Tiêu chuẩn Quốc gia TCVN 8400-15:2011. Tiêu chuẩn về Bệnh động vật – quy trình chẩn đoán – phần 15: bệnh xoắn khuẩn do leptospira. Tiêu chuẩn này quy định quy trình chẩn đoán bệnh xoắn khuẩn đối với gia súc. Mời các bạn tham khảo.
TCVN TIÊU CHUẨN QUỐC GIA TCVN 8400-15:2011 Xuất lần BỆNH ĐỘNG VẬT – QUY TRÌNH CHẨN ĐỐN – PHẦN 15: BỆNH XOẮN KHUẨN DO LEPTOSPIRA Animal disease – Diagnostic procedure – Part 15: Leptospirosis HÀ NỘI – 2011 TCVN 8400-15:2011 Lời nói đầu TCVN 8400-15:2011 chuyển đổi từ 10 TCN 872:2006 thành tiêu chuẩn quốc gia theo quy ñịnh khoản Điều 69 Luật Tiêu chuẩn Quy chuẩn kỹ thuật ñiểm a khoản Điều Nghị ñịnh số 127/2007/NĐ-CP ngày 01/8/2007 Chính phủ quy định chi tiết thi hành số ñiều Luật Tiêu chuẩn Quy chuẩn kỹ thuật; TCVN 8400-15:2011 Cục Thú y biên soạn, Bộ Nông nghiệp Phát triển nơng thơn đề nghị, Tổng cục Tiêu chuẩn Đo lường Chất lượng thẩm ñịnh, Bộ Khoa học Công nghệ công bố TCVN 8400-15:2011 TCVN 8400-15:2011 TIÊU CHUẨN QUỐC GIA TCVN 8400-15:2011 Bệnh ñộng vật – Quy trình chẩn đốn – Phần 15: Bệnh xoắn khuẩn Leptospira Animal disease – Diagnostic procedure – Part 15: Leptospirosis CẢNH BÁO – Việc áp dụng tiêu chuẩn liên quan đến vật liệu, thiết bị thao tác gây nguy hiểm Tiêu chuẩn khơng thể đưa hết tất vấn đề an tồn liên quan đến việc sử dụng chúng Các phịng thí nghiệm sử dụng tiêu chuẩn phải tự thiết lập nguyên tắc bảo ñảm an tồn sinh học để khơng phải bị nhiễm bệnh nghề nghiệp thất mầm bệnh từ phịng thí nghiệm mơi trường Phạm vi áp dụng Tiêu chuẩn quy định quy trình chẩn đốn bệnh xoắn khuẩn ñối với gia súc Thuật ngữ ñịnh nghĩa Trong tiêu chuẩn sử dụng thuật ngữ ñịnh nghĩa sau: Bệnh xoắn khuẩn leptospira (leptospirosis disease) Bệnh chủng xoắn khuẩn Leptospira thuộc loại vi khuẩn hiếu khí gây người gia súc, gây sốt, vàng da, ñái huyết sắc tố hay máu, viêm gan thận, rối loạn tiêu hóa sảy thai Gia súc (lợn) bị bệnh nặng mổ có mùi khét Thuốc thử vật liệu thử Chỉ sử dụng thuốc thử loại tinh khiết phân tích sử dụng nước cất nước khử khống nước có độ tinh khiết tương đương khơng có Rnase, trừ có quy định khác - Cồn 96 o TCVN 8400-15:2011 - Bovine albumin serum (BSA) - Thạch - Kháng nguyên Leptospira (15 chủng – Phụ lục B) Thiết bị dụng cụ Sử dụng thiết bị, dụng cụ phòng thử nghiệm thơng thường cụ thể sau: - Kính hiển vi đen, vật kính 10 20 - Tủ lạnh thường, tủ ấm, tủ sấy - Nồi chưng cách thuỷ, nồi hấp tiệt trùng - Máy bút ño pH - Buồng cấy vô trùng - Máy cất nước - Micropipet, thể tích hút từ 10 µl 1000 µl - Bình nón loại, ống đong hình trụ loại - Lam kính, lamen, khay để lam kính - Que trộn, đèn cồn, bút chì viết kính - Ống nghiệm loại, giá ñể ống nghiệm - Màng lọc milipore 0,22 µm Cách tiến hành 5.1 Chẩn đốn lâm sàng 5.1.1 Đặc điểm dịch tễ Bệnh thường xảy vào mùa mưa, lũ lụt Các loài gậm nhấm thú hoang ñược coi nguồn mang bệnh chủ yếu TCVN 8400-15:2011 Đường xâm nhập vi khuẩn chủ yếu qua đường tiêu hóa, gia súc ăn phải thức ăn nước uống nhiễm nước tiểu gia súc mang mầm bệnh nhiễm nước tiểu loài gậm nhấm, lây nhiễm với gia súc ni nhà (chó) 5.1.2 Triệu chứng lâm sàng 5.1.2.1 Thể cấp tính 5.1.2.1.1 Trâu bị, dê, cừu - Sốt kéo dài từ ngày ñến ngày, mệt mỏi, bỏ ăn - Vàng da - Chảy nước mắt - Gia súc cho sữa sữa đột ngột có tượng viêm vú - Mủ chảy từ khoang mũi (dê, cừu) - Thiếu máu ñái huyết sắc tố, đặc biệt gia súc non 5.1.2.1.2 Chó - Sốt từ 40 0C ñến 41 0C, trước chó chết thân nhiệt hạ xuống 36 0C đến 36,5 0C - Ủ rũ, nôn mửa, run rẩy, viêm não, tiêu chảy, phân có lẫn máu - Vàng da nặng, niêm mạc xuất huyết - Bệnh kéo dài từ ngày đến12 ngày - Tỷ lệ chết lên tới 50 % 5.1.2.1.3 Lợn - Sốt, bỏ ăn bất thường ăn ít, mệt mỏi, thích nằm xó chuồng - Phù nề, đầu to, mắt híp - Tiếng kêu yếu, khản đặc hay hẳn, lơng dựng - Nước tiểu vàng, sánh, có màu cà phê - Niêm mạc da vàng, lợn bị bệnh nặng da tồn thân có màu vàng TCVN 8400-15:2011 - Mắt đau có dử, có mù mắt - Lợn nái có chửa: sảy thai hàng loạt, đẻ lợn gầy còm, ốm yếu - Lợn nái sau sảy thai từ tuần ñến tuần thường chịu đực mà khơng có biểu chung ñộng dục 5.1.2.2 Thể mãn tính - Gia súc sốt nhẹ từ 39 0C ñến 39,5 0C - Gia súc có chửa có tượng: sảy thai, đẻ non, bất dục; sinh non đẻ yếu - Gia súc đực có tượng: viêm khớp, sưng dịch hồn, tinh dịch lỗng, tỷ lệ tinh trùng dị hình cao 5.1.3 Bệnh tích đại thể Tùy loài gia súc diễn biến bệnh thể lâm sàng khác nhau, nói chung lồi có biểu vàng da Gia súc (lợn) bị bệnh nặng mổ có mùi khét; tổ chức liên kết da vàng, keo nhầy thủy thũng, mỡ vàng, dịch xoang ngực xoang bụng vàng, máu loãng, xuất huyết da nhiều, xuất huyết niêm mạc ruột, phổi, tim, thận lách Nhìn chung lồi gia súc có bệnh tích sau : - Phổi thủy thũng, phế quản phế nang có tích nhiều nước màu vàng - Mỡ vành tim vàng - Bàng quang căng, niêm mạc xuất huyết nặng, chứa ñầy nước tiểu màu vàng, đỏ đỏ xẫm Cũng có bàng quang xẹp, không chứa nước tiểu - Gan sưng, vàng, nát - Túi mật phần lớn teo, dịch mật sánh lại kẹo mạch nha Cũng có trường hợp túi mật căng - Hạch lâm ba ruột sưng, thủy thũng Bệnh nặng màng treo ruột thối hóa biến thành tổ chức nhầy có màu vàng - Thận nhạt màu có màu vàng lẫn xẫm, có ñiểm hoại tử trắng ñiểm xuất huyết nhỏ bề mặt thận - Bào thai bị sảy có điểm hoại tử đầu đinh ghim gan, dịch thể có màu vàng 5.1.4 Chẩn đốn phân biệt - Bệnh sảy thai truyền nhiễm TCVN 8400-15:2011 - Bệnh nhiễm parvovirus - Bệnh giả dại (bệnh Aujeszky) - Bệnh dịch tả lợn - Hội chứng ngộ ñộc Aflatoxin 5.2 Lấy mẫu bảo quản mẫu 5.2.1 Lấy mẫu 5.2.1.1 Gia súc chết Mổ lấy máu tim, thai, nước tiểu bàng quang, thận, hạch lâm ba Các tổ chức ñược lấy cách vô trùng không lấy sau gia súc chết từ h ñến h 5.2.1.2 Gia súc sống Máu: lấy máu tĩnh mạch lấy vào buổi sáng trước cho gia súc ăn Nước tiểu: lấy giai