Tiêu chuẩn Quốc gia TCVN 8400-11:2011. Tiêu chuẩn giới thiệu về bệnh động vật – quy trình chẩn đoán – phần 11: bệnh dịch tả vịt. Mời các bạn cùng tham khảo.
TCVN TIÊU CHUẨN QUỐC GIA TCVN 8400-11:2011 Xuất lần BỆNH ĐỘNG VẬT – QUY TRÌNH CHẨN ĐỐN – PHẦN 11: BỆNH DỊCH TẢ VỊT Animal disease – Diagnostic procedure – Part 11: Duck virus enteritis disease HÀ NỘI – 2011 TCVN 8400-11:2011 Lời nói đầu TCVN 8400-11:2011 chuyển ñổi từ 10 TCN 815:2006 thành tiêu chuẩn quốc gia theo quy ñịnh khoản Điều 69 Luật Tiêu chuẩn Quy chuẩn kỹ thuật ñiểm a khoản Điều Nghị ñịnh số 127/2007/NĐ-CP ngày 01/8/2007 Chính phủ quy định chi tiết thi hành số ñiều Luật Tiêu chuẩn Quy chuẩn kỹ thuật; TCVN 8400-11:2011 Cục Thú y biên soạn, Bộ Nơng nghiệp Phát triển nơng thơn đề nghị, Tổng cục Tiêu chuẩn Đo lường Chất lượng thẩm ñịnh, Bộ Khoa học Công nghệ công bố TCVN 8400-11:2011 TCVN 8400-11:2011 TIÊU CHUẨN QUỐC GIA TCVN 8400-11:2011 Bệnh động vật – Quy trình chẩn đốn – Phần 11: Bệnh dịch tả vịt Animal disease – Diagnostic procedure – Part 11: Duck virus enteritis disease CẢNH BÁO - Việc áp dụng tiêu chuẩn liên quan ñến vật liệu, thiết bị thao tác gây nguy hiểm Tiêu chuẩn khơng thể đưa ñược hết tất vấn ñề an toàn liên quan đến việc sử dụng chúng Các phòng thí nghiệm sử dụng tiêu chuẩn phải tự thiết lập ngun tắc bảo đảm an tồn sinh học để khơng phải bị nhiễm bệnh nghề nghiệp thất thoát mầm bệnh từ phòng thí nghiệm mơi trường Phạm vi áp dụng Tiêu chuẩn quy ñịnh quy trình chẩn đốn bệnh dịch tả vịt, ngan ngỗng Thuật ngữ, ñịnh nghĩa chữ viết tắt Trong tiêu chuẩn sử dụng thuật ngữ, ñịnh nghĩa chữ viết tắt sau: 2.1 Thuật ngữ ñịnh nghĩa Bệnh dịch tả vịt (duck virus enteritis disease) Bệnh truyền nhiễm cấp tính nguy hiểm xảy vịt, ngan, ngỗng lứa tuổi, Herpesvirus gây nên, gây viêm niêm mạc đường tiêu hóa ỉa chảy 2.2 Chữ viết tắt – PCR: Polymerase Chain Reaction (phản ứng chuỗi polyme) – Realtime PCR: Realtime Polymerase Chain Reaction (phản ứng chuỗi polyme tức thì) – DVE (DP): Duck Virus Enteritis Disease (Duck plague) (Bệnh dịch tả vịt) TCVN 8400-11:2011 – VN: Virus Neutralization (Phản ứng trung hòa vi rút với kháng thể chuẩn) – SN: Serum Neutralization (Phản ứng trung hòa huyết với vi rút giống chuẩn) – CPE: Cytopathologic Effects (Bệnh tích tế bào) – FCS: Fetal Calf Serum (Huyết bào thai bê) – DEF: Duck Embryo Fibroblast (Tế bào xơ phôi vịt) – NI: Neutralization Index (Chỉ số trung hòa) – EID50: Embryo Infective Dosage, 50 % (Liều gây nhiễm 50 % phôi trứng) – ELD50: Embryo Lethal Dosage, 50 % (Liều gây chết 50 % phôi trứng) – TCID50: Tissue Culture Infective