Tiêu chuẩn Quốc gia TCVN 8400-7:2011

Tiêu chuẩn Quốc gia TCVN 8400-7:2011 trình bày nội dung về bệnh động vật – quy trình chẩn đoán – phần 7: bệnh đậu cừu và đậu dê. Mời các bạn cùng tham khảo để nắm bắt nội dung chi tiết.

TCVN TIÊU CHUẨN QUỐC GIA TCVN 8400-7:2011 Xuất lần BỆNH ĐỘNG VẬT – QUY TRÌNH CHẨN ĐỐN – PHẦN 7: BỆNH ĐẬU CỪU VÀ ĐẬU DÊ Animal disease – Diagnostic procedure – Part 7: Sheep pox and goat pox disease HÀ NỘI – 2011 TCVN 8400-7:2011 Lời nói ñầu TCVN 8400-7:2011 Cục Thú y biên soạn, Bộ Nơng nghiệp Phát triển nơng thơn đề nghị, Tổng cục Tiêu chuẩn Đo lường Chất lượng thẩm ñịnh, Bộ Khoa học Công nghệ công bố TCVN 8400-7:2011 TCVN 8400-7:2011 TIÊU CHUẨN QUỐC GIA TCVN 8400-7:2011 Bệnh động vật – Quy trình chẩn đốn – Phần 7: Bệnh ñậu cừu ñậu dê Animal disease – Diagnostic procedure – Part 7: Sheep pox and goat pox disease CẢNH BÁO – Việc áp dụng tiêu chuẩn liên quan ñến vật liệu, thiết bị thao tác gây nguy hiểm Tiêu chuẩn ñưa ñược hết tất vấn ñề an tồn liên quan đến việc sử dụng chúng Các phòng thí nghiệm sử dụng tiêu chuẩn phải tự thiết lập ngun tắc bảo đảm an tồn sinh học để khơng phải bị nhiễm bệnh nghề nghiệp thất mầm bệnh từ phòng thí nghiệm môi trường Phạm vi áp dụng Tiêu chuẩn quy định quy trình chẩn đốn bệnh đậu cừu dê Thuật ngữ ñịnh nghĩa Trong tiêu chuẩn sử dụng thuật ngữ ñịnh nghĩa sau: 2.1 Bệnh ñậu cừu (sheep pox disease) Bệnh truyền nhiễm gây vi rút ñậu cừu (SPPV) thuộc giống Capripoxvirus họ Poxviridae 2.2 Bệnh ñậu dê (goat pox disease) Bệnh truyền nhiễm gây vi rút ñậu dê (GTPV) thuộc giống Capripoxvirus họ Poxviridae CHÚ THÍCH: Khơng có khác biệt đáng kể mặt lâm sàng bệnh gây vi rút ñậu cừu vi rút ñậu dê TCVN 8400-7:2011 Thuốc thử vật liệu thử Chỉ sử dụng thuốc thử loại tinh khiết phân tích sử dụng nước cất hai lần khơng chứa DNase nước có ñộ tinh khiết tương ñương, trừ có quy ñịnh khác Xem Phụ lục A mô tả tất dung dịch thuốc thử − Dung dịch axit sulfuric (H2SO4) N − Axeton (C3H6O) ñậm ñặc − Etanol ñậm ñặc (99,99 %) − Etanol 70 % ñến 75 % − Kháng nguyên chuẩn vi rút ñậu dê − Kháng thể thỏ kháng vi rút ñậu dê − Kháng thể dê kháng vi rút ñậu dê − Chất gắn kết cho ELISA kháng nguyên (Rabbit anti-goat IgG-horseradish peroxidase conjugate) − Chất gắn kết cho phương pháp kháng thể huỳnh quang (anti-GTPV gamma-globulin conjugated to fluorescein isothiocyanate) − Chất gắn kết cho phương pháp kháng thể huỳnh quang gián tiếp (anti-rabbit gamma-globulin conjugated to FITC) − Etylen diamin tetra-axit axetic (EDTA) − Proteinase K − Phenol − Cloroform − Isoamylalcohol − Bột agarose − Dung dịch TAE − Etidi bromua − Thuốc nhuộm, thang chuẩn dùng cho ñiện di sản phẩm PCR − Enzym EcoRI TCVN 8400-7:2011 − Kít chiết tách ADN − Kít nhân gen − Primer probe phát ADN vi rút ñậu dê − Môi trường tăng trưởng (Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium) − Môi trường bảo quản (Glasgow Eagle’s Medium) − Huyết thai bê (FCS) − Tế bào tinh hoàn thận cừu Thiết bị, dụng cụ Sử dụng thiết bị, dụng cụ thơng thường phòng thí nghiệm cụ thể sau ñây: − Tủ lạnh − Tủ ấm, tủ ấm CO2 − Tủ sấy − Cân phân tích, cân xác đến 10–4 g − Nồi hấp − Buồng an toàn sinh học cấp − Máy ly tâm lạnh − Máy khuấy từ − Kính hiển vi ñảo ngược (dùng soi tế bào) − Kính hiển vi huỳnh quang − Máy ñọc ELISA − Máy PCR/Realtime PCR − Thiết bị ñiện di chụp ảnh ñiện di − Bộ ñồ mổ tiểu gia súc − Đĩa ELISA − Ống effendorf 1,5 ml dùng ñể chắt huyết TCVN 8400-7:2011 − Ống PCR 0,2 ml − Bộ cối chày sứ − Panh, kéo cắt tổ chức bệnh phẩm − Bộ micropipet đầu tip − Bơng cồn − Lọ nuôi tế bào loại T25, T75 − Đĩa ni tế bào loại giếng − Lam kính, kính − Giấy dán nhãn − Bút ghi nhãn − Bút chì mỡ ghi