Tiêu chuẩn ngành 10 TCN 717:2006

Tiêu chuẩn ngành 10 TCN 717:2006 về quy trình chẩn đoán bệnh lở mồm long móng áp dụng để chẩn đoán bệnh Lở mồm long móng (LMLM) tại các phòng xét nghiệm chẩn đoán bệnh động vật. Mời các bạn cùng tham khảo nội dung chi tiết.

BỘ NÔNG NGHIỆP VÀ PHÁT TRIỂN NÔNG THÔN  10TCN                      TIÊU CHUẨN NGÀNH 10 TCN 717­2006 QUY TRÌNH CHẨN ĐỐN BỆNH LỞ MỒM LONG MĨNG                                                                                                              10 TCN  717­2006 Hà Nội ­ 2006 TIÊU CHUẨN NGÀNH                                                                               10 TCN  717­2006 QUY TRÌNH CHẨN ĐỐN  BỆNH LỞ MỒM LONG MĨNG (Ban hành kèm theo Quyết định số                   QĐ/BNN­KHCN ngày          tháng 5 năm 2006 của Bộ trưởng Bộ Nông nghiệp và Phát triển nông thôn) Pham vi ap dung ̣ ́ ̣ Quy trinh nay đ ̀ ̀ ược ap dung đê chân đoan bênh L ́ ̣ ̉ ̉ ́ ̣ ở  môm long mong (LMLM) tai cac ̀ ́ ̣ ́  phong xet nghiêm chân đoan bênh đông vât ̀ ́ ̣ ̉ ́ ̣ ̣ ̣ Đôi t ́ ượng ap dung la đông vât guôc chăn: trâu, bo, l ́ ̣ ̀ ̣ ̣ ́ ̃ ̀ ợn, dê, cừu va môt sô đông vât ̀ ̣ ́ ̣ ̣  hoang da khac nh ̃ ́ ư hươu, nai, Khai niêm ́ ̣ ­ Quy trinh nay cho phep xac đinh co hay không co bênh LMLM, ̀ ̀ ́ ́ ̣ ́ ́ ̣ ­ Xac đinh đ ́ ̣ ược serotype gây bênh. (Virus co 7 serotype khac nhau la O, A, C, Asia 1, ̣ ́ ́ ̀   SAT1, SAT2 va SAT3).  ̀ Lây mâu va bao quan ́ ̃ ̀ ̉ ̉ ­ Bênh phâm la tô ch ̣ ̉ ̀ ̉ ưc biêu mô cua mun n ́ ̉ ̉ ̣ ươc ch ́ ưa vỡ hoăc m ̣ ới vỡ va dich mun ̀ ̣ ̣   nươc. .Mâu bênh phâm biêu mô tôi thiêu la 2 g ́ ̃ ̣ ̉ ̉ ́ ̉ ̀ Bênh phâm sau khi lây đ ̣ ̉ ́ ược bao quan trong dung dich đêm PBS 0,04 M co Glycerine ̉ ̉ ̣ ̣ ́   0  (xem phu luc 1)  ̣ ̣ ở nhiêt  đô ­20 ̣ ̣ C.                                                                                                               10 TCN  717­2006 Bênh phâm la huyêt thanh: Mau đ ̣ ̉ ̀ ́ ́ ược lây vô trung, l ́ ̀ ượng tôi thiêu la 3 ml, đê đông, ́ ̉ ̀ ̉   0  chăt lây huyêt thanh. Bao quan  ́ ́ ́ ̉ ̉ ở nhiêt đô ̣ ̣ 4 C Mâu sau khi lây đ ̃ ́ ược giữ trong điêu kiên lanh, chuyên t ̀ ̣ ̣ ̉ ới phong xet nghiêm cang ̀ ́ ̣ ̀   sơm cang tôt  ́ ̀ ́ May moc – Dung cu – Hoa chât – Nguyên liêu ́ ́ ̣ ̣ ́ ́ ̣ 4.1. May moc ́ ́ ­ Tu lanh âm  ̉ ̣ ­ Tu lanh th ̉ ̣ ương  ̀ o ­ Tu âm 37 ̉ ́ C ­ May lăc đia ( ́ ́ ̃ orbital shaker) ­ May lăc trôn ( ́ ́ ̣ vortex mixer) ­ Nôi đun cach thuy ( ̀ ́ ̉ water bath) ­ May đoc ELISA v ́ ̣ ơi kinh loc 492 nm ́ ́ ̣ ­ May r ́ ửa đĩa ELISA.   ­ Buông cây vô trung ( ̀ ́ ̀ BSC­Bio­safety cabinet) ­ May ly tâm ́ 4.2. Dung cu ̣ ̣ ­ Binh tam giac cac c ̀ ́ ́ ơ: 100, 200, 500 va 1000 ml ̃ ̀ ­ ông đong thuy tinh cac c ́ ̉ ́ ơ: 50, 100, 200, 500 va 1000 ml ̃ ̀ ­ Côc co mo cac c ́ ́ ̉ ́ ơ: 100, 200, 500 va 1000 ml ̃ ̀ ­ ông nghiêm ́ ̣ ­ Lo nho chăt huyêt thanh ̣ ̉ ́ ́ ­ Mang trôn chât phan  ́ ̣ ́ ̉ ứng (reagent trough) ­ Pipet thuy tinh: 1, 5 va 10 ml ̉ ̀ ­ Micropipet đơn: 0,5­10, 5­40, 40­200, 200­1000  l ­ Micropipet nhiêu đâu (8­12): 5­50, 50­300  ̀ ̀ l ­ Bô côi chay s ̣ ́ ̀ ứ ­ Cat sach đê nghiên bênh phâm ́ ̣ ̉ ̀ ̣ ̉ ­ Khăn bông ­ Dao, keo, panh kep ́ ̣ 4.3. Hoa chât ́ ́ ­ Nươc cât hoăc n ́ ́ ̣ ươc kh ́ ử ion ­ Dung dich đêm Phôt phat xitrat ̣ ̣ ́ ́ ­ Chât phat mau OPD ( ́ ́ ̀ ortho­phenylenediamine) ­ Cơ chât (H ́ 2O2) ­ Viên Cac bo nat/ bi cac bo nat ́ ́ ́ ­ Đo phenol 1% ̉ ­ Tween 20 ­ Axit xitric ­ HCl ­ H2SO4 1.25M ­ Na2HPO4.2H2O  ­ KH2PO4 ­ KCl                                                                                                              10 TCN  717­2006 ­ Nacl 4.4. Nguyên liêu cho phan  ̣ ̉ ưng ELISA ́ 4.4.1. Bô kit ELISA phat hiên khang nguyên LMLM (Pirbright­UK) ̣ ́ ̣ ́ 4.4.2. Bô kit LPB­ELISA phat hiên khang thê LMLM (Pirbright­UK) ̣ ́ ̣ ́ ̉ 4.4.3   Bộ   kit   FMD­3ABC   ELISA   phat́   hiên ̣   khang ́   thể   LMLM     măć   bênh ̣   tự   nhiên   (Bommeli­Switzerland) 4.4.4. Nguyên liêu cho phân lâp tê bao ̣ ̣ ́ ̀ ­ Môi trương tê bao MEM ( ̀ ́ ̀ Eagle’s)  ­ Tê bao dong BHK­21 (hoăc tê bao thân c ́ ̀ ̀ ̣ ́ ̀ ̣ ừu sơ câp) ́ KiÓm tra lâm sàng Đặc điểm dịch tễ học 5.Phngphapchõnoan ́ Sơ đô chân đoan bênh L ̀ ̉ ́ ̣ ở môm long mong ̀ ́ LÊy mẫu