Dosage, 50 % (Liều gây nhiễm 50 % tế bào) Thuốc thử vật liệu thử Sử dụng thuốc thử loại tinh khiết phân tích nước cất hai lần khử ion nước có độ tinh khiết tương đương khơng có Dnase/Rnase, trừ có quy định khác Xem Phụ lục A mô tả môi trường dung dịch thuốc thử - Cồn 70 % - Cồn 96 % ñến 100 % - Giống vi rút dịch tả vịt - Kháng huyết chuẩn kháng vi rút dịch tả vịt - Mồi (primers) mẫu dò (probe) đặc hiệu - Kit chiết tách ADN - Kit PCR, realtime PCR - Phôi trứng vịt từ 11 ngày tuổi đến 12 ngày tuổi - Phơi trứng vịt từ ngày tuổi ñến 10 ngày tuổi Thiết bị, dụng cụ - Tủ lạnh thường TCVN 8400-11:2011 - Tủ ấm, trì nhiệt độ 37 oC - Tủ sấy, trì nhiệt độ từ 100 oC ñến 200 oC - Tủ ấp trứng - Đèn soi trứng - Nồi hấp ướt - Máy ly tâm, hoạt động gia tốc 2000 g - Máy ly tâm ống nhỏ, hoạt ñộng ñược gia tốc 20000 g - Máy realtime PCR - Micropipet đơn kênh, dung tích hút từ 0,5 µl đến 10 µl, từ µl đến 20 µl, từ 20 µl ñến 200 µl, từ 100 µl đến 1000 µl - Micropipet đa kênh (dùng pha lỗng), dung tích hút từ 5µl đến 50 µl - Đầu típ phù hợp với loại micropipet (có lọc khơng lọc) - Ống lấy máu, dung tích 10 ml - Ống Eppendorf, dung tích từ 1,5 ml đến ml - Bơm tiêm, dung tích ml, ml, ml - Bộ cối chày sứ, có đường kính cm - Dụng cụ dao, kéo, panh, kẹp, - Buồng đếm tế bào Neubauer - Chai ni tế bào T25, T75 - Đĩa nuôi tế bào giếng, 24 giếng, 96 giếng Cách tiến hành 5.1 Chẩn đốn lâm sàng 5.1.1 Đặc điểm dịch tễ Bệnh dịch tả vịt bệnh truyền nhiễm cấp tính, lây lan cho vịt, ngan, ngỗng lứa tuổi TCVN 8400-11:2011 Bệnh lây lan nhanh trầm trọng khoảng ngày ñến ngày Bệnh lây lan chủ yếu qua tiếp xúc trực tiếp vịt khỏe mạnh vịt bị nhiễm bệnh Bệnh truyền qua phân gia cầm mắc bệnh dịch tiết từ mũi, miệng mắt Bệnh lây lan nhanh lây lan dễ dàng phương tiện học giày dép quần áo mang từ ñàn bị nhiễm ñến Bệnh dịch tả vịt có tỷ lệ ốm chết cao, từ 70 % đến 80 % bị nhiễm lần đầu trại khơng tiêm phòng vacxin dịch tả vịt thường xuyên, kết hợp với vệ sinh khơng đảm bảo 5.1.2 Triệu chứng bệnh tích Thời gian ủ bệnh thường từ ngày ñến ngày tùy theo ñộc lực vi rút Vịt, ngan, ngỗng bị bệnh có tượng giảm ăn, thăng bằng, phân lỗng, xù lơng, chảy nước mũi, mắt có dử, mí mắt sưng Con vật sợ ánh sáng Tuỳ theo trường hợp thấy nhiều bệnh tích sau: - Ở vịt trưởng thành có tượng gan bị bạc màu xuất huyết ñiểm Con thấy nang trứng bị xuất huyết - Mạch máu bị tổn thương Hệ bạch huyết bị tổn thương thối hóa nhu mơ - Đường tiêu hóa bị viêm, ruột xuất huyết thành mảng, có nhiều chất nhờn Đây bệnh tích đặc trưng bệnh dịch tả vịt - Kiểm tra vi thể thấy tổn thương mạch máu quan phủ tạng Xuất