Tiêu chuẩn Quốc gia TCVN 8400-6:2011

Tiêu chuẩn Quốc gia TCVN 8400-6:2011. Tiêu chuẩn về Bệnh động vật – quy trình chẩn đoán – phần 6: bệnh xuất huyết thỏ. Tiêu chuẩn này quy định quy trình chẩn đoán bệnh xuất huyết thỏ đối với thỏ ở mọi lứa tuổi.

âm 20 0C nhiệt ñộ thấp D.2 Cách tiến hành D.2.1 Chuẩn bị cặp mồi Cặp mồi ñược thiết kế dựa ñoạn gen mã hóa protein bám gắn vi rút ñể khuếch ñại sản phẩm có kích thước 269 bp Cặp mồi có trình tự sau: Cặp mồi Mồi xuôi Mồi ngược Cặp mồi sử dụng nồng độ 10 µM 18 Trình tự 5’-d CAGCCGTACTGAGCCAGATGTA -3’ 5’-d AAGGACTAGTGGGAACAAGG- 3’ TCVN 8400-6:2011 D.2.2 Thực phản ứng PCR Pha hỗn hợp phản ứng (hỗn hợp mẹ) VÍ DỤ: Sử dụng kít Platinium Quantitative PCR Superscript II hãng Invitrogen, Co., USA Hỗn hợp mẹ Lượng cho 01 phản ứng, µl Nước cất siêu khơng có men Nuclease 9,5 Superscript II reverse transcriptase mix 12,5 Mồi xuôi Mồi ngược Mẫu RNA Tổng lượng 20,0 Để tính lượng hỗn hợp phản ứng cho nhiều phản ứng, lấy lượng nguyên liệu cho phản ứng nhân với tổng số mẫu ñối chứng Sau pha hỗn hợp phản ứng, chia 20 µl hỗn hợp mẹ vào ống PCR, sau cho µl RNA mẫu đối chứng vào ống thích hợp, ly tâm nhanh, ñặt ống PCR vào máy PCR Chạy phản ứng theo chu trình nhiệt sau: Chu trình Chu trình Chu trình o 42 C, min; o o o o o 72 C,10 min; 30 x (94 C,1 min; 56 C, 45 s; 72 C, 50 s) 94 C,10 o Giữ C D.2.3 Điện di hiển thị sản phẩm PCR Pha 1,2 g bột agarose (gel) với 100 ml 1xTAE, đun nóng lò vi sóng tan hồn tồn Khi hỗn hợp nguội bớt chạm tay vào, cho tiếp µl etidi bromua (10 mg/ml) vào Sau ñó ñổ gel vào khay gel cắm lược Để gel cứng lại khoảng h, rút lược Đổ ñầy dung dịch 1xTAE vào bể ñiện di (đến vạch full level), đặt khay gel vào vị trí bể ñiện di Pha ul loading dye với µl 100 bp lader đưa vào giếng miếng Gel Pha µl loading dye vơi µl mẫu (đối chứng âm dương) đưa vào giếng lại miếng Gel Điện di gel 80 V ñến 100 V 30 ñến 40 D.3 Đọc kết Đặt gel ñã ñiện di vào máy chiếu UV (UV transilluminator) có bước sóng 590 nm Các mẫu có hiển thị band sản phẩm kích thước 269 bp dương tính 19 TCVN 8400-6:2011 Phụ lục E (Quy ñịnh) Kỹ thuật làm phản ứng rRT-PCR E.1 Chiết tách RNA Xem Phụ lục D E.2 Cách tiến hành E.2.1 Chuẩn bị cặp mồi Các mồi xi mồi ngược mẫu dò thiết kế ñặc hiệu ñể phát gen RNA pol vi rút Calici thuộc họ Caliciviridae Cặp mồi Trình tự Mồi xuôi 5’-d ACYTYACTAAACTYATTGACG -3’ Mồi ngược 5’-d TCAGACATAAGAAAAGAAATTGG- 3’ Mẫu dò FAM – CCAARAGCACRCTCGTGTTCAACCT- TAMRA Cặp mồi sử dụng nồng độ 10 µM Cơng thức pha hỗn hợp mẹ (master mix) thay đổi cho phù hợp với loại cặp mồi loại kít rRT-PCR khác Dưới quy trình giới thiệu kit Cơng thức áp dụng cho kít RT-PCR hãng Invitrogen Hỗn hợp mẹ Nước 5,5 2X Reaction buffer 12,5 Enzym mix 0,5 Mồi xuôi 0,5 Mồi ngược 0,5 Mẫu dò 0,5 Mẫu RNA Tổng cộng 20 Lượng cho 01 phản ứng, µl 25 µl TCVN 8400-6:2011 E.2.2 Thực phản ứng PCR Đặt ống phản ứng vào máy chu kỳ nhiệt chọn chương trình chạy PCR phần mềm máy vi tính Nhập ký hiệu mẫu kiểm tra với mẫu ñối chứng dương tính, âm tính vào phần Ký hiệu mẫu bảng kết Lưu chương trình chạy máy Cài đặt chương trình phân tích liệu cho máy chu kỳ nhiệt (ví dụ: máy Cepheid Smart Cycler Biorad IQ5) chạy chương trình Chạy phản ứng theo chu trình nhiệt sau: Chu trình o 50 C, 30 min; Chu trình Chu trình o 68 C, 45 s; o 45 x (94 C, s; 55 C, 45 s) o 94 C, o o Giữ C E.3 Phân tích kết Các giá trị mặc định thiết lập chương trình chạy máy Realtime RT-PCR ñể phát vi rút xuất huyết thỏ Mẫu đối chứng dương tính (được chuẩn ñộ trước) phải có giá trị Ct ñã biết (± Ct) mẫu đối chứng âm tính phải có Ct = kết rRT-PCR cơng nhận Mẫu có giá trị Ct ≤ 35 coi dương tính Mẫu khơng có Ct coi âm tính Mẫu có giá trị Ct khoảng từ 35 ñến 40 ñược coi nghi ngờ Những mẫu nghi ngờ cần ñược xác chẩn phương pháp phân lập vi rút trước có kết luận chẩn đốn cuối 21 TCVN 8400-6:2011 Thư mục tài liệu tham khảo [1] O.I.E., 2009 Manual of Diagnostic Tests and Vaccines for Terrestrial Animals, Rabbit haemorrhagic disease, Chapter 2.6.2 [2] A Gall, B Hoffmenn, J.P Teifke, B Lange, H Schirrmeier Persisitence of viral RNA in rabbits which overcome an experimental RHDV infection detected by a highly sensitive multiplex realtime RT-PCR Tạp chí Veterinary Microbiology 120 (2007), trang17-32, Đức 22 ... kích thước 269 bp dương tính 19 TCVN 8400-6:2011 Phụ lục E (Quy ñịnh) Kỹ thuật làm phản ứng rRT-PCR E.1 Chiết tách RNA Xem Phụ lục D E.2 Cách tiến hành E.2.1 Chuẩn bị cặp mồi Các mồi xi mồi ngược.. .TCVN 8400-6:2011 D.2.2 Thực phản ứng PCR Pha hỗn hợp phản ứng (hỗn hợp mẹ) VÍ DỤ: Sử dụng kít Platinium... 0,5 Mồi xuôi 0,5 Mồi ngược 0,5 Mẫu dò 0,5 Mẫu RNA Tổng cộng 20 Lượng cho 01 phản ứng, µl 25 µl TCVN 8400-6:2011 E.2.2 Thực phản ứng PCR Đặt ống phản ứng vào máy chu kỳ nhiệt chọn chương trình chạy