bệnh phẩm Phát kháng nguyên (ELISA) Phát kháng thể(ELISA) (+) (ư) Phân lập virus Giám định (ELISA) KÕt luËn bÖnh                                                                                                              10 TCN  717­2006 5.1. Đăc điêm dich tê hoc, lâm sang ̣ ̉ ̣ ̃ ̣ ̀ 5.1.1. Môt sô đăc điêm dich tê hoc ̣ ́ ̣ ̉ ̣ ̃ ̣ ­ Bênh co tinh chât lây lan nhanh, manh, rông đôi v ̣ ́ ́ ́ ̣ ̣ ́ ới đông vât mân cam ̣ ̣ ̃ ̉ ­ Bênh co thê lây tr ̣ ́ ̉ ực tiêp t ́ ừ đông vât măc bênh đên đông vât mân cam, hay lây gian ̣ ̣ ́ ̣ ́ ̣ ̣ ̃ ̉ ́  tiêp qua san phâm đông vât (thit, s ́ ̉ ̉ ̣ ̣ ̣ ưa, tinh dich, da ), dung cu chăn nuôi, vân chuyên gia suc ̃ ̣ ̣ ̣ ̣ ̉ ́   5.1.2. Triêu ch ̣ ưng lâm sang ́ ̀ ­ Con vât măc bênh co biêu hiên sôt, mêt moi, bo ăn, n ̣ ́ ̣ ́ ̉ ̣ ́ ̣ ̉ ̉ ươc bot nhiêu chay thanh dong ́ ̣ ̀ ̉ ̀ ̀ ­ Co mun n ́ ̣ ươc  ́ ở chân (viên mong, ke mong), con vât co biêu hiên que va co thê bong ̀ ́ ̃ ́ ̣ ́ ̉ ̣ ̀ ̀ ́ ̉   mong ́ ­ Giam tiêt s ̉ ́ ưa, say thai  ̃ ̉ ở gia suc cai ́ ́ ­ Hiên t ̣ ượng chêt chu yêu diên ra  ́ ̉ ́ ̃ ở gia suc non ́ 5.1.3. Bênh tich ̣ ́ ­ Có  mun n ̣ ươc  ́ ở môm (niêm mac môi, l ̀ ̣ ợi, lươi va vom miêng), mui, ke mong, viên ̃ ̀ ̀ ̣ ̃ ̃ ́ ̀  mong va num vu. Mun n ́ ̀ ́ ́ ̣ ươc v ́ ơ co thê thanh vêt loet, chay mau ̃ ́ ̉ ̀ ́ ́ ̉ ́ ­ Lươi trâu, bo th ̃ ̀ ương bi bong troc biêu mô 2/3 phia tr ̀ ̣ ́ ̉ ́ ước ­ Tut mong ̣ ́ 5.2. Chân đoan phong xet nghiêm ̉ ́ ̀ ́ ̣ 5.2.1. Phat hiên khang nguyên ́ ̣ ́ 5.2.1.1. Xử ly bênh phâm ́ ̣ ̉ Mâu bênh phâm la biêu mô cua mun n ̃ ̣ ̉ ̀ ̉ ̉ ̣ ươc đ ́ ược nghiên trong côi chay s ̀ ́ ̀ ứ vơi dung ́   dich PBS 0,04M ty lê 1:10. Ly tâm huyên dich bênh phâm 2000 vong/phut trong 10 phut. Lây ̣ ̉ ̣ ̃ ̣ ̣ ̉ ̀ ́ ́ ́  dich n ̣ ươc trong  ́ ở trên, xử ly khang sinh ́ ́ 5.2.1.2. Phan  ̉ ưng ELISA phat hiên khang nguyên ́ ́ ̣ ́ ­ Nguyên ly: La phan  ́ ̀ ̉ ưng Sandwich ELISA gian tiêp co thê phat hiên nhiêu type khang ́ ́ ́ ́ ̉ ́ ̣ ̀ ́   nguyên (O, A, C va Asia 1).  ̀ Phan  ̉ ưng đ ́ ược thực hiên trên đia đay băng, 96 lô ( ̣ ̃ ́ ̀ ̃ Nunc, Maxisorp) ­ Mâu bênh phâm: Huyên dich bênh phâm đ ̃ ̣ ̉ ̃ ̣ ̣ ̉ ược chuân bi giông cho phân lâp virus.  ̉ ̣ ́ ̣ * Cac b ́ ươc tiên hanh: ́ ́ ̀  theo quy trinh cua bô KIT ̀ ̉ ̣ Xem phu luc 3 ̣ ̣                                                                                                              10 TCN  717­2006 5.2.1.3. Phân lâp virus trên môi tr ̣ ương tê bao ̀ ́ ̀ ­ Dung tê bao dong BHK­21 hoăc tê bao thân c ̀ ́ ̀ ̀ ̣ ́ ̀ ̣ ừu sơ  câp. Nhiêm huyên dich bênh ́ ̃ ̃ ̣ ̣   phâm 1ml/ chai tê bao (T25)  .  ̉ ́ ̀ ­ Ủ ở nhiêt đô 37 ̣ ̣ oC /phut trong 60 phut, sau đo cho dung dich MEM ( ́ ́ ́ ̣ Eagle’s) không  co huyêt thanh nuôi tiêp.  ́ ́ ́ ­ Hang ngay kiêm tra bênh ly tê bao (CPE):   ̀ ̀ ̉ ̣ ́ ́ ̀ + Nêu t ́ ới 48 giơ co CPE xuât hiên thi thu hôn dich tê bao, ly tâm 2000 vong/phut trong ̀ ́ ́ ̣ ̀ ̃ ̣ ́ ̀ ̀ ́   15 phut. Lây n ́ ́ ươc trong giam đinh virus.  ́ ́ ̣ + Nêu sau 48 gi ́ ờ không co CPE thi thu hôn dich tê bao va cây chuyên tiêp, sau 3 lân ́ ̀ ̃ ̣ ́ ̀ ̀ ́ ̉ ́ ̀  không co CPE thi mâu đ ́ ̀ ̃ ược coi la âm tinh (không co virus LMLM) ̀ ́ ́ * Giam đinh virus phân lâp ́ ̣ ̣ Sử dung ph ̣ ương phap ELISA phat hiên khang nguyên (xem muc 5.2.1.2) ́ ́ ̣ ́ ̣ 5.2.2. Phat hiên khang thê ́ ̣ ́ ̉ 5.2.2.1. Phương phap Liquid phase blocking ELISA: Bô KIT ELISA phat hiên khang thê ́ ̣ ́ ̣ ́ ̉  LMLM ở gia suc ́ Phan  ̉ ưng th ́ ực hiên trên đia đay băng, 96 lô ( ̣ ̃ ́ ̀ ̃ Nunc, Maxisorp) * Cac b ́ ươc tiên hanh: theo quy trinh cua bô KIT ́ ́ ̀ ̀ ̉ ̣ Xem phu luc 4 ̣ ̣ 5.2.2.2. Phương phap ELISA FMD ­ 3ABC phat hiên khang thê LMLM  ́ ́ ̣ ́ ̉ ở  gia suc do nhiêm ́ ̃   tự nhiên ­ Bô KIT FMD – 3ABC bo­ov cua hang Bommeli san xuât đê phat hiên khang thê do ̣ ̉ ̃ ̉ ́ ̉ ́ ̣ ́ ̉   măc bênh t ́ ̣ ự nhiên ở trâu, bò       ­ Bô KIT FMD – 3ABC po cua hang Bommeli san xuât đê phat hiên khang thê do măc ̣ ̉ ̃ ̉ ́ ̉ ́ ̣ ́ ̉ ́  bênh t ̣ ự nhiên ở lợn Thực hiên: Theo quy trinh cua nha san xuât ̣ ̀ ̉ ̀ ̉ ́ 6. Kêt luân ́ ̣ Dựa vao: ̀ ­ Dich tê hoc ̣ ̃ ̣ ­ Triêu ch ̣ ưng lâm sang ́ ̀ ­ Kêt qua xet nghiêm co thê khăng đinh bênh v ́ ̉ ́ ̣ ́ ̉ ̉ ̣ ̣ ới 1 trong cac kêt qua sau: ́ ́ ̉ + Phan  ̉ ưng ELISA phat