lam kính Cách tiến hành 5.1 Chẩn đốn lâm sàng 5.1.1 Đặc điểm dịch tễ Vi rút ñậu cừu ñậu dê gây bệnh cho cừu dê lứa tuổi, giống khơng phân biệt giới tính Dê, cừu chưa phơi nhiễm với vi rút ñậu cừu ñậu dê, nhiễm bệnh có tỷ lệ mắc tỷ lệ chết cao, lên tới 100 % Ở vùng bệnh ñậu cừu ñậu dê ñã lưu hành thành dịch địa phương tỷ lệ mắc khoảng % đến 10 % tỷ lệ chết thấp, ñộng vật mắc bệnh sau hồi phục ñã sinh kháng thể kháng lại vi rút tự nhiên 5.1.2 Triệu chứng lâm sàng Các triệu chứng ñặc trưng sốt cao từ 40 oC ñến 41 oC, da có xuất nốt đậu kích thước từ 0,5 cm đến cm, ñặc biệt vùng mũi miệng, tai, cổ, bụng, mặt sau đi, chân, hạch lympho bề mặt sưng ñặc biệt hạch sau hầu, chảy nước mắt, nước mũi, nước dãi nhiều có lẫn mủ nốt ñậu niêm mạc mắt, mũi, mồm bị loét Con bệnh thở khó có tiếng kêu hạch sau hầu sưng gây áp lực lên đường hơ hấp Thời gian ủ bệnh thường kéo dài từ tuần đến tuần, sau bắt đầu triệu chứng sốt, thở khó ăn Một đến hai ngày tiếp theo, nốt ñậu xuất da phát triển theo trình sau: trước tiên nốt thâm xuất hiện, nốt sần lên phát triển thành mụn nước, TCVN 8400-7:2011 tiếp ñến mụn mủ kết thúc việc tạo thành vảy ñậu Vảy ñậu mang mầm bệnh nhiều tháng Trong trường hợp bệnh cấp tính, vật chết mà khơng có tổn thương da Động vật non, động vật già hay tiết sữa mắc bệnh thể nặng sức ñề kháng yếu Khi đó, số triệu chứng khác quan sát ñược dê, cừu non ñang bú sữa có nhiều dịch nhày lẫn mủ tiết miệng mũi, viêm phổi nặng, bị sưng bầu vú sảy thai, lợi lưỡi có nhiều nốt lt 5.1.3 Bệnh tích 5.1.3.1 Bệnh tích đại thể Phổi bị xuất huyết, bề mặt phổi có nhiều nốt đậu màu trắng đỏ to, kích thước lên tới cm Khí quản chứa nhiều dịch màu hồng lẫn bọt khí Niêm mạc đường tiêu hóa, hơ hấp trông bị hoại tử Tất hạch thể sưng to phù Trên niêm mạc múi khế, vách cỏ, ruột già, lưỡi, vòm miệng, khí quản thực quản có nốt đậu, bị lt Q trình xuất nốt đậu niêm mạc đường tiêu hóa, hơ hấp xảy tương tự ngồi da 5.1.3.2 Bệnh tích vi thể Kiểm tra mơ học phương pháp nhuộm tiêu chuẩn H&E soi kính hiển vi thấy: Ở các vảy ñậu, nốt ñậu giai đoạn cấp tính, có thâm nhiễm tế bào, viêm huyết quản phù Ở tổn thương sớm có tích tụ tế bào bạch huyết, tương bào quanh huyết quản, lúc đầu có ñại thực bào, bạch cầu hạt (trung tính toan) thâm nhiễm vào, sau tổn thương tiếp tục tiến triển, nhiều ñại thực bào tế bào bạch huyết tương bào ñược thâm nhiễm vào Huyết quản bị viêm kèm theo triệu chứng huyết khối nhồi huyết dẫn ñến phù hoại tử Ở lớp da chân bì có tế bào lớn hình bao hàm bào tương không rõ ràng, toan nhân rỗng Lớp biểu bì bị dày lên, bị sừng dày sừng Ở tổ chức khác có thay ñổi tương tự, thâm nhiễm tế bào viêm huyết quản Ở đường hơ hấp có tổn thương lt 5.2 Chẩn đốn phòng thí nghiệm 5.2.1 Lấy mẫu bảo quản mẫu 5.2.1.1 Bệnh phẩm cho phát kháng nguyên – Vảy ñậu, nốt ñậu da, phổi: lấy tuần ñầu tiên xuất triệu chứng lâm sàng, trước có phát triển kháng thể trung hòa, để phân lập xét nghiệm ELISA ñối với vi rút Mẫu lấy sau có kháng thể trung hòa, nên để xét nghiệm PCR TCVN 8400-7:2011 – Dịch tiết từ mắt, mũi nước dãi lấy tăm bơng: thời gian lấy mẫu giống ñối với mẫu vảy ñậu, nốt ñậu – Máu (ñược chống ñông heparin EDTA) lấy giai ñoạn nhiễm trùng huyết ñể phân lập vi rút, xét nghiệm ADN vi rút 5.2.1.2 Bệnh phẩm cho phát kháng thể Huyết lấy ñộng vật mắc bệnh sau xuất triệu chứng lâm sàng từ 10 ngày trở ñi 5.2.1.3 Bảo quản Trong trình vận chuyển, tất loại mẫu phải ñược giữ nhiệt ñộ từ oC ñến oC, ngồi mẫu vảy đậu, nốt ñậu mẫu swab phải ñược giữ môi trường vận chuyển [PBS (A.2) có chứa % BSA, % dung dịch kháng khuẩn (A.1)], mẫu tổ chức có nốt đậu dùng cho xét nghiệm kháng thể huỳnh quang khơng cần giữ mơi trường bảo