Tiêu chuẩn Quốc gia TCVN 8400-10:2011. Tiêu chuẩn trình bày nội dung về bệnh động vật – quy trình chẩn đoán – phần 10: bệnh lao bò. Tiêu chuẩn này quy định quy trình chẩn đoán bệnh lao bò do vi khuẩn Mycobacterium bovis gây ra.
TCVN TIÊU CHUẨN QUỐC GIA TCVN 8400-10:2011 Xuất lần BỆNH ĐỘNG VẬT – QUY TRÌNH CHẨN ĐỐN – PHẦN 10: BỆNH LAO BÒ Animal disease – Diagnostic procedure – Part 10: Bovine tuberculosis disease HÀ NỘI – 2011 TCVN 8400-10:2011 Lời nói đầu TCVN 8400-10:2011 chuyển đổi từ 10 TCN 818:2006 thành tiêu chuẩn quốc gia theo quy ñịnh khoản Điều 69 Luật Tiêu chuẩn Quy chuẩn kỹ thuật ñiểm a khoản Điều Nghị ñịnh số 127/2007/NĐ-CP ngày 01/8/2007 Chính phủ quy định chi tiết thi hành số ñiều Luật Tiêu chuẩn Quy chuẩn kỹ thuật; TCVN 8400-10:2011 Cục Thú y biên soạn, Bộ Nông nghiệp Phát triển nơng thơn đề nghị, Tổng cục Tiêu chuẩn Đo lường Chất lượng thẩm ñịnh, Bộ Khoa học Công nghệ công bố TCVN 8400-10:2011 TCVN 8400-10:2011 TIÊU CHUẨN QUỐC GIA TCVN 8400-10:2011 Bệnh ñộng vật – Quy trình chẩn đốn – Phần 10: Bệnh lao bò Animal disease – Diagnostic procedure – Part 10: Bovine tuberculosis disease CẢNH BÁO – Việc áp dụng tiêu chuẩn liên quan đến vật liệu, thiết bị thao tác gây nguy hiểm Tiêu chuẩn khơng thể đưa hết tất vấn đề an tồn liên quan đến việc sử dụng chúng Người sử dụng tiêu chuẩn phải tự thiết lập thao tác an tồn thích hợp xác ñịnh khả áp dụng giới hạn quy ñịnh trước sử dụng tiêu chuẩn Phạm vi áp dụng Tiêu chuẩn quy định quy trình chẩn đốn bệnh lao bò vi khuẩn Mycobacterium bovis gây Thuật ngữ ñịnh nghĩa Trong tiêu chuẩn sử dụng thuật ngữ ñịnh nghĩa sau: Bệnh lao bò (Bovine tuberculosis disease) Bệnh mạn tính trực khuẩn Mycobacterium bovis gây Đặc trưng bệnh hình thành hạt lao, thường thấy hạch phổi, hạch bạch huyết quan nội tạng Bệnh lao bò lây nhiễm sang người Thuốc thử vật liệu thử Trong tiêu chuẩn sử dụng thuốc thử tinh khiết phân tích sử dụng nước cất nước có chất lượng tương ñương, trừ có quy ñịnh khác − Etanol (C2H6O) − Fuchsin basic (C20H20ClN3) TCVN 8400-10:2011 − Xanh metylen (C16H18N3SCl) − Axit clohydric (HCl) − Kali hydroxit (KOH) − Thiophen-2-carbonic axit hydrazide (TCH) − Natri pyruvat (C3H3NaO3) − Axit oxalic (C2H2O4) − Amoni sắt (II) sulfat ((NH4)2Fe(SO4)2) − Pyrazinamid (C5H5N3O) − Các môi trường nuôi cấy phân lập: Lowenstein Jensen (LJ), Stonebrink, Coletsos base, Herrold egg yolk (HEY), Middlebrook 7H10 hay 7H11 − Tuberculin PPD bò − Tuberculin PPD gà Thiết bị, dụng cụ Sử dụng thiết bị, dụng cụ phòng thử nghiệm thơng thường cụ thể sau: − Tủ ấm, trì nhiệt độ 37 oC − Tủ sấy − Nồi hấp − Buồng cấy − Kính hiển vi quang học − Tủ lạnh − Que cấy − Đèn cồn − Đĩa Petri để đổ mơi trường − Panh − Kéo TCVN 8400-10:2011 − Lamen (coverlip) − Phiến kính − Pipet thủy tinh cỡ − Lọ thủy tinh, dung tích 100 ml, 200 ml, 500 ml 1000 ml Cách tiến hành 5.1 Chẩn đốn lâm sàng 5.1.1 Đặc điểm dịch tễ − Trâu, bò bị nhiễm lao tiếp xúc