hiên khang nguyên d ́ ́ ̣ ́ ương tinh ́ + Phan  ̉ ưng ELISA phat hiên khang thê d ́ ́ ̣ ́ ̉ ương tinh  ́ ở gia suc ch ́ ưa tiêm phong ̀ + Phương phap ELISA FMD ­ 3ABC phat hiên khang thê LMLM ́ ́ ̣ ́ ̉ + Phân lâp đ ̣ ược virus trên môi trương tê bao ̀ ́ ̀ + Phat hiên đ ́ ̣ ược virus băng phan  ̀ ̉ ưng PCR ́ KT. BỘ TRƯỞNG   THỨ TRƯỞNG                                                                                                              10 TCN  717­2006                                                                                                                                  Bùi Bá Bổng Phu luc 1 ̣ ̣ Công thưc pha dung dich bao quan: ́ ̣ ̉ ̉  Gôm:­ PBS 0.04 M: ̀ Na2HPO4.2H2O 3,05 g KH2PO4 0,39 g Nươc cât ́ ́ 500 ml Phenol red 1% 1 ml                 ­ Khang sinh: ́ Penicilline 1000 UI/ml Mycostatine 100 UI/ml Neomycine 100 UI/ml Polymicine 50 UI/ml Sau khi pha kiêm tra pH 7,2­7,6 chinh pH v ̉ ̉ ơi NaOH hoăc  HCl ́ ̣ Chu y: Khi dung pha dung dich bao quan v ́ ́ ̀ ̣ ̉ ̉ ơi Glycerin ty lê 1:1  ́ ̉ ̣ Công thưc pha dung dich coating buffer:  ́ ̣ 0.05 M Carbonate/bicarbonate buffer, pH 9.6 NaHCO3 2,93 g/l Na2CO3 1,59 g/l  Công thưc pha PBS 0.04 M pH 7.4 ́                                                                                                              10 TCN  717­2006 Na2HPO4 KH2PO4 NaCl Kcl Công thưc pha buffer A: ́ PBS 0.01 M + 0.05 % Tween 20 Na2HPO4 KH2PO4 NaCl Kcl 4,84 g/l 0,80 g/l 32,00 g/l 0,80 g/l 1,21g/l 0,20 g/l 8,00 g/l 0,20 g/l Công thưc pha buffer B: ́ PBS 0.01 M + 0.05 % Tween 20 + 5% sưa bôt tach b ̃ ̣ ́ Na2HPO4 1,21g/l KH2PO4 0,20 g/l NaCl 8,00 g/l Kcl 0,20 g/l                                                            Phu luc 2 ̣ ̣ Quy trinh ky thuât ELISA phat hiên khang nguyên ̀ ̃ ̣ ́ ̣ ́ * Cac b ́ ươc tiên hanh:  ́ ́ ̀ ­ Găn đia (coating): Khang huyêt thanh tho khang virus LMLM cua cac type O, A, C va ́ ̃ ́ ́ ̉ ́ ̉ ́ ̀  Asia 1 pha loang 1:1000 v ̃ ơi dung dich coating buffer (phu luc 1), nho 50  ́ ̣ ̣ ̣ ̉ l vao cac lô t ̀ ́ ̃ ương  o ứng (xem sơ đô ̀ở phu luc 2). Đây năp, u va lăc  ̣ ̣ ̣ ́ ̉ ̀ ́ ở