếu, khuẩn lạc màu triển yếu, khuẩn lạc vàng nhạt màu vàng nhạt Shigella sonnei lên men lactoza sau ủ 40 h, tạo phản ứng nhẹ tương tự Escherichia coli Các khuẩn lạc Shigella sonnei cho thấy biến đổi từ trơn nhẵn đến thô, điều thường kèm theo thất thoát 120 megadalton plasmid thất thoát virut khuẩn lạc tự ngưng kết huyền phù muối kháng huyết ... Sinh H2S từ TSI - - - - - - - Sinh khí từ glucoza (TSI) + V + - - -e -e Tính di động + V V - - - - Ureaza - - V - - - - L-Lysin decacboxylaza V + - - - - -i L-Ornithin V + - + - - - decacboxylaza... ngày S dysenteriae - (0) - (0) - (0) - (0) - (0) - (0) S flexneri - (0) - (0) - (0) - (0) - (0) - (0) S boydii - (0) - (0) - (0) - (0) - (0) - (0) S sonnei - (0) - (0) - (0) - (0) V (6,4) V (36,7)... Salixin V V - Sorbitol + - - - Vg (9,4 %) Vg (4,5 %) +(100 %) + (100 %) -c + (100 %) + (100 %) - -a - + (98 %) V V - - -a + (99 %) + b (94 %) - Vg (6,7 %) V -c (25 %) V (53 %) - - - - - V (31 %)