thể vùi nội nhân, thể vùi tế bào chất tể bào biểu mô hệ thống tiêu hóa Đây biến đổi vi thể điển hình bệnh 5.2 Chẩn đốn phòng thí nghiệm 5.2.1 Lấy mẫu bảo quản - Lấy mẫu vào thời kỳ ñầu ổ dịch Lấy sau vật ốm, chết mổ khám Lấy mẫu theo quy trình TCVN 8402:2010 Chẩn đốn bệnh động vật − Quy trình mổ khám - Mẫu bệnh phẩm gan, lách, thận Nếu vật bệnh xác chết phải lấy từ ñến Bệnh phẩm huyết ñể phát kháng thể kháng vi rút dịch tả vịt, huyết ñược lấy sau 10 ngày từ dịch bệnh xảy ra, vịt tiêm phòng lấy sau tiêm tháng ñể kiểm tra kháng thể bảo hộ TCVN 8400-11:2011 - Mẫu ñược bảo quản túi nilon lọ đựng bệnh phẩm vơ trùng, tất ñặt thùng bảo ôn vận chuyển ñiều kiện lạnh từ oC ñến oC Mẫu bệnh phẩm gửi đến phòng xét nghiệm vòng 24 h, kèm theo phiếu gửi bệnh phẩm 5.2.2 Xử lý bệnh phẩm Bệnh phẩm phủ tạng lấy từ gia cầm chết, bệnh nghi nhiễm dịch tả vịt ñược nghiền thành huyễn dịch 10 % với dung dịch nước sinh lý PBS Sau ly tâm với gia tốc 1000g 10 Thu lấy dịch nổi, xử lý vô trùng kháng sinh (2000 UI/ml) lọc qua màng cỡ 0,45 µm Huyễn dịch bệnh phẩm xử lý dùng để chẩn đốn phát vi rút dịch tả vịt phản ứng Realtime PCR phân lập vi rút phôi trứng vịt Bệnh phẩm máu ñược giữ oC ñến oC chờ đơng chắt lấy huyết để chẩn đốn phát kháng thể kháng vi rút dịch tả vịt 5.2.3 Phát kháng nguyên 5.2.3.1 Phân lập giám ñịnh vi rút phôi trứng vịt Sử dụng phôi trứng vịt từ 11 ngày tuổi ñến 12 ngày tuổi ñể tiêm truyền huyễn dịch bệnh phẩm ñã xử lý theo 5.2.2 Thu hoạch dịch niệu mơ để giám định vi rút phương pháp trung hòa với kháng thể chuẩn phơi trứng vịt theo quy định Phụ lục B 5.2.3.2 Phân lập giám ñịnh vi rút tế bào xơ phôi vịt Sử dụng tế bào xơ phơi vịt (DEF) để gây nhiễm huyễn dịch bênh phẩm Thu hoạch dịch ni tế bào giám định vi rút phương pháp trung hòa với kháng thể chuẩn mơi trường tế bào DEF theo quy định Phụ lục C 5.2.3.3 Kỹ thuật PCR phát vi rút - Chiết tách ADN vi rút dịch tả vịt kít chiết tách - Làm phản ứng PCR ñiện di sản phẩm PCR Hoặc làm phản ứng realtime PCR theo quy ñịnh Phụ lục D 5.2.4 Phát kháng thể Có thể phát kháng thể kháng vi rút dịch tả vịt huyết vịt mắc bệnh tiêm phòng vắc xin phương pháp trung hòa huyết với vi rút dịch tả vịt tiêm phôi trứng vịt tế bào xơ phôi vịt TCVN 8400-11:2011 5.2.4.1 Phương pháp trung hòa huyết phơi trứng vịt Pha loãng huyết cần phát kháng thể thành nồng độ 1/5, 1/10, 1/20… 1/1280 Trung hòa huyết với liều 1000 ELD50 (hoặc 100 EID50) vi rút dịch tả vịt Tiêm hỗn hợp vào xoang niệu mơ phơi trứng vịt (mỗi nồng độ tiêm phơi), theo dõi trứng ngày sau mổ khám trứng chết sống kiểm tra bệnh tích phơi Tính tốn số