với trâu, bò bị bệnh hay từ vùng có dịch − Bệnh lao có khắp nơi giới − Động vật non cảm thụ với vi khuẩn lao mạnh ñộng vật trưởng thành 5.1.2 Triệu chứng lâm sàng − Con vật bị bệnh gầy, yếu, lơng dựng đứng, da khơ, sốt nhẹ chiều − Các triệu chứng bệnh phụ thuộc vào vị trí phân bố hạt lao Nếu hạt lao khu trú phổi: Con vật ho khan, ho ho nhiều thời tiết thay ñổi Nếu hạt lao khu trú hạch: Các hạch bạch huyết sưng, cứng, sờ thấy lổn nhổn, hạch trước vai, trước ñùi, hàm Nếu hạt lao khu trú ruột: Con vật ỉa chảy, phân khẳm ỉa chảy táo bón luân phiên − Con vật gầy dần chết suy nhược giai ñoạn cuối bệnh 5.1.3 Bệnh tích Bệnh tích ñặc trưng vật có hạt lao Các hạt lao quan nội tạng, màng treo ruột, ruột, màng phổi, màng bụng, vú,… hay gặp hạch phổi, hạch vùng ñầu hạch bạch huyết xoang ngực Các hạt lao thường có màu vàng, màu trắng đục, dạng bã đậu dạng hạt xơ hay bị canxi hố thành khối tăng sinh thượng bì có kích thước ổi Trên quan thấy nhiều dạng hạt lao khác TCVN 8400-10:2011 Nếu hạt lao có nhiều phổi nắn thuỳ phổi có cảm giác phổi có trộn cát, cắt có tiếng kêu lạo xạo Ở giai đoạn đầu, bệnh lao khó chẩn đốn qua mổ khám 5.1.4 Phản ứng tiêm nội bì (tuberculin test) Phản ứng dùng để chẩn đốn bệnh lao cho ñộng vật sống 5.1.4.1 Vật liệu − Tuberculin PPD bò − Tuberculin PPD gà 5.1.4.2 Vị trí tiêm Nếu tiêm mũi tuberculin PPD cho bò chọn vị trí da cổ mặt nếp gấp da Nếu tiêm mũi tuberculin PPD cho bò tuberculin PPD cho gà chọn vị trí khác bên cổ vật, khoảng cách vị trí 12 cm đến 15 cm Gia súc non phải tiêm hai bên cổ Trước tiêm, cắt lơng vị trí tiêm, kiểm tra có tổn thương hay khơng Đánh dấu đo độ dày da trước tiêm tuberculin PPD thước cặp Tiêm tuberculin PPD bò/gà vào da (tiêm nội bì) vị trí tiêm chọn Liều tiêm: Dùng khơng 2000 UI tuberculin PPD bò/gà lượng tiêm khơng 0,2 ml 5.1.4.3 Đọc kết Sau tiêm 72 h, ño ñộ dày nếp gấp da ñánh giá kết sau: Trường hợp tiêm mũi, kết cho thấy: − Độ sưng da không lớn mm vật khơng có triệu chứng lâm sàng: âm tính; − Độ sưng da lớn mm nhỏ mm, vật khơng có triệu chứng lâm sàng: nghi ngờ; − Độ sưng da lớn mm nhỏ mm, vật có triệu chứng lâm sàng: dương tính; − Độ sưng da lớn mm: dương tính TCVN 8400-10:2011 Với động vật cho kết nghi ngờ sau 42 ngày làm lại phản ứng Sau kiểm tra lần hai, cho kết nghi ngờ dương tính, kiểm tra lại phản ứng tiêm nội bì hai mũi tuberculin PPD bò tuberculin PPD gà Đối với vị trí tiêm đi, phản ứng dương tính độ sưng da vị trí tiêm trừ độ dày da bên không tiêm lớn mm Nếu bò có nếp gấp da đi, phản ứng dương tính độ sưng da vị trí tiêm lớn mm Trường hợp tiêm hai mũi, kết cho thấy: − Độ sưng da vị trí tiêm tuberculin PPD bò (mm) nhỏ ñộ sưng da vị trí tiêm tuberculin PPD gà (mm): âm tính; − Độ sưng da vị trí tiêm tuberculin PPD bò (mm) lớn độ sưng da vị trí tiêm tuberculin PPD gà (mm), chênh lệch hai ñộ sưng từ mm ñến mm: nghi ngờ; − Độ sưng da vị trí tiêm tuberculin PPD bò (mm) lớn độ sưng da vị