ñoạn hết sốt 5.2.2 Bảo quản vận chuyển Mẫu huyết gửi ñi xét nghiệm phải ñược bảo quản thùng lạnh nhiệt ñộ 0C vận chuyển đến phịng thí nghiệm nhanh tốt Bệnh phẩm phủ tạng, máu nước tiểu để ni cấy phân lập phải bảo quản môi trường vận chuyển Tốt vận chuyển ngày lấy mẫu Gửi kèm theo biên mổ khám (nếu có) 5.3 Chẩn đốn phịng thí nghiệm 5.3.1 Chẩn đốn huyết học 5.3.1.1 Ngun tắc Phản ứng huyết học dùng chẩn đốn bệnh xoắn khuẩn phản ứng ngưng kết phiến kính (phản ứng MAT – Microscopic Agglutination Test) với kháng nguyên sống gồm 15 chủng xoắn khuẩn lưu hành Việt Nam 5.3.1.2 Chuẩn bị TCVN 8400-15:2011 Kháng nguyên chuẩn, kháng huyết chuẩn, huyết kiểm tra dung dịch muối ñệm phosphat phải ñể nhiệt ñộ phòng khoảng h trước làm phản ứng 5.3.1.3 Cách tiến hành Bước 1: Cho 4,90 ml (4900 µl) dung dịch muối ñệm phosphat (PBS) vào ống nghiệm vơ trùng Bước 2: Cho 0,10 ml (100 µl) huyết cần kiểm tra vào trộn ñều, ñược dung dịch pha loãng 1/50 Bước 3: Mỗi mẫu sử dụng lam kính (được lau đốt lửa đèn cồn), dùng bút chì viết kính chia lam kính thành Bước 4: Nhỏ vào giọt huyết pha lỗng 1/50 (tương đương với 0,03 ml hay 30 µl) Bước 5: Nhỏ giọt kháng nguyên vào ô tương ứng theo trình tự từ chủng số tới chủng số 15 trộn ñều Bước 6: Để 30 nhiệt độ phịng Bước 7: Đọc kết tuỳ mức ñộ ngưng kết kháng nguyên kháng thể mà ñánh giá phản ứng +, ++, +++ hay ++++ - Phản ứng ñược ñánh giá dương tính hiệu giá pha lỗng 1/100 lớn hơn, mẫu huyết có chứa lượng kháng thể gây ngưng kết 50 % xoắn khuẩn (phản ứng mức ++) - Nếu phản ứng mức +++ hay ++++, ta phải nâng hiệu giá pha lỗng mẫu hiệu giá pha loãng 1/100 1/12 800 - Ở nồng độ huyết pha lỗng gây ngưng kết 50 % xoắn khuẩn ta kết luận mẫu huyết kiểm tra cho kết dương tính hiệu giá - Phản ứng âm tính phản ứng mà xoắn khuẩn hoạt động bình thường, có nhiều cụm ngưng kết 50 % xoắn khuẩn ngưng kết 5.3.1.4 Đánh giá kết ++++: Có 30 cụm ngưng kết hình vi trường, 100 % xoắn khuẩn ngưng kết khơng cịn xoắn khuẩn tự +++: Có từ 20 cụm đến 30 cụm ngưng kết hình vi trường, 75 % xoắn khuẩn ngưng kết 25 % xoắn khuẩn tự 10 TCVN 8400-15:2011 ++: Có từ cụm đến 12 cụm ngưng kết, 50 % xoắn khuẩn ngưng kết 50 % xoắn khuẩn tự +: Có từ cụm đến cụm ngưng kết, nhiều xoắn khuẩn tự do, 25 % xoắn khuẩn ngưng kết 75 % xoắn khuẩn tự Phản ứng (-): Khơng có ngưng kết, 100 % xoắn khuẩn tự CHÚ Ý: Có mẫu đối chứng âm (dùng dung dịch muối ñệm phosphat) mẫu ñối chứng dương (dùng kháng huyết chuẩn) 5.3.2 Chẩn đốn vi khuẩn học 5.3.2.1 Kiểm tra hình thái học Mẫu máu: trộn với % chất chống đơng (natri xitrat), ñể lắng dùng pipet hút lớp dịch nhỏ lên phiến kính kiểm tra soi kính hiển vi tụ quang đen Đối với mẫu nước tiểu: lấy cặn phía đáy ống nghiệm phết kính, soi kính hiển vi tụ quang đen tìm xoắn khuẩn Mẫu phải xem khơng ñể 12 h Đối với mẫu phủ tạng gan, lách, thận không nên lấy sau gia súc chết từ h ñến