trung hòa NI hiệu giá trung hòa theo quy ñịnh Phụ lục B 5.2.4.2 Phương pháp trung hòa huyết tế bào xơ phơi vịt Pha loãng huyết cần phát kháng thể thành nồng độ 1/5, 1/10, 1/20… 1/1280 Trung hòa huyết với liều 100 TCID50 vi rút dịch tả vịt Gây nhiễm hỗn hợp lên tế bào xơ phôi vịt, theo dõi, kiểm tra bệnh tích tế bào mơi trường ni cấy Tính tốn số trung hòa NI hiệu giá trung hòa theo quy định Phụ lục C Kết luận Vịt, ngan, ngỗng ñược xác định mắc bệnh dịch tả vịt có ñặc ñiểm dịch tế học, triệu chứng lâm sàng bệnh dịch tả vịt kết dương tính với phương pháp xét nghiệm sau: – Phân lập vi rút phơi trứng vịt tế bào DEF kết giám định dương tính vi rút dịch tả vịt – Phản ứng PCR cho kết dương tính – Phản ứng realtime PCR dương tính – Đối với vật chưa tiêm phòng vắc xin dịch tả vịt có kết dương tính thực phản ứng trung hòa huyết phơi trứng vịt tế bào DEF 10 TCVN 8400-11:2011 Phụ lục A (Quy định) Thành phần chuẩn bị mơi trường dung dịch thuốc thử A.1 Dung dịch PBSx10 Thành phần: NaCl KCl Na2HPO4 KH2PO4 80,0 g 2,0 g 11,5 g 2,0 g Pha loãng với 1000 ml nước, ñiều chỉnh pH 7,2 Hấp tiệt trùng Bảo quản oC A.2 Dung dịch NaHCO3 % Thành phần: NaHCO3 Nước 7,0 g 100 ml Hấp tiệt trùng Bảo quản oC A.3 Dung dịch L-glutamine % Thành phần: L-glutamin Nước 3g 100 ml Dung dịch ñã pha lọc vơ trùng Bảo quản -20 oC A.4 Canh thang TPB (tryptose phosphate broth) Thành phần: 11 TCVN 8400-11:2011 Tryptoza phosphat Nước 29,5 g 1000 ml Hấp tiệt trùng Bảo quản oC A.5 Trypsin 2,5 % (10x) Thành phần: Trypsin PBS 2,5 g 100 ml Lắc qua đêm 4oC, lọc vơ trùng bảo quản -20 oC A.6 Môi trường nuôi cấy tế bào MEM Thành phần: Môi trường MEM (Eagle’s minimum 430 ml essential medium) Tryptoza phosphat broth (TPB) 12 50 ml L-glutamin % ml NaHCO3 % ml Kháng sinh (penicillin + streptomycin) ml FCS ml TCVN 8400-11:2011 Phụ lục B (Quy ñịnh) Phân lập giám định vi rút dịch tả vịt phơi trứng vịt B.1 Phân lập vi rút a) Tiêm bệnh phẩm vào phôi trứng vịt: - Dùng phôi trứng vịt từ 11 ngày tuổi đến 12 ngày tuổi (khơng có kháng thể kháng dịch tả vịt), lấy từ trại vịt bệnh - Soi trứng, chọn phôi khoẻ Mỗi mẫu bệnh phẩm tiêm từ phơi đến phơi - Sát trùng vỏ trứng cồn 70 % Dùi vị trí tiêm phía buồng - Dùng bơm tiêm hút dịch bệnh phẩm xử lý vơ trùng (bằng kháng sinh qua màng lọc 0,45 µm) tiêm 0,2 ml vào xoang niệu mơ - Gắn kín lỗ tiêm keo - Ấp tiếp nhiệt ñộ từ 37 oC ñến 38 oC Mỗi ngày soi trứng lần, loại bỏ phôi chết trước 24 h Theo dõi 10 ngày sau tiêm - Các trứng có phơi chết gần chết ñược bảo quản nhiệt ñộ oC Phơi nhiễm vi rút dịch tả vịt cường độc thường chết từ ngày ñến ngày sau tiêm - Sau 