quản, cần giữ nhiệt ñộ lạnh oC đến oC 24 h Tại phòng thí nghiệm, mẫu ñể phân lập xét nghiệm vi rút phải ñược giữ -20 oC, ñể lâu (hơn tuần) chưa xét nghiệm phải giữ -70 oC, huyết giữ oC vòng tuần -20 oC ñể lâu 5.2.2 Phát kháng nguyên 5.2.2.1 Xử lý mẫu – Mẫu vảy ñậu, nốt ñậu lấy từ da phổi: lấy từ g ñến g, cắt nhỏ nghiền cối chày sứ vô trùng với dung dịch PBS (A.2) thành huyễn dịch 10 %, bổ sung 0,1 ml dung dịch kháng khuẩn (A.1) Thực quy trình đơng (-70 oC) tan lần huyễn dịch Ly tâm 600g 10 thu lấy dịch ñể xét nghiệm vi rút phương pháp phân lập vi rút tế bào, ELISA phát kháng nguyên ADN vi rút PCR Real-time PCR – Dịch mắt, mũi, mồm ñược lấy tăm giữ môi trường bảo quản: lắc mạnh đều, hút lấy mơi trường bảo quản ñem chiết tách ADN ñể xét nghiệm PCR lọc qua màng lọc kích thước 0,45 µm ñể sử dụng cho phân lập vi rút – Máu (có % chất chống đơng heparin EDTA): dùng trực tiếp để xét nghiệm ADN vi rút phương pháp PCR/real-time PCR tách tế bào bạch huyết cho phân lập vi rút cách ly tâm từ ml ñến ml máu chống đơng gia tốc 600g 15 min, hút phần dịch tương bào hồng cầu cho vào ml nước lạnh Đợi 30 s, cho ml mơi trường tăng trưởng (DMEM) lạnh (từ oCđến oC) vào trộn ñều Ly tâm hỗn dịch lần 600g 15 Loại bỏ dịch nổi, thu lấy phần cặn, hòa với ml mơi trường tăng trưởng để dùng cho phân lập 10 TCVN 8400-7:2011 5.2.2.2 Phân lập giám ñịnh vi rút 5.2.2.2.1 Phân lập vi rút a) Chuẩn bị tế bào Các loại tế bào có nguồn gốc từ bò, cừu, dê sử dụng để phân lập, ni cấy vi rút ñậu dê, ñặc biệt tế bào tinh hoàn cừu, thận cừu sơ cấp thứ cấp dùng để phân lập, ni cấy tốt Phụ lục B quy ñịnh phương pháp chuẩn bị tế bào tinh hồn cừu Dùng mơi trường tăng trưởng (DMEM) có bổ sung hepes, 10 % FCS dung dịch kháng khuẩn (xem A1) để ni tế bào chai T25 cho ñến phát triển thành lớp ñơn bao phủ 90 % diện tích ni cấy đem sử dụng b) Gây nhiễm bệnh phẩm cho tế bào Lấy ml mẫu ñã ñược xử lý cấy vào chai ni tế bào T25 chuẩn bị Sau ủ h 37 oC, hút môi trường cũ, rửa lớp tế bào PBS (A.2) trước cho ml mơi trường DMEM có bổ sung hepes, % FCS dung dịch kháng khuẩn (xem A1) vào Theo dõi bệnh tích tế bào (CPE) vòng ngày Nếu bị nhiễm vi rút, mặt tế bào có CPE đặc trưng, màng tế bào bị co lại so với tế bào xung quanh, tế bào có dạng tròn có tích ñống nhiễm sắc chất Lúc ñầu CPE xuất vài chỗ, sau khoảng ñến ngày CPE lan rộng phủ tồn thảm tế bào Nếu sau ngày khơng thấy có CPE cho tồn chai ni cấy vào đơng (-70 oC) tan (làm từ lần ñến lần) Sau ñó ly tâm 600g 15 thu lấy phần ñể cấy chuyển lần sang chai nuôi tế bào T25 tiếp tục theo dõi CPE 5.2.2.2.2 Giám ñịnh vi rút Những chai tế bào có CPE ñược giám ñịnh vi rút ñậu cừu ñậu dê phương pháp PCR 5.2.2.3 Phát kháng nguyên phương pháp ELISA Dùng đĩa ELISA polysteryne 96 giếng (ví dụ, hãng Nunc, Maxisorp) ñể thực phản ứng ELISA Nhỏ vào giếng đĩa ELISA 75 µl kháng thể thỏ kháng vi rút ñậu dê pha dung dịch ñệm phủ ñĩa (A.5), tỷ lệ 1:25, ủ ñĩa oC qua ñêm Rửa ñĩa lần dung dịch PBST (A.3), 300 µl/giếng/lần Nhỏ 50 µl đối chứng âm (mơi trường tế bào khơng nhiễm vi rút dịch mẫu mơ bình thường) vào giếng A1 A2 Nhỏ 50 µl đối chứng dương (mơi trường tế bào nhiễm vi rút ñậu dịch mẫu mô nhiễm vi rút) vào giếng A3 A4 11 TCVN 8400-7:2011 5.2.2.5 Phát kháng nguyên phương pháp PCR Realtime PCR 5.2.2.5.1 Chiết tách ADN Có thể sử dụng kít chiết tách thương mại thực theo hướng dẫn nhà sản xuất thực theo phương pháp sau: Chuẩn bị mẫu: mẫu máu, lấy 200 µl cho vào 200 µl EDTA, lắc cho vào đơng lạnh sau lấy để tan; mẫu mơ (tổ chức bị bệnh, vảy, mụn đậu), nghiền khoảng 0,5 g mẫu với ml PBS (A.2) sau ly tâm lấy dịch nổi; tăm bơng dịch tiết, lắc dung dịch bảo quản chứa tăm dịch tiết trước chiết tách