trí tiêm tuberculin PPD gà (mm), chênh lệch hai độ sưng lớn mm: dương tính 5.1.4 Lấy mẫu, bảo quản, vận chuyển mẫu bệnh phẩm Lấy mơ nghi ngờ có bệnh tích với lượng từ 10 g ñến 200 g ñựng vào lọ miệng rộng túi nilon Bệnh phẩm phải ñược lấy vơ trùng, bảo quản điều kiện lạnh từ oC đến oC gửi phòng xét nghiệm chậm 24 h sau lấy mẫu kèm theo giấy yêu cầu xét nghiệm có ghi rõ triệu chứng, bệnh tích thơng tin dịch tễ 5.2 Chẩn đốn phòng thí nghiệm 5.2.1 Ni cấy, phân lập Nghiền bệnh phẩm thành huyễn dịch, sau ñược khử tạp khuẩn dung dịch axit oxalic % hay dung dịch NaOH từ % tới % Huyễn dịch ñược lắc 10 nhiệt độ phòng (24 oC) đem trung hồ với dung dịch HCl N, sau ly tâm Chất cặn sử dụng cho ni cấy kiểm tra kính hiển vi Chất cặn cấy lên mơi trường trứng ủ 37 oC vòng tuần, tất mơi trường nên bịt kín để tránh bị khơ Một số mơi trường dùng để nuôi cấy vi khuẩn lao như: Lowenstein Jensen (LJ), Stonebrink, Coletsos base, Herrold egg yolk (HEY) Ngồi ra, sử dụng môi trường Middlebrook 7H10 hay 7H11 TCVN 8400-10:2011 5.2.2 Giám định vi khuẩn 5.2.2.1 Giám định hình thái vi khuẩn từ mơi trường ni cấy Giám định hình thái phương pháp nhuộm Ziehl-Neelsen theo quy định Phụ lục A Vi khuẩn M bovis hình gậy mảnh, bắt màu hồng xanh 5.2.2.2 Giám ñịnh tính chất mọc mơi trường Vi khuẩn M bovis mọc vòng tuần tới tuần nuôi cấy Khuẩn lạc mọc chậm 37 oC, không mọc 22 oC hay 45 oC Kiểm tra phát triển vi khuẩn bị ức chế glyxerol: Cấy vi khuẩn lên mơi trường có khơng có glyxerol Trên mơi trường có glyxerol vi khuẩn mọc yếu Có thể sử dụng mơi trường trứng (Lowenstein Jensen) Kiểm tra phát triển vi khuẩn mơi trường có 0,4 % natri pyruvat: Cấy vi khuẩn lên mơi trường Lowenstein Jensen (khơng có glyxerol) có không bổ sung 0,4 % natri pyruvat Vi khuẩn M bovis mọc tạo thành khuẩn lạc có dạng trơn, màu trắng nhạt Kiểm tra mẫn cảm vi khuẩn với thiophen-2-carbonic axit hydrazide (TCH): Cấy vi khuẩn lên mơi trường Lowenstein Jensen có bổ sung TCH 10 µg/ml: Vi khuẩn M bovis khơng mọc 5.2.2.3 Giám định đặc tính sinh hóa Các đặc tính sinh hố đặc trưng vi khuẩn M bovis trình bày bảng sau: Đặc tính sinh hố M bovis Sản sinh niacin âm tính Phân giải nitrat âm tính Pyrazinamidase âm tính Urease dương tính Phương pháp tiến hành: theo Phụ lục B Kết luận Bò bị bệnh lao có đặc điểm sau: − Con vật có ñặc ñiểm dịch tễ, triệu chứng bệnh tích bệnh − Kết ni cấy, phân lập, giám định vi khuẩn xác ñịnh vi khuẩn Mycobacterium bovis 10 TCVN 8400-10:2011 Phụ lục A (Quy ñịnh) Phương pháp nhuộm Ziehl-Neelsen (ZN) A.1 Thuốc nhuộm A.1.1 Carbon fuchsin ñặc − Chuẩn bị thuốc nhuộm Fuchsin basic 1,0 g Etanol 95 % (phần thể tích) 10,0 ml Phenol 5,0 g Nước 100,0 ml − Fuchsin basic hồ tan etanol, phenol hồ tan nước Trộn dung dịch với ñể vài ngày lọc qua giấy lọc, cho vào chai A.1.2 Dung dịch axit – alcohol Axit clohydric ñặc 8,0 ml Etanol 95 % (phần thể tích) 97,0 ml Nên cho axit HCl vào cồn etanol A.1.3 Dung dịch