10 ngày, trứng khơng chết giữ oC để giết phơi b) Thu hoạch nước trứng - Mổ trứng điều kiện vơ trùng Sát trùng vỏ trứng cồn 70 % - Dùng kéo cắt quanh buồng hơi, bộc lộ xoang niệu mô - Hút nước trứng vào ống Eppendorf vô trùng, bảo quản nhiệt ñộ oC ñể kiểm tra B.2 Giám định vi rút Dùng phương pháp trung hòa vi rút phơi trứng vịt - Pha lỗng dịch niệu mơ thu hoạch thành nồng độ 10-1 ñến 10-9 với dung dịch PBS 13 TCVN 8400-11:2011 - Lơ đối chứng dương: trộn huyết chuẩn kháng dịch tả vịt với dịch niệu mơ pha lỗng thành nồng độ theo tỷ lệ 1:1 - Lơ ñối chứng âm: trộn huyết âm tính với dịch niệu mơ pha lỗng thành nồng độ theo tỷ lệ 1:1 - Ủ hỗn hợp nhiệt ñộ phòng h - Tiêm hỗn hợp vào xoang niệu mô phôi trứng vịt từ 11 ngày tuổi ñến 12 ngày tuổi, liều 0,2 ml/phôi; nồng ñộ tiêm trứng - Ấp trứng tủ ấm 37 oC theo dõi 10 ngày Loại bỏ trứng chết vòng 24 h Ghi chép số phơi chết - Nếu có vi rút dịch tả vịt lơ đối chứng dương phơi sống, lơ đối chứng âm phơi chết khoảng ngày ñến ngày với bệnh tích còi cọc, xuất huyết lan rộng - Dựa vào tỷ lệ sống chết phơi để tính tốn liều ELD50 (hoặc EID50) số trung hòa NI theo cơng thức Reed & Muench để đánh giá kết - Chỉ số trung hòa NI chênh lệch ELD50 (hoặc EID50) lơ đối chứng dương tính lơ đối chứng âm tính - Kết dương tính NI ≥ VÍ DỤ: Thí nghiệm có kết chuẩn ñộ liều ELD50 vi rút dịch tả vịt sau: Phản ứng Số trứng chết/ Số rút pha loãng trứng tiêm Chết Sống Chết Sống Tỷ số % Tỉ lệ chết, 10 -6 5/5 11 11/11 100 10 -7 4/5 6/7 86 10 -8 2/5 2/6 33 10 -9 0/5 0/9 Công thức Reed & Muench: A - 50 ELD50 = x (b-a) + a A-B 86 - 50 ELD50 = x [(-8) - (-7)] + (-7) = - 7,7 86 - 33 Như vậy, liều gây chết 50% phôi trứng 10 14 Giá trị cộng dồn Nồng ñộ vi -7,7 TCVN 8400-11:2011 Tính số trung hòa: Số trứng chết / số trứng tiêm Nồng ñộ vi rút (log10) -log10ELD50 -1 -2 -3 Đối chứng dương tính Đối chứng âm tính 5/5 5/5 0/5 -4 -5 -6 -7 -8 5/5 4/5 1/5 0/5 6,5 2,5 Kết quả: NI = 6,5 – 2,5 = 4,0 Kết luận: bệnh phẩm dương tính vi rút dịch tả vịt 15 TCVN 8400-11:2011 Phụ lục C (Quy ñịnh) Phương pháp phân lập giám ñịnh vi rút dịch tả vịt tế bào C.1 Chuẩn bị tế bào xơ phôi vịt (DEF – Duck Embryo Fibroblast) - Chọn trứng vịt có phơi từ ngày tuổi ñến 10 ngày tuổi, phát triển tốt Mổ trứng, lấy phôi - Rửa phôi dung dịch PBS có chứa % kháng sinh - Cắt bỏ ñầu, chân, cánh quan phủ tạng - Rửa lại phơi từ lần đến lần dung dịch PBS có chứa % kháng sinh - Cắt nhỏ phôi - Tách tế bào dung dịch trypsin ấm 0,25 % lắc nhẹ 250 r/min 15 - Thu hoạch tế bào ñă tách cách lọc qua lần vải gạc, cho vào môi trường MEM - Ly tâm huyễn dịch tế bào với gia tốc 