Cho 200 µl mẫu máu có EDTA mẫu dịch tiết vào 100 µl dung dịch đệm lysis (A.7) 200 µl mẫu mơ vào ml dung dịch đệm lysis ống 1,5 ml Cho µl proteinase K vào mẫu máu, dịch tiết 10 µl vào mẫu mơ Ủ mẫu 56 oC h Nung nóng mẫu nhiệt độ 100oC 10 để vơ hoạt enzyme Proteinase K Cho thể tích mẫu vào thể tích hỗn hợp phenol : cloroform : isoamylalcohol (25 : 24 : 1, phần thể tích) (300 µl vào mẫu máu, swab 1000 µl vào mẫu mơ), lắc mẫu máy Vortex, ủ nhiệt độ phòng 10 Ly tâm 14500g 15 Cho thể tích etanol (99,99 %) làm lạnh gần oC vào thể tích mẫu để mẫu vào -20 oC h Ly tâm mẫu 14500g 15 loại bỏ dịch Rửa phần cặn 100 µl etanol 70 % đến 75 % Ly tâm 14500g min, loại bỏ phần dịch phía Để khơ cặn ADN hòa với 30 µl nước khơng chứa nuclease 5.2.2.5.2 Phương pháp PCR a) Chuẩn bị cặp mồi (primers) Cặp mồi ñược thiết kế dựa ñoạn gen mã hóa protein bám gắn vi rút ñể khuếch ñại sản phẩm có kích thước 191 bp Cặp mồi có trình tự sau: 15 TCVN 8400-7:2011 Mồi Trình tự Mồi xuôi (Forward primer) 5’-d TTTCCTGATTTTTCTTACTAT 3’ Mồi ngược (Reverse primer) 5’-d AAATTATATACGTAAATAAC 3’ Các mồi ñược sử dụng nồng độ 10 pmol/µl (10 uM) b) Thực phản ứng PCR Chuẩn bị hỗn hợp mẹ (master) theo hướng dẫn kít VÍ DỤ: Sử dụng kít Platium Quantitative superMix-UDG hãng Invitrogen, Life Technologies Nguyên liệu Lượng cho 01 phản ứng, µl Nước khơng chứa nuclease 9,5 Platinium quantitative PCR superMix-UDG 12,5 Mồi xuôi (Forward primer) Mồi ngược (Reverse primer) Tổng lượng 24,0 Tính lượng hỗn hợp mẹ (master) cho nhiều phản ứng, lấy lượng nguyên liệu cho phản ứng nhân với tổng số mẫu ñối chứng Sau pha hỗn hợp mẹ, chia 24 µl hỗn hợp mẹ vào ống PCR, sau cho µl mẫu/đối chứng ADN dương vào ống thích hợp, µl nước nuclease vào ống ñối chứng âm, ly tâm nhanh, ñặt ống PCR vào máy PCR Chạy phản ứng theo chu trình nhiệt ñược cài ñặt dựa theo hướng dẫn kít VÍ DỤ: Sử dụng kít Platium Quantitative superMix-UDG hãng Invitrogen, Life Technologies Chu kỳ o 42 C, min; o 94 C, 10 16 Chu kỳ o o Chu kỳ o 40 x (94 C, min; 50 C, 30 s; 72 C,1 min) o 72 C, o Giữ C TCVN 8400-7:2011 c) Điện di hiển thị sản phẩm PCR Pha 1,5 g bột agarose (gel) với 100 ml 1xTAE, đun nóng lò vi sóng tan hoàn toàn Khi hỗn hợp nguội bớt (khoảng 50 oC đến 60 oC), cho tiếp µl etidi bromua (10 mg/ml) vào Sau đổ vào khay cắm lược Để gel cứng lại khoảng h, rút lược Đổ ñầy dung dịch 1xTAE vào bể ñiện di (ñến vạch full level), ñặt khay gel vào vị trí bể điện di Pha µl ñệm tải mẫu (loading dye) với µl 100 bp ladder ñưa vào giếng ñầu tiên miếng gel Pha µl đệm tải mẫu vơi µl mẫu (ñối chứng âm dương) ñưa vào giếng lại miếng gel Điện di gel 80 V ñến 100 V 30 ñến 40 d) Đọc kết PCR sau ñiện di Đặt gel ñã ñiện di vào máy chiếu UV (UV transilluminator) có bước sóng 590 nm Các mẫu có hiển thị vạch sản phẩm giống đối chứng dương có kích thước 191 bp dương tính Đối chứng âm khơng có vạch sản phẩm xuất Phân biệt vi rút ñậu dê ñậu cừu: Lấy µl sản phẩm PCR (191 bp) trộn với 20 µl đệm có chứa 20 ñơn vị enzym EcoRI (theo hướng dẫn nhà sản xuất), ủ 37 oC h Sau ñó ñiện di sản phẩm h ñọc kết Đối với vi rút ñậu dê, xuất vạch sản phẩm 191 bp, không bị phân cắt enzym EcoRI Đối với vi rút ñậu cừu, xuất vạch sản phẩm, sản phẩm 191 bp bị phân cắt enzym EcoRi thành ñoạn 129 bp 62 bp 5.2.2.5.3 Phương pháp Real-time PCR a) Chuẩn bị cặp mồi (primers) mẫu dò (probe) Cặp mồi mẫu dò thiết kế ñặc hiệu ñể phát gen ADN pol vi rút thuộc giống Capripoxvirus Mồi mẫu dò Mồi xi (Forward primer) Mồi ngược (Reverse primer) Mẫu dò (Taqman probe) Trình tự 5’-GGAATGATGCCRTCTARATTCCTATC-3’ 5’-CCCTGAAACATTAGTATCTGTATTTGTTGC-3’ 5’-Cy5-CATCRCATCTAGGTTCRCAATGGATT-3’-TAMRA Pha mồi mẫu dò nồng độ 10 pmol/µl để