xanh metylen Xanh metylen 8,0 g Etanol 95 % (phần thể tích) 300,0 ml Nước 1300,0 ml Kali hydroxit 0,13 g 11 TCVN 8400-10:2011 A.2 Cách tiến hành Cho carbon fushin ngập tiêu ñã ñược cố ñịnh ñược ñặt giá Dùng lửa đèn cồn đốt phía tiêu để thuốc nhuộm bốc 10 khơng sôi Nhỏ dung dịch axit-alcohol 15 (tẩy nhiều lần) Nhỏ xanh metylen lên tiêu 20 s Rửa tiêu nước, để khơ A.3 Xem tiêu Nhỏ giọt dầu vào tiêu xem tiêu kính hiển vi quang học với vật kính độ phóng đại 100 lần 12 TCVN 8400-10:2011 Phụ lục B (Quy ñịnh) Phương pháp kiểm tra ñặc tính sinh hóa B.1 Phân giải nitrat Cho vài giọt nước vơ trùng vào ống nghiệm có nắp vặn (16 mm x 125 mm) cấy vào vòng que cấy vi khuẩn lao Dùng ống nghiệm có nước cất vơ trùng khác khơng cấy làm đối chứng âm Cho ml dung dịch NaNO3 (pha dung dịch NaNO3 0,01 M ñệm phosphat 0,022 M, pH 7) Lắc ủ nồi ñun cách thuỷ 37 oC h Cho tiếp vao ống nghiệm giọt axít HCl đặc pha lỗng 1/2, giọt dung dịch sulphanilamid 0,2 %, giọt dung dịch N-(1-naphthyl) etylendiamin dihydroclorua 0,1 % Kiểm tra phát triển màu hồng ñỏ so sánh với ñối chứng âm: màu đỏ sậm phản ứng dương tính B.2 Kiểm tra mẫn cảm với pyrazinamid Dùng môi trường nước thịt Dubos có bổ sung 0,1 g pyrazinamid, 2,0 g axit pyruvic 15 g agar (cho lít mơi trường) Chia vào ống nghiệm có nắp vặn 15 ml/ống Hấp 121 oC 15 ñể rắn thạch vị trí thẳng Cấy vào thạch lượng vi khuẩn M bovis ñặc ủ 37 oC ngày Sử dụng ống không cấy ống cấy M avium làm ñối chứng âm dương Cho ml dung dịch amoni sắt (II) sulfat chuẩn bị vào ống ñể vào tủ lạnh h Phản ứng dương tính có vạch màu hồng thạch B.3 Urease Trộn phần thạch urê với phần nước cất vô trùng Chia vào ống nghiệm có nắp (16 mm x 125 mm), ống ml Trộn vòng que cấy vào ống, ủ 37 oC Màu môi trường chuyển từ vàng sang hồng ñỏ dương tính B.4 Sản sinh niacin Nên sử dụng kít thương phẩm (ví dụ sản phẩm Difco) chuẩn bị phản ứng cần sử dụng dung dịch BrCN chất ñộc ñối với thể 13 TCVN 8400-10:2011 Thư mục tài liệu tham khảo [1] Viện thú Y quốc gia - JICA, 2002 Cẩm nang chẩn đốn tiêu chuẩn bệnh gia súc Việt Nam [2] Phạm Sỹ Lăng, Lê Văn Tạo Bạch Đăng Phong, 2002 Bệnh phổ biến bò sữa Nhà xuất Nơng nghiệp [3] OIE, 2008 Bovine tuberculosis In: Manual of Diagnostic Tests and Vaccines for Terrestrial Animals Chapter 2.4.7 http://www.oie.int/eng/normes/mmanual/2008/pdf/2.04.07_BOVINE_TB.pdf 14 .. .TCVN 8400-10:2011 Lời nói đầu TCVN 8400-10:2011 chuyển đổi từ 10 TCN 818:2006 thành tiêu chuẩn quốc gia theo quy ñịnh khoản Điều 69 Luật Tiêu chuẩn Quy chuẩn kỹ thuật ñiểm... chuẩn Đo lường Chất lượng thẩm ñịnh, Bộ Khoa học Công nghệ công bố TCVN 8400-10:2011 TCVN 8400-10:2011 TIÊU CHUẨN QUỐC GIA TCVN 8400-10:2011 Bệnh ñộng vật – Quy trình chẩn đốn – Phần 10: Bệnh lao... Difco) chuẩn bị phản ứng cần sử dụng dung dịch BrCN chất ñộc ñối với thể 13 TCVN 8400-10:2011 Thư mục tài liệu tham khảo [1] Viện thú Y quốc gia - JICA, 2002 Cẩm nang chẩn đốn tiêu chuẩn bệnh gia