nhiêt đô 37 ̣ ̣ C/1 giơ hoăc u qua đêm  ̀ ̣ ̉ ở 4oC ­ Rửa đia 3 lân băng dung dich r ̃ ̀ ̀ ̣ ửa PBS 0,002M ­ Nho 50  ̉ l khang nguyên đôi ch ́ ́ ưng d ́ ương tinh manh(1:10) va yêu (1:100) pha loang ́ ̣ ̀ ́ ̃   băng buffer A (phu luc 1), va mâu bênh phâm vao cac lô quy đinh (xem s ̀ ̣ ̣ ̀ ̃ ̣ ̉ ̀ ́ ̃ ̣ ơ đô ̀ở phu luc 2),  u ̣ ̣ ̉  o va lăc  ̀ ́ ở nhiêt đô 37 ̣ ̣ C/1 giơ.  ̀ ­ Rửa 3 lân băng dung dich r ̀ ̀ ̣ ửa PBS 0,002M ­ Nho khang thê phat hiên: Môi lô 50 ̉ ́ ̉ ́ ̣ ̃ ̃   l khang huyêt thanh chuôt lang khang virus ́ ́ ̣ ́   LMLM vao cac lô t ̀ ́ ̃ ương ưng (xem s ́ ơ đô ̀ở  phu luc 2), môi serotype đ ̣ ̣ ̃ ược pha loang(1:100) ̃   o vơi  buffer B (xem phu luc 1). Đây năp, u va lăc  ́ ̣ ̣ ̣ ́ ̉ ̀ ́ ở nhiêt đô 37 ̣ ̣ C/1giơ.̀ ­ Rửa 3 lân băng dung dich r ̀ ̀ ̣ ửa PBS 0,002M ­ Nho conjugate (1:200 pha v ̉ ơi buffer B): 50 ́ l/lô. Đây năp, u va lăc  ̃ ̣ ́ ̉ ̀ ́ ở nhiêt đô 37 ̣ ̣ oC/40  phut ́ ­ Rửa 3 lân băng dung dich r ̀ ̀ ̣ ửa PBS 0,002M ­ Nho substrate chromogen (dung dich chromogen + 5% substrate):  ̉ ̣ 50  l/lô, đê 20 phut  ̃ ̉ ́ ở nhiêt đô phong, chô tôi ̣ ̣ ̀ ̃ ́                                                                                                              10 TCN  717­2006 ­ Dưng phan  ̀ ̉ ưng: nho 50  ́ ̉ l/lô dung dich H ̃ ̣ 2S04 1,25M ­ Đoc kêt qua: Băng may đoc ELISA, kinh loc 492 nm ̣ ́ ̉ ̀ ́ ̣ ́ ̣  Nêu gia tri OD > 0.1 sau khi đa tr ́ ́ ̣ ̃ ừ đi gia tri trung binh cua côt blank thi phan  ́ ̣ ̀ ̉ ̣ ̀ ̉ ưng ́   được coi la d ̀ ương tinh v ́ ơi serotype đo.  ́ ́  Nêu OD = 0.1 thi cây chuyên mâu bênh phâm lên môi tr ́ ̀ ́ ̉ ̃ ̣ ̉ ường tê bao rôi kiêm tra lai ́ ̀ ̀ ̉ ̣ Sơ đô đia phan  ̀ ̃ ̉ ưng ELISA phat hiên khang nguyên ́ ́ ̣ ́   (+) maṇ h  (+) yêú   Blank Mâu 1 ̃ Mâu 3 ̃ 10 Mâu 5 ̃ 11 12 Mâu 2 ̃ Mâu 4 ̃ Mâu 6 ̃ O A C Asia 1 O A C Asia 1 Phu luc 3 ̣ ̣ Quy trinh ky thuât ELISA phat hiên khang thê cua PIRBRIGHT ̀ ̃ ̣ ́ ̣ ́ ̉ ̉ * Cac b ́ ươc tiên hanh:  ́ ́ ̀ ­ Găn đia (coating): Khang huyêt thanh tho khang virus LMLM đa pha loang 1:1000 v ́ ̃ ́ ́ ̉ ́ ̃ ̃ ới   o o coating buffer, nho 50  ̉ l/ lô. Đây năp, u va