sử dụng b) Thực phản ứng PCR Chuẩn bị hỗn hợp mẹ theo hướng dẫn kit 17 TCVN 8400-7:2011 VÍ DỤ: Sử dụng kít Platium Quantitative superMix-UDG hãng Invitrogen, Life Technologies Nguyên liệu Lượng cho 01 phản ứng, µl Nước khơng chứa nuclease 5,5 Platinum Quantitative PCR SuperMix-UDG 12,5 Mồi xi, 10 µM 0,5 Mồi ngược,10 µM 0,5 Mẫu dò, 10 µM 0,5 Platinum Taq ADN Polymerase 0,5 Tổng lượng 20,0 Tính lượng hỗn hợp mẹ cho nhiều phản ứng, lấy lượng nguyên liệu cho phản ứng nhân với tổng số mẫu ñối chứng Sau pha Master mix: Chia 20 µl hỗn hợp mẹ vào ống PCR, sau cho µl ADN mẫu đối chứng vào ống thích hợp, ly tâm nhanh, ñặt ống PCR vào máy PCR; Chạy phản ứng theo chu trình nhiệt cài đặt dựa theo hướng dẫn kít VÍ DỤ: Sử dụng kít Platium Quantitative superMix-UDG hãng Invitrogen, Life Technologies Chu kỳ o 50 C, min, Chu kỳ x 40 vòng o o o 94 C, 15 s; 60 ñến 65 C, 30 s ñến 45 s o 95 C, 10 c) Đọc kết Mẫu dương tính mẫu có giá trị Ct vòng 35 chu kỳ ñầu phản ứng ñường ñược ñặt giai ñoàn lũy thừa gia tăng mật ñộ huỳnh quang 5.2.3 Phát kháng thể 5.2.3.1 Khái quát Kháng thể ñược phát phương pháp trung hòa huyết Phương pháp ñịnh tính ñịnh lượng kháng thể bệnh ñậu cừu đậu dê có huyết kiểm tra Huyết pha loãng kết hợp với lượng vi rút ñậu dê (ñậu cừu) ñịnh 100 liều TCID50 sau nhiễm lên tế bào tinh hồn cừu tế bào thận cừu, theo dõi phá hủy tế bào 18 TCVN 8400-7:2011 5.2.3.2 Chuẩn ñộ vi rút (xem sơ đồ Phụ lục C) Hồn ngun vi rút đơng khơ ml mơi trường DMEM, sau tiếp tục pha lỗng 1:10 Nhiễm từ 0,3 ml ñến 0,5 ml dung dịch vi rút lên tế bào LT chai T75 T175, ủ 37 oC tuần Thu hoạch vi rút CPE ñạt khoảng 90 %, thực quy trình đơng (-70 oC) tan lần để giải phóng vi rút khỏi tế bào Lắc chai nuôi cấy nhẹ hút tất dung dịch tế bào vào ống ly tâm 30 ml, ly tâm 350g Hút dịch có chứa vi rút sang ống tiến hành chuẩn độ vi rút sử dụng độ pha lỗng hệ số 10 Chuẩn bị ống (2 ml) vô trùng có chứa 900 µl mơi trường DMEM chứa hepes, 10 % FCS gentamycin (0,05 mg/ml) Lấy 100 µl dung dịch vi rút cần chuẩn ñộ cho vào ống thứ có chứa 900 µl mơi trường DMEM, trộn đều, bỏ đầu típ pipet Nồng độ vi rút 10-1 ñược chuẩn bị Sử dụng ñầu tip pipet hút 100 µl từ ống thứ (có nồng độ vi rút 10-1) sang ống thứ 2, trộn ñều, bỏ ñầu típ pipet Nồng ñộ vi rút 10-2 ñược chuẩn bị Tiếp tục pha lỗng để có nồng ñộ vi rút từ 10-3 ñến 10-8 Sử dụng ñầu tip pipet riêng rẽ để hút 200 µl dung dịch vi rút ban ñầu nồng ñộ vi rút ñể chuyển sang giếng từ A1 ñến A9 đĩa ni cấy tế bào 96 giếng Lặp lại tương tự cho giếng từ B1 ñến B9; từ C1 ñến C9 từ D1 ñến D9 Các giếng ñối chứng tế bào: A11, A12, B11, B12, C11, C12, D11, D12, cho 200 µl mơi trường DMEM có hepes, 10 % huyết thai bê kháng sinh Cho 80 µl tế bào LT có nồng độ 480 000 tế bào/ml vào tất giếng Ủ ñĩa chuẩn ñộ vi rút 37 oC với % CO2 12 ngày cho ñến giếng tế bào bắt đầu thối hóa Tính tốn lượng vi rút chuẩn độ cơng thức Reed Muench 5.2.3.3 Tiến hành phản ứng Đánh dấu đĩa trung hòa theo sơ ñồ Phụ lục C Xử lý huyết 56 0C 30 19 TCVN 8400-7:2011 Pha loãng huyết kiểm tra, đối chứng dương âm tính thành 1/5 mơi trường DMEM: 100 µl huyết + 400 µl mơi trường DMEM Nhỏ 100 µl mơi trường phát triển (DMEM) bổ sung Hepes, 10 % FCS kháng sinh vào giếng từ cột ñến cột 12, riêng giếng hàng ñối chứng tế bào, cho vào 20 µl mơi trường DMEM Nhỏ 200 µl huyết kiểm tra (pha lỗng1/5 mơi trường DMEM) vào cột ñĩa, mẫu giếng Dùng pipet đa kênh pha lỗng huyết kiểm tra theo số từ hiệu giá 1:10 tới hiệu giá 1:160 Mỗi nồng ñộ giếng, giếng 100 µl Chuẩn bị dung dịch vi rút 100 TCID50 độ pha lỗng khác từ 10-1 ñến 10-4 Nhỏ 100 µl dung dịch vi rút 100 TCID50 vào giếng có huyết đối chứng vi rút, 100 µl độ pha lỗng vào