1500 g, oC, loại bỏ phần nước - Rửa lại lần với mơi trường ni cấy - Đếm pha lỗng tế bào với môi trường phát triển (MEM + 10 % FCS), lượng tế bào cần thiết tối thiểu x 105 tế bào/ml C.2 Phân lập vi rút dịch tả vịt tế bào DEF - Cấy tế bào DEF chai ni tế bào T25 đĩa ni tế bào (đĩa giếng, 24 giếng), sau ngày ñến ngày tế bào mọc thành thảm (khoảng 70 %) gây nhiễm huyễn dịch bệnh phẩm xử lý, lượng 100 µl/giếng 500 µl/chai Việc cấy chuyển lần cần thiết trình phân lập - Quan sát CPE chai nuôi cấy thời gian ngày: Vi rút dịch tả vịt gây hủy hoại tế bào sau ngày ñến ngày Nếu CPE ñạt 70 % ñến 80 % sau ngày khơng có CPE tiến hành thu hoạch hỗn dịch tế bào - Cho chai nuôi cấy vào nhiệt độ -20 oC đến -40 oC làm đơng, sau giải đơng, lặp lại lần, cuối ly tâm thu phần nước ñể giám ñịnh vi rút cấy chuyển lần 16 TCVN 8400-11:2011 C.3 Giám ñịnh vi rút dịch tả vịt tế bào DEF a) Chuẩn bị Tế bào DEF đă ni cấy ngày đến ngày đĩa ni tế bào 96 giếng Pha loãng vi rút phân lập: nồng độ từ 10-1 đến 10-9 với mơi trường ni cấy MEM Lơ đối chứng dương tính: trộn kháng huyết dương tính dịch tả vịt với nồng ñộ vi rút ñă pha loãng theo tỷ lệ 1:1 Lơ đối chứng âm tính: trộn huyết âm tính với nồng độ vi rút đă pha lỗng theo tỷ lệ 1:1 b) Tiến hành Gây nhiễm hỗn hợp vào đĩa đă ni cấy tế bào DEF (đĩa 96 giếng), 100µ/giếng, giếng/nồng độ Ủ đĩa ni cấy tủ ấm CO2 37 oC h Đổ bỏ hỗn hợp trên, cho môi trường nuôi cấy MEM 100 µl/giếng Tiếp tục ủ đĩa ni cấy tủ ấm CO2 37 oC, thời gian từ ngày ñến ngày Hàng ngày kiểm tra CPE , thường vi rút dịch tả vịt gây hủy hoại tế bào sau ngày ñến ngày c) Đánh giá kết Dựa vào kết CPE lô để tính tốn liều TCID50 số trung hòa NI theo cơng thức Reed & Muench để đánh giá kết Chỉ số trung hòa NI chênh lệch TCID50 lơ đơi chứng dương tính lơ ñối chứng âm tính Kết dương tính NI ≥ 17 TCVN 8400-11:2011 Phụ lục D (Quy ñịnh) Phát vi rút dịch tả vịt phản ứng PCR D.1 Chiết tách DNA vi rút từ mẫu bệnh phẩm Chiết tách kit theo quy trình nhà sản xuất Dưới ñây hướng dẫn kit chiết tách QIAamp DNeasy Blood & Tissue Mini Kit - Nhỏ 20 µl protease vào ống 1,5 ml - Nhỏ 200 µl huyễn dịch bệnh phẩm vào ống - Nhỏ 200 µl dung dịch AL vào ống - Lắc ống 15 s ly tâm 350g 15 s (spin down) - Ủ 56 oC 10 ly tâm 350g 15 s - Nhỏ 200 µl cồn 96 % đến 100 % vào ống, lắc ñều 15 s ly tâm 350g 15 s - Chuyển toàn dịch ống vào cột lọc có ống thu - Ly tâm cột lọc ống thu với tốc ñộ 6000g nhiệt độ phòng - Chuyển cột lọc sang ống thu - Nhỏ 500 µl dung dịch AW1 vào cột lọc, ly tâm với tốc ñộ 6000g nhiệt độ phòng - Chuyển cột lọc sang ống thu - Nhỏ 500 µl dung dịch AW2 vào cột lọc, ly