h Nghiền phủ tạng với nước sinh lý theo tỷ lệ 1/10, ñem li tâm lấy phần soi tươi Quan sát kính hiển vi tụ quang đen thấy: xoắn khuẩn vận ñộng 5.3.2.1 Phân lập vi khuẩn 5.3.2.1.1 Cấy chuyển môi trường Máu nước tiểu, tổ chức (sau nghiền li tâm) ni cấy môi trường vận chuyển (A.3) môi trường lỏng EMJH (A.1), môi trường bán cố thể Fletcher (A.2) 28 0C ñến 30 0C Cấy chuyển liên tục hàng ngày kiểm tra kính hiển vi vịng từ tuần ñến tuần 5.3.2.1.2 Tiêm truyền ñộng vật thí nghiệm Nếu có xoắn khuẩn mọc mơi trường ni cấy, mật độ canh trùng đạt x 108 ñược tiêm truyền cho chuột lang, sau lấy máu tim chuột lang ni cấy lại vào mơi trường để lọc tạp khuẩn khiết, sau tháng, khơng thấy xoắn khuẩn mọc ta loại bỏ Một phần mẫu bệnh phẩm ñem nghiền với nước sinh lý theo tỷ lệ 1/10, lấy huyễn dịch tiêm cho chuột lang ml/con Sau 1, 2, 6, 12, 24 h, lấy máu cấy vào môi trường EMJH 11 TCVN 8400-15:2011 5.3.2.1.3 Định typ huyết Sau ñã phân lập ñược xoắn khuẩn tiến hành ñịnh typ, quy trình ñịnh typ ñược tiến hành phản ứng ngưng kết phiến kính với 15 mẫu kháng huyết đơn giá dương tính chuẩn 15 chủng Mẫu kháng huyết cho phản ứng ngưng kết mạnh chủng xoắn khuẩn thuộc vào nhóm Cịn mẫu kháng huyết mà cho phản ứng ngưng kết yếu tượng ngưng kết chéo chủng với kháng huyết chuẩn chủng khác Kết luận bệnh Kết hợp triệu chứng lâm sàng, bệnh tích mẫu bệnh phẩm sau tiến hành phân lập ñịnh typ, xác định chủng xoắn khuẩn gây bệnh kết luận dương tính Đối với đàn chưa tiêm phịng: kết xét nghiệm huyết phản ứng ngưng kết kháng nguyên kháng thể ñạt 50 % hiệu giá pha lỗng huyết 1/100 trở lên kết luận dương tính Đối gia súc tiêm phịng: - Mẫu huyết cho phản ứng ngưng kết kháng nguyên kháng thể ñạt 50 % hiệu giá pha lỗng huyết 1/200 trở lên kết luận dương tính - Mẫu huyết cho phản ứng ngưng kết kháng nguyên kháng thể ñạt 50 % hiệu giá pha lỗng huyết 1/100, có triệu chứng lâm sàng bệnh tích điển hình bệnh kết luận dương tính 12 TCVN 8400-15:2011 Phụ lục A (Quy định) Thành phần chuẩn bị mơi trường dung dịch thuốc thử A.1 Môi trường lỏng EMJH (Ellinghausen McCullough; Johnson Harris) Môi trường EMJH Bacto - Leptospira có bổ sung Enrichment Bacto - Leptospira dùng để ni cấy giữ giống xoắn khuẩn Mơi trường Enrichment chuẩn bị theo công thức chế tạo Ellinghausen McCullough ñược sửa ñổi Johnson Harris Thành phần môi trường bản: Dinatri hydrophosphat (Na2HPO4) 1g Kali dihydrophosphat (K2HPO4) 0,3 g Natri clorua (NaCl) 1g NH4Cl 0,25 g Vitamin B1 0,5 g Hồ tan 2,3 g mơi trường vào 900 ml nước Hấp vô trùng 121 oC 15 Sau để nguội nhiệt độ phịng, bổ sung thêm dung dịch Enrichment (900 ml môi trường EMJH + 100 ml dung dịch Enrichment) Trộn ñều, ñiều chỉnh pH 7,5 dung dịch NaOH N dung dịch HCl N Đem chia ống nhỏ ñể nhiệt ñộ phịng kiểm tra vơ trùng Chuẩn bị dung dịch Enrichment: Dung dịch 1: FeSO4.7H2O 5g Nước vừa ñủ 1000 ml CaCl2.2H2O 20 