giếng kiểm tra chuẩn ñộ vi rút, nồng ñộ giếng Ủ 37 0C với % CO2 h Thêm 80 µl dịch tế bào, ủ 37 0C với % CO2 tới 12 ngày Kiểm tra CPE hàng ngày, bắt ñầu từ ngày thứ ngày thứ cho ñến ngày thứ 12 Đọc kết quả: Các giếng đối chứng huyết dương tính Khơng có CPE Các giếng đối chứng huyết âm tính Đều có CPE Các mấu huyết coi dương tính Hiệu giá kháng thể kiểm tra tính Các giếng đối chứng tế bào Khơng có CPE Độ pha lỗng cao giếng có CPE Để báo tế bào tồn ñược Kết phản ứng phải ñọc trước tế bào bị thối hóa Nếu có dấu hiệu giống CPE, phản ứng phải làm lại Các giếng kiểm tra chuẩn ñộ vi rút Để báo phát triển vi rút phản ứng tối ưu Một nửa số giếng độ pha lỗng vi rút 10-2 phải có CPE vào giai đoạn cuối phản ứng Tất giếng ñộ pha lỗng vi rút thấp có CPE độ pha lỗng cao khơng có CPE 20 TCVN 8400-7:2011 Kết luận Cừu, dê ñược xác ñịnh mắc bệnh ñậu cừu đậu dê có đặc điểm dịch tễ học, triệu chứng lâm sàng bệnh ñậu cừu đậu dê kết dương tính với phương pháp xét nghiệm sau: – Phân lập giám định cho kết dương tính – Phản ứng ELISA phát kháng nguyên dương tính – Phản ứng PCR real-time PCR phát vi rút dương tính – Phản ứng kháng thể huỳnh quang dương tính – Phản ứng trung hòa huyết dương tính dê chưa tiêm phòng vacxin 21 TCVN 8400-7:2011 Phụ lục A (Quy ñịnh) Thành phần chuẩn bị dung dịch thuốc thử A.1 Dung dịch kháng khuẩn Penicilin 1.000.000 UI Kanamycin 1.000.000 UI Streptomycin 200 mg Mycostatin 250.000 UI Nước 10 ml Hòa tan kháng sinh lọc màng lọc 0,45 µm Bảo quản ngăn đá tủ lạnh A.2 Dung dịch muối ñệm phosphat (PBS) 0,1 M pH 7,2 NaCl 80 g KCl 2g Na2HPO4 11,5 g KH2PO4 2g Nước 1000 ml Chỉnh pH ñến 7,2 dung dịch NaOH N dung dịch HCl N Hấp tiệt trùng Bảo quản 0C ñến 0C A.3 Dung dịch PBST (PBS 0,03 M, % Tween 20, pH 7,4) Lấy 300 ml PBS 0,1 M pha với 700 ml nước, sau bổ sung % Tween 20 A.4 Dung dịch ñệm ngăn chặn (PBS 0,15 M, % Tween 20, % BSA, pH 7,4) 22 NaCl 120 g KCl 3g Na2HPO4 17,25 g TCVN 8400-7:2011 KH2PO4 3g Nước 1000 ml Bổ sung % Tween 20, % BSA, chỉnh pH ñến 7,4 Hấp tiệt trùng Bảo quản 0C ñến 0C A.5 Dung dịch ñệm phủ, pH 9,6 NaHCO3 2,93 g/l Na2CO3 1,59 g/l Pha loãng dung dịch ñệm phủ 0,05 M năm lần ñể ñược dung dịch 0,01 M A.6 Dung dịch chất Orthophenylen diamin [C6H4(NH2)2] 30 mg Nước 75 ml Bổ sung 0,05 % hydro peroxit (H2O2) A.7 Dung dịch ñệm lysis (lysis buffer) Guanidin thiocyanat 60 g KCl 0,378 g Tris (1 M, pH 8) ml Tween 20 0,5 ml Nước vừa ñủ 100 ml Cho tất thuốc thử nêu vào cốc có mỏ, cho thêm 50 ml nước ấm khuấy ñều Thêm nước cho ñủ 100 ml A.8 Dung dịch ñệm glyxerin pH 8,3 NaHCO3 0,0715 g Na2CO3 0,0016 g Nước 10 ml Glyxerin vừa ñủ 100 ml Bảo quản nhiệt ñộ oC, dùng ñọc huỳnh quang 23 TCVN 8400-7:2011 A.9 Dung dịch PBS- Ca++ Mg++ NaCl 8,0 g KCl 0,2 g Na2HPO4 1,15 g KH2PO4 0,2 g Nước vừa ñủ 1000 ml Chỉnh pH 7,2 Hấp tiệt trùng Bảo quản nhiệt độ phòng A.10 Dung dịch PBS+ có Ca++ Mg++ NaCl 8,0 g KCl 0,2 g Na2HPO4 1,15 g KH2PO4 0,2 g CaCl2 0,1 g MgCl2 0,1 g Nước vừa ñủ 1000 ml Chỉnh pH 7,2 Hấp tiệt trùng Bảo quản nhiệt độ phòng 24 TCVN 8400-7:2011 Phụ lục B (Quy định) Chuẩn bị tế bào tinh hồn cừu sơ cấp B.1 Chuẩn bị tế bào tinh hoàn cừu sơ cấp Thực bước ñiều kiện vơ trùng sau: Cắt tinh hồn cừu vào chai có chứa dung dịch đệm PBS+ (A.10) để vận chuyển Tại phòng thí nghiệm, hút hết dung dịch PBS+ (A.10) thêm dung dịch PBS- (A.9) vào chai ñể rửa qua tinh hồn Sau gắp vào ñĩa Petri vô trùng Dùng pank kéo ñể giữ tinh hồn cắt bỏ phần mơ liên kết mỡ màng tinh hồn Sau cắt tinh hoàn thành miếng nhỏ Chuyển mẩu tinh hoàn vào ống ly tâm 50 ml cho thêm 40 ml PBS- (A.9) Lắc nhẹ, ñều ống ly tâm ly tâm 2000g 10 Tuỳ thuộc vào lượng tinh hồn để sử dụng nhiều ống ly tâm Sau ly tâm, hút