tâm với tốc ñộ 20000g nhiệt độ phòng - Chuyển cột lọc sang ống 1,5 ml khơng có Dnase - Nhỏ 200 µl dung dịch AE vào cột lọc, ủ nhiệt độ phòng - Ly tâm cột lọc ống 1,5 ml với tốc ñộ 6000g nhiệt độ phòng - Bỏ cột lọc, giữ lại dung dịch ống 1,5 ml - Bảo quản ống oC làm PCR ngay, - 20 oC làm PCR sau 24 h 18 TCVN 8400-11:2011 D.2 Kỹ thuật PCR a) Pha hỗn hợp nhân gen (master mix) theo hướng dẫn nhà sản xuất kit nhân gen PCR b) Sử dụng cặp mồi (primers) ñặc hiệu phát gen vi rút dịch tả vịt Trình tự cặp mồi dùng ñể phát vi rút dịch tả vịt kỹ thuật PCR Mồi xi 5'-GAA-GGC-GGG-TAT-GTA-ATG-TA-3' Mồi ngược 5'-CAA-GGC-TCT-ATT-CGG-TAA-TG-3' Chu trình nhân gen vòng 95 °C, 37 °C, 35 vòng 95 °C, s 55 °C, 30 s 72 °C, 20 s vòng 72°C, Giữ oC ñến chạy ñiện di c) Chạy ñiện di sản phẩm PCR: Pha thạch Agar % dung dịch ñệm TAE, ñun cho tan đều, nguội, đổ vào khn điện di (có lược) Khi thạch đơng, để vào buồng điện di có đệm TAE Các sản phẩm PCR pha với dung dịch loading với tỷ lệ 1:10, trộn lẫn với ethidi bromua nhỏ vào giếng miếng thạch agar (10 µl/mẫu) Chạy điện di h ñiện 120 V Rửa bỏ thuốc nhuộm cách ngâm nước 45 ñọc kết ánh sáng UV, chụp ảnh d) Đọc kết quả: - Mẫu đối chứng dương mẫu dương tính có vạch với kích cỡ 446 bp - Mẫu đối chứng âm mẫu âm tính khơng có vạch 19 TCVN 8400-11:2011 D.3 Kỹ thuật Real-time PCR Sử dụng kỹ thuật Real-time PCR với SYBR Geen: dùng cặp mồi (primers) với nguyên liệu cho Real-time PCR, ví dụ kit QuantiFast SYBR PCR (hãng Qiagen) Lượng chất phản ứng cho mẫu sau: 2x Master mix 12,5 µl H2O 6,5 µl Mồi xi (20 µM) 0,5 µl Mồi ngược (20 µM) 0,5 µl Kết rPCR hiển thị qua chương trình phần mềm máy tính: - Mẫu dương tính có giá trị Ct, mẫu âm tính khơng có - Mẫu đối chứng dương có giá trị Ct biết qua định lượng (± Ct) - Mẫu đối chứng âm khơng có giá trị Ct 20 TCVN 8400-11:2011 Thư mục tài liệu tham khảo [1] OIE Terrestrial Manual 2008 Chapter 2.3.7 Duck virus enteritis p 507-514 [2] Cẩm nang chẩn đốn tiêu chuẩn bệnh gia súc Việt Nam (JICA- SNIVR 2/2002), trang 155 21 .. .TCVN 8400-11:2011 Lời nói đầu TCVN 8400-11:2011 chuyển đổi từ 10 TCN 815:2006 thành tiêu chuẩn quốc gia theo quy ñịnh khoản Điều 69 Luật Tiêu chuẩn Quy chuẩn kỹ thuật ñiểm... chuẩn Đo lường Chất lượng thẩm ñịnh, Bộ Khoa học Công nghệ công bố TCVN 8400-11:2011 TCVN 8400-11:2011 TIÊU CHUẨN QUỐC GIA TCVN 8400-11:2011 Bệnh ñộng vật – Quy trình chẩn đốn – Phần 11: Bệnh dịch... chi tiết thi hành số ñiều Luật Tiêu chuẩn Quy chuẩn kỹ thuật; TCVN 8400-11:2011 Cục Thú y biên soạn, Bộ Nông nghiệp Phát triển nơng thơn đề nghị, Tổng cục Tiêu chuẩn Đo lường Chất lượng thẩm