g MgCl2.6H2O 20 g Dung dịch 2: 13 TCVN 8400-15:2011 Nước vừa ñủ 1000 ml Vitamin B12 0,2 g Nước vừa ñủ 1000 ml Dung dịch 3: Dung dịch 4: Hoà tan 200 ml Tween 80 vào 1000 ml nước Dung dịch 5: ZnSO4.7H2O 4g Nước vừa ñủ 1000 ml Vitamin B1 10 g Nước vừa ñủ 1000 ml Dung dịch 6: Dung dịch 7: 10 g bột Bovine albumin serum (BSA) hòa tan 66 ml nước, cho vào máy khuấy từ khuấy ñều cho tan nhiệt ñộ oC Lần lượt cho dung dịch với số lượng sau: 10 ml dung dịch 1; ml dung dịch 2; ml dung dịch 3; 6,25 ml dung dịch 4; ml dung dịch 5; 0,5 ml dung dịch 6; dung dịch 7, cho nước vừa ñủ tới 100 ml Lắc ñều ñem lọc qua màng lọc millipore A.2 Môi trường bán cố thể Fletcher Cho g thạch vào 900 ml mơi trường EMJH bản, đem hấp 121 0C 20 cho thạch tan hồn tồn, để nguội xuống 50 0C, cho 100 ml Enrichment vào lắc ñều, chỉnh pH 7,5 chia ống nghiệm, ống khoảng ml Tất thao tác pha chế chia ống mơi trường phải tiến hành buồng cấy vô trùng 14 TCVN 8400-15:2011 A.3 Môi trường vận chuyển, pH 7,6 Pha Bovine Albumine Serum (BSA) với dung dịch PBS (A.4) thành dung dịch BSA % Bổ sung 5-Fluoro-uracil với lượng từ 100 µg đến 200 µg cho mililit mơi trường A.4 Dung dịch muối ñệm phosphat (PBS) A.4.1 Dung dịch ñậm ñặc 10 lần: Na2HPO4 khan 12,36 g NaH2PO4.H2O 1,80 g NaCl 85,00 g Nước vừa ñủ 1000 ml A.4.2 Dung dịch dùng phản ứng ngưng kết phiến kính PBS 0,01 M, pH 7,6 Dung dịch ñậm ñặc (A.4.1) 100 ml Nước vừa ñủ 1000 ml 15 TCVN 8400-15:2011 Phụ lục B (Quy ñịnh) Bộ kháng nguyên dùng ñể chẩn đốn bệnh xoắn khuẩn Leptospira Leptospira australis australis Ballico L autumnalis autumnaliss Akiyami A L bataviae bataviae Van Tienen L canicola canicola Hond Utrech IV L gippotyphosa gippotyphosa Moskva V L hebdomadis hebdomadis Hebdomadis L icterohaemorrhagiae icterohaemorrhagiae Verdun L javanica javanica Veldrat Bataviae 46 L panama panama 10 L pomona pomona Pomona 11 L pyrogenes 12 L sejroe-hardjo Hardjo Bovis 13 L sejroe saxkoebing 14 L semaranga 15 L tarassovi tarassovi Mitis Johnson 16 TCVN 8400-15:2011 Thư mục tài liệu tham khảo [1] WHO, 1986, Guidelines for the control of Leptospirosis [2] OIE, 1992, Manual of Diagnostic Tests and Vaccines for Terrestrial Animals [3] OIE, 2009, Leptospirosis [4] JICA, 2002, Cẩm nang chẩn đốn tiêu chẩn bệnh gia súc Việt Nam _ 17 .. .TCVN 8400-15:2011 Lời nói đầu TCVN 8400-15:2011 chuyển đổi từ 10 TCN 872:2006 thành tiêu chuẩn quốc gia theo quy ñịnh khoản Điều 69 Luật Tiêu chuẩn Quy chuẩn kỹ thuật ñiểm... chuẩn Đo lường Chất lượng thẩm ñịnh, Bộ Khoa học Công nghệ công bố TCVN 8400-15:2011 TCVN 8400-15:2011 TIÊU CHUẨN QUỐC GIA TCVN 8400-15:2011 Bệnh ñộng vật – Quy trình chẩn đốn – Phần 15: Bệnh xoắn... chi tiết thi hành số ñiều Luật Tiêu chuẩn Quy chuẩn kỹ thuật; TCVN 8400-15:2011 Cục Thú y biên soạn, Bộ Nông nghiệp Phát triển nơng thơn đề nghị, Tổng cục Tiêu chuẩn Đo lường Chất lượng thẩm