bỏ dịch Thêm 40 ml PBS- (A.9) vào ống ly tâm, lắc ñều ly tâm Lặp lại bước thêm lần Sau lần ly tâm cuối, thu phần tế bào lắng cặn bên để hồ với 30 ml Dispase 0,3 % ấm (có nhiệt độ từ 35 oC ñến 39 oC) (Chuẩn bị Dispase 0,3 % sau: hoà g Dispase với 330 ml PBS- (A.9) tiệt trùng lọc qua màng lọc 0,2 µm) Lắc nhẹ ống ñể làm tơi phần tế bào lắng cặn Chuyển toàn dung dịch tế bào vào chai ni cấy thích hợp Thêm 70 ml Dispase 0,3 % lắc vòng h máy khuấy từ Chuyển toàn dung dịch tế bào vào ống ly tâm 50 ml ly tâm 2000g 10 Hút bỏ phần dịch nổi, hoà phần tế bào lắng cặn với mơi trường trì tế bào (mơi trường Glasgow Eagle’s) khơng có huyết lắc ñều ñể làm tơi phần tế bào lắng cặn Chuẩn bị mơi trường tế bào có bổ sung yếu tố tăng trưởng kháng sinh (môi trường DMEM + Hepes + 10 % huyết thai bê + kháng sinh penicilin streptomycin) Sau chia 70 ml môi trường tăng trưởng vào chai nuôi cấy (175 cm2) 25 TCVN 8400-7:2011 Dùng pipet trộn ñều tế bào hồ với mơi trường trì ống ly tâm 50 ml chuyển lượng vào chai ni cấy có mơi trường tăng trưởng Tuỳ thuộc vào Lượng tế bào ống ly tâm chia cho từ chai đến 15 chai ni cấy (175 cm2) Sau 24 h nuôi, thay môi trường tăng trưởng Hút bỏ môi trường cũ Rửa thảm tế bào dung dịch PBS+ (A.10) ñể loại bỏ hồng cầu xác tế bào chết Cho 70 ml mơi trường tăng trưởng chuẩn bị Đặt chai nuôi cấy vào tủ ấm 35 oC ñến 39 oC Theo dõi phát triển tế bào kiểm tra tạp khuẩn hàng ngày Tỷ lệ phát triển tế bào sau: – Sau 24 h: từ 30 % ñến 40 % diện tích ni cấy bao phủ – Sau 48 h: từ 60 % đến 80 % diện tích ni cấy ñược bao phủ – Sau 72 h: 100 % diện tích ni cấy bao phủ Sau tế bào đạt 100 % diện tích ni cấy, cấy chuyển đời tế bào sang mơi trường mới, đơng lạnh Nếu khơng thay mơi trường, trì ñược thời gian 10 ngày 37 oC lâu ñể 28 oC ñến 33 oC giảm nồng ñộ huyết từ % xuống % B.2 Chuyển ñời tế bào Hút bỏ môi trường cũ, cho 50 ml dung dịch PBS- (A.9) vào để rửa lớp tế bào sau hút bỏ dung dịch ñệm PBS Cho 20 ml dung dịch Versene-Trypsin vào ủ 37 oC ñến ñể tế bào bong khỏi bề mặt ni cấy Có thể vỗ nhẹ chai ni cấy để tế bào bong Hút toàn dung dịch tế bào sang ống ly tâm 50 ml thêm vào ml môi trường tăng trưởng (huyết môi trường tăng trưởng vô hoạt trypsin) Ly tâm 2000g Hút bỏ phần dịch Hoà phần tế bào lắng cặn với môi trường tăng trưởng (10 ml) Trộn ñều cách dùng pipet hút lên hút xuống Chia ñều dung dịch tế bào sang chai ni cấy có chứa mơi trường tăng trưởng Ủ 37 OC, từ ngày ñến ngày Theo dói tế bào phát triển hàng ngày kiểm tra tạp khuẩn Chuyển ñời tế bào theo tỷ lệ 1:5 Lương tế bào từ chai (175 cm2) đạt 100 % diện tích ni cấy, chuyển ñời sang chai (175 cm2) khác 26 TCVN 8400-7:2011 Nếu tế bào phát triển kém, hút bỏ môi trường cũ, rửa thảm tế bào PBS+ (A.10), ñưa môi trường tăng trưởng vào B.3 Đông lạnh tế bào Hút bỏ môi trường cũ, cho 50 ml dung dịch PBS- (A.9) vào ñể rửa lớp tế bào sau ñó hút bỏ dung dịch PBS- (A.9) Cho 20 ml dung dịch Versene-Trypsin vào ủ 37 OC 2-5 ñể tế bào bong khỏi bề mặt ni cấy Có thể vỗ nhẹ chai ni cấy để tế bào bong Hút toàn dung dịch tế bào sang ống ly tâm thích hợp Ly tâm 2000g Bỏ phần dịch nổi, hoà phần tế bào lắng cặn ml môi trường huyết (Glasgow Eagle’s) dùng pipet trộn cách hút lên, hút xuống Cho ml chất bảo vệ đơng lạnh (90 % huyết bò + 10 % DMSO) trộn ñều nhẹ ñể tránh bọt Chuyển ml dung dịch tế bào vào ống đơng lạnh (4,5 ml) Bọc ống đơng lạnh bơng giấy vệ sinh để làm chậm q trình đơng lạnh Đặt ống đơng lạnh vào nhiệt độ -50 oC đến -90 oC qua đêm, sau chuyển vào giữ nitơ lỏng B.4 Khôi phục tế bào Lấy ống tế bào đơng lạnh nitơ lỏng đặt vào nước ấm 35 oC ñến 39 oC cho ñến rã đơng hồn tồn Trong tế bào rã ñông, chuẩn bị chai nuôi cấy với môi trường