lăc  ̃ ̣ ́ ̉ ̀ ́ ở nhiêt đô 37 ̣ ̣ C/1giơ hoăc u qua đêm  ̀ ̣ ̉ ở 4 C     ­ Chuân bi hôn h ̉ ̣ ̃ ợp khang nguyên­ huyêt thanh ( ́ ́ liquid phase blocking), nho vao đia ̉ ̀ ̃  nhựa polypropylene 96 lô đay ch ̃ ́ ư U (phu luc 2): ̃ ̣ ̣     + Huyêt thanh đôi ch ́ ́ ưng va kiêm tra đ ́ ̀ ̉ ược pha loang 1:16 v ̃ ơi buffer A, 50  ́ l/lô.̃ + Khang nguyên pha loang theo ty lê cho tr ́ ̃ ̉ ̣ ươc, 50  ́ l/lô.  ̃ o      Hôn h ̃ ợp được u qua đêm  ̉ ở 4 C ­ Rửa đia ELISA 3 lân băng dung dich r ̃ ̀ ̀ ̣ ửa PBS 0,002M ­ Chuyên 50  ̉ l hôn h ̃ ợp khang nguyên­ huyêt thanh t ́ ́ ừ đia ch ̃ ữ U sang đia ELISA theo ̃   o vi tri t ̣ ́ ương ưng (phu luc 2). Đây năp, u va lăc  ́ ̣ ̣ ̣ ́ ̉ ̀ ́ ở nhiêt đô 37 ̣ ̣ C/1 giơ.  ̀ ­ Rửa 3 lân băng dung dich r ̀ ̀ ̣ ửa PBS 0.002M ­ Nho khang thê phat hiên: Khang huyêt thanh chuôt lang khang virus LMLM pha loang ̉ ́ ̉ ́ ̣ ́ ́ ̣ ́ ̃   o 1:100 vơi buffer B, 50 ́ l/lô. Đây năp, u va lăc  ̃ ̣ ́ ̉ ̀ ́ ở nhiêt đô 37 ̣ ̣ C/1 giơ.  ̀ ­ Rửa 3 lân băng dung dich r ̀ ̀ ̣ ửa PBS 0,002M ­ Nho conjugate: pha loang 1:200 v ̉ ̃ ơi buffer B, 50 ́ l/lô. Đây năp, u ̃ ̣ ́ ̉  va lăc  ̀ ́ ở  nhiêt đô ̣ ̣  o 37 C/40 phut ́ ­ Rửa 3 lân băng dung dich r ̀ ̀ ̣ ửa PBS 0,002M                                                                                                              10 TCN  717­2006 ­ Nho substrate chromogen (dung dich  ̉ ̣ chromogen + 5% substrate):   50  l/lô, đê 20 phut  ̃ ̉ ́ ở nhiêt đô phong, chô tôi ̣ ̣ ̀ ̃ ́ ­ Dưng phan  ̀ ̉ ưng: nho 50  ́ ̉ l/lô dung dich H ̃ ̣ 2S04 1.25M ­ Đoc kêt qua: Băng may đoc ELISA, kinh loc 492 nm. S ̣ ́ ̉ ̀ ́ ̣ ́ ̣ ử dung phân mêm EDI đê tinh ̣ ̀ ̀ ̉ ́   PI (Percentage Inhibition). Nêu PI  ́  50 thi mâu đ ̀ ̃ ược coi la d ̀ ương tinh, trong huyêt thanh co ́ ́ ́  khang thê LMLM ́ ̉ Sơ đô đia ELISA phat hiên khang thê đ ̀ ̃ ́ ̣ ́ ̉ ược trinh bay  ̀ ̀ ở phu luc 2 ̣ ̣ * Chu y: Xac đinh hiêu gia khang thê, mâu huyêt thanh đ ́ ́ ́ ̣ ̣ ́ ́ ̉ ̃ ́ ược pha như sau:  ­ Huyêt thanh kiêm tra:  Pha loang 1:8 ́ ̉ ̃ ­ Nho dung dich buffer A: 50  ̉ ̣ l/lô vao cac lô cua đia ch ̃ ̀ ́ ̃ ̉ ̃ ư U băt đâu t ̃ ́ ̀ ừ côt 3 cho đên côt ̣ ́ ̣  12 cua tât ca cac hang.  ̉ ́ ̉ ́ ̀ ­ Nho huyêt thanh kiêm tra đa pha loang 1:8 vao cac lô t ̉ ́ ̉ ̃ ̃ ̀ ́ ̃ ương ứng (phu luc 2) 50  ̣ ̣ l/lô,̃  va pha loang theo c ̀ ̃ ơ sô 2 t ́ ừ hang A đên hang D va t ̀ ́ ̀ ̀ ừ hang E đên hang H ̀ ́ ̀ ­ Huyêt thanh đôi ch ́ ́ ưng: Chuân bi giông phat hiên khang thê  ́ ̉ ̣ ́ ́ ̣ ́ ̉ ­ Nho khang nguyên đa pha loang theo ty lê cho tr ̉ ́ ̃ ̃ ̉ ̣ ước 50  l/lô.  ̃ ­ Hôn h ̃ ợp khang nguyên­huyêt thanh đ ́ ́ ược u qua đêm  ̉ ở 4 C ­ Cac b ́ ươc sau tiên hanh theo trinh t ́ ́ ̀ ̀ ự giông phan  ́ ̉ ứng ELISA phat hiên khang thê ́ ̣ ́ ̉ Sơ đô đia phan  ̀ ̃ ̉ ưng ELISA (trang sau) ́ Sơ đô đia phan  ̀ ̃ ̉ ưng ELISA phat hiên khang thê ́ ́ ̣ ́ ̉ A B C++ 10 17 18 25 26 10 11 33 34 C D C+ 11 12 19 20 27 28 35 36 E F C­ 13 14 21 22 29 30 37 38 G H Ca 15 16 23 24 31 32 39 40 Sơ đô đia phan  ̀ ̃ ̉ ưng ELISA đinh l ́ ̣ ượng khang thê ́ ̉ A C++ B C D C+ 1 3 5 7 7 10 11 9 12 12 9 10                                                                                                              10 TCN  717­2006 E F C­ 2 4 6 8 10 10 G H Ca 2 4 6 8 10 10 Chu thich: ́ ́   C++: huyêt thanh ĐC d ́ ương tinh manh ́ ̣       C+: huyêt thanh ĐC d ́ ương tinh yêu ́ ́                       C­: huyêt thanh ĐC âm tinh  ́ ́       Ca: đôi ch ́ ưng khang nguyên ́ ́ Công thưc tinh PI ́ ́ PI 100 ODhuyetthanh *100 ODtrungbinhCa 11 ... 7 7 10 11 9 12 12 9 10                                                                                                              10 TCN  717­2006 E F C­ 2 4 6 8 10 10 G H Ca 2 4 6 8 10 10 Chu thich:...                                                                                                             10 TCN  717­2006 Hà Nội ­ 2006 TIÊU CHUẨN NGÀNH                                                                               10 TCN  717­2006 QUY TRÌNH CHẨN ĐỐN ... ­ Binh tam giac cac c ̀ ́ ́ ơ: 100 , 200, 500 va 100 0 ml ̃ ̀ ­ ông đong thuy tinh cac c ́ ̉ ́ ơ: 50, 100 , 200, 500 va 100 0 ml ̃ ̀ ­ Côc co mo cac c ́ ́ ̉ ́ ơ: 100 , 200, 500 va 100 0 ml ̃ ̀ ­ ông nghiêm