tăng trưởng (DMEM Modified + Hepes + 10 % huyết thai bê + kháng sinh) Đảo ngược ống đơng lạnh từ lần ñến lần, dùng pipet hút dung dịch tế bào sang ống thích hợp trộn ñều cách hút lên, hút xuống ñể tránh bọt Chuyển tế bào vào chai ni cấy có mơi trường tăng trưởng, ủ 35 oC ñến 39 oC qua ñêm Vào buổi sáng ngày hôm sau, thay môi trường tăng trưởng ñể loại bỏ DMSO: rửa lớp tế bào PBS+ (A.10), cho môi trường tăng trưởng vào, ủ 35 oC ñến 39 oC ñể tế bào phát triển 27 TCVN 8400-7:2011 Phụ lục C (Quy ñịnh) Sơ ñồ ñĩa chuẩn ñộ vi rút ñánh dấu đĩa làm phản ứng trung hòa huyết C.1 Sơ ñồ ñĩa chuẩn ñộ vi rút W/V -1 -2 10 -3 10 -4 10 -5 10 10 -6 -7 10 -8 10 Đối chứng tế bào 10 10 11 12 A B 200 µl dịch vi rút + 80 µl tế bào C 200 µl DMEM + 80 µl tế bào D E F G H C.2 Sơ ñồ ñánh dấu đĩa làm phản ứng trung hòa huyết Kiểm tra chuẩn ñộ vi rút Huyết kiểm tra Mẫu 1:5 1:10 1:20 1:40 1:80 1:160 TCID50 -1 -2 -3 10 10 10 10 11 12 A B Mẫu C D Mẫu E ĐC (+) ĐC (-) F Mẫu G H Hàng ñối chứng tế bào 28 -4 10 TCVN 8400-7:2011 Thư mục tài liệu tham khảo [1] Babiuk, S., Bowden, T.R., Boyle, D.B., Wallace, D.B and Kitching, R.P (2008) Capripoxviruses: An emerging worldwide threat to sheep, goats and cattle Transboundry and Emerging Diseases, 55, 263-272 [2] Babiuk, S., Bowden, T.R., Parkyn, G., Dalman, B., Hoa, D.M., Long, N.Y., Vu, P.P., Bieu, D.X., Copps, J and Boyle, D.B (2009) Yemen and Vietnam capripoxviruses demonstrate a distinct host preference for goats compared with sheep Journal of General Viro, 90, 105-114 [3] Balamurugan, V., Danappa Jayappa, K., Hosamani, M., Bhanuprakash, V.Venkatesan, G and Singh, R.K (2009) Comparative efficacy of conventional and TaqMan polymerase chain reaction assays in the detection of capripoxviruses from clinical samples Journal of Veterinary Diagnostic Investigation, 21, 225-231 [4] Fulzule, S., Singh, R.K., Hosamani, M., Mondal, B and Yadav, M.P (2006) Evaluation of Duplex PCR and PCR-RFLP for diagnosis of sheep pox and goat pox International of Journal of Tropica lMedicine, 1, 66-70 [5] Ireland, D C & Binepal, Y S (1998) Improved detection of capripoxvirus in biopsy samples by PCR Journal of Virological Methods, 74, 1-7 [6] O.I.E (2008b) Classical Swine fever (hog cholera) In Manual of Diagnostic Tests and Vaccines for Terrestrial Animals (pp 1092-1106) [7] O.I.E (2008a) Sheep Pox and Goat Pox In Manual of Diagnostic Tests and Vaccines for Terrestrial Animals (pp 1058-1067) [8] Phạm Thành Long, Phương Song Liên, Nguyễn Văn Cảm, Nguyễn Trọng Cường, Nguyễn Thu Hà (2006b) Kết chẩn đốn bệnh Đậu Dê từ ổ dịch Việt Nam Tạp chí Khoa học Kỹ thuật thú y, 2, 63-66 [9] Phạm Thành Long, Tô Long Thành, Nguyễn Thu Hà (2006a) Bệnh ñậu cừu ñậu dê Tạp chí Khoa học kỹ thuật thú y, 5, 83-87 [10] Rao, T.V.S., Poonam Malik, S., Nandi, B.S., Negi (1997) Evaluation of immunocapture ELISA for diagnosis of goat pox Acta virologica, 41, 345-348 [11] Carn M Vanessa (1995) An antigen trapping ELISA for the detection of capripoxvirus in tissue culture supernatant and biopsy samples Journal of Virology Methods, 5, 95-102 _ 29 ... chuẩn Đo lường Chất lượng thẩm định, Bộ Khoa học Cơng nghệ cơng bố TCVN 8400-7:2011 TCVN 8400-7:2011 TIÊU CHUẨN QUỐC GIA TCVN 8400-7:2011 Bệnh động vật – Quy trình chẩn ñoán – Phần 7: Bệnh ñậu.. .TCVN 8400-7:2011 Lời nói đầu TCVN 8400-7:2011 Cục Thú y biên soạn, Bộ Nông nghiệp Phát triển nông thơn đề nghị, Tổng cục Tiêu chuẩn Đo lường Chất lượng thẩm định,... dụng tiêu chuẩn liên quan đến vật liệu, thiết bị thao tác gây nguy hiểm Tiêu chuẩn khơng thể đưa hết tất vấn đề an tồn liên quan đến việc sử dụng chúng Các phòng thí nghiệm sử dụng tiêu chuẩn