Tiêu chuẩn Quốc gia TCVN 8160-5:2010 quy định phương pháp enzym để xác định hàm lượng nitrat trong thực phẩm có chứa rau dành cho trẻ sơ sinh và trẻ nhỏ. Phương pháp này có thể dùng để xác định hàm lượng nitrat trong dải nồng độ từ 50 mg/kg đến 200 mg/kg.
TIÊU CHUẨN QUỐC GIA TCVN 8160-5:2010 EN 12014-5:1997 THỰC PHẨM - XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG NITRAT VÀ/HOẶC NITRIT - PHẦN 5: XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG NITRAT TRONG THỰC PHẨM CHỨA RAU DÀNH CHO TRẺ SƠ SINH VÀ TRẺ NHỎ BẰNG PHƯƠNG PHÁP ENZYM Foodstuffs - Determination of nitrate and/or nitrite content - Part 5: Enzymatic determination of nitrate content of vegetable-containing food for babies and intants Lời nói đầu TCVN 8160-5:2010 hoàn toàn tương đương với EN 12014-5:1997; TCVN 8160-5:2010 Ban kỹ thuật tiêu chuẩn quốc gia TCVN/TC/F13 Phương pháp phân tích lấy mẫu biên soạn, Tổng cục Tiêu chuẩn Đo lường Chất lượng đề nghị, Bộ Khoa học Công nghệ công bố Bộ TCVN Thực phẩm - Xác định hàm lượng nitrat và/hoặc nitrit bao gồm phần sau: - TCVN 7814:2007 (EN 12014-2:1997), Thực phẩm - Xác định hàm lượng nitrat và/hoặc nitrit Xác định hàm lượng nitrat rau sản phẩm rau sắc ký lỏng hiệu cao/trao đổi ion; - TCVN 8160-3:2010 (EN 12014-3:2005), Thực phẩm - Xác định hàm lượng nitrat và/hoặc nitrit Phần 3: Xác định hàm lượng nitrat nitrit sản phẩm thịt đo phổ sau khử nitrat thành nitrit enzym; - TCVN 8160-4:2009 (EN 12014-4:2005), Thực phẩm - Xác định hàm lượng nitrat và/hoặc nitrit Phần 4: Phương pháp xác định hàm lượng nitrat nitrit sản phẩm thịt sắc ký trao đổi ion; - TCVN 8160-5:2010 (EN 12014-5:1997), Thực phẩm - Xác định hàm lượng nitrat và/hoặc nitrit Phần 5: Xác định hàm lượng nitrat thực phẩm chứa rau dành cho trẻ sơ sinh trẻ nhỏ phương pháp enzym; - TCVN 8160-7:2010 (EN 12014-7:1998), Thực phẩm - Xác định hàm lượng nitrat và/hoặc nitrit Phần 4: Xác định hàm lượng nitrat rau sản phẩm rau phương pháp phân tích dòng liên tục sau khử cadimi Bộ tiêu chuẩn EN 12014 có phần sau: - EN 12014-1, Foodstuffs - Determination of nitrate and/or nitrite content - Part 1: General considerations (Thực phẩm - Xác định hàm lượng nitrat và/hoặc nitrit - Phần 1: Xem xét chung) THỰC PHẨM - XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG NITRAT VÀ/HOẶC NITRIT - PHẦN 5: XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG NITRAT TRONG THỰC PHẨM CHỨA RAU DÀNH CHO TRẺ SƠ SINH VÀ TRẺ NHỎ BẰNG PHƯƠNG PHÁP ENZYM Foodstuffs - Determination of nitrate and/or nitrite content - Part 5: Enzymatic determination of nitrate content of vegetable-containing food for babies and intants Phạm vi áp dụng Tiêu chuẩn quy định phương pháp enzym để xác định hàm lượng nitrat thực phẩm có chứa rau dành cho trẻ sơ sinh trẻ nhỏ [1], [2] Phương pháp dùng để xác định hàm lượng nitrat dải nồng độ từ 50 mg/kg đến 200 mg/kg Tài liệu viện dẫn Các tài liệu viện dẫn sau cần thiết cho việc áp dụng tiêu chuẩn Đối với tài liệu viện dẫn ghi năm công bố áp dụng phiên nêu Đối với tài liệu viện dẫn không ghi năm công bố áp dụng phiên nhất, bao gồm sửa đổi, bổ sung (nếu có) TCVN 4851 (ISO 3696), Nước dùng để phân tích phòng thí nghiệm - Yêu cầu kỹ thuật phương pháp thử EN 12014-1, Foodstuffs - Determination of nitrate and/or nitrite content - Part 1: General considerations (Thực phẩm - Xác định hàm lượng nitrat và/hoặc nitrit - Phần 1: Xem xét chung) Nguyên tắc Hàm lượng nitrat dịch chiết mẫu xác định phương pháp enzym cách đo lượng NADPH sử dụng hết theo phương trình phản ứng đây: Nitrat + NADPH + H + nitrit + NADP+ + H2O lượng NADPH sử dụng hết tương đương với lượng nitrat Thuốc thử Các thuốc thử sử dụng phải loại tinh khiết phân tích nước sử dụng phải loại TCVN 4851 (ISO 3696), trừ có quy định khác Khi chuẩn bị dung dịch, phải tính đến độ tinh khiết thuốc thử 4.1 Dung dịch Carrez số Hòa tan 150 g kali hexaxyanoferat (II) (K4[Fe(CN)6].3H2O) nước pha loãng nước đến 000 ml Bảo quản dung dịch chai màu nâu sau hai tháng lại thay dung dịch 4.2 Dung dịch Carrez số Hòa tan nước 300 g kẽm sulfat (ZnSO4.7H2O) thêm nước đến 000 ml 4.3 Dung dịch natri hydroxit, c1) (NaOH) = mol/l 4.4 Dung dịch đệm imidazol, pH = 7,3 Hòa tan 0,68 g imidazol (C3H4N2) 80 ml nước, chỉnh pH đến 7,3 dung dịch axit clohydric mol/l pha loãng nước đến 100 ml Nếu bảo quản °C dung dịch bền năm 4.5 Dung dịch FAD2) Chuẩn bị dung dịch 0,17 mg muối dinatri flavin adenine dinucleotide, FAD-Na mililit cách sử dụng FAD-Na2 có hàm lượng khơng nhỏ 88 % Khi bảo quản °C dung dịch bền ngày 4.6 Dung dịch NADPH2) Chuẩn bị dung dịch 5,6 mg muối tetranatri -nicotinamide adenine dinucleotide phosphat dạng khử, -NADPH-Na4 mililit cách sử dụng -NADPH-Na4 có hàm lượng khơng nhỏ 98 % Nếu bảo quản °C dung dịch bền ngày, để nhiệt độ phòng bền h 4.7 Dung dịch enzym khử nitrat (nitrat reductaza)2) Hòa tan 65 mg nitrat reductaza làm đông khô, có hoạt độ khoảng 0,4 U/mg3) thu từ loài Aspergillus (EC 1.6.6.2) [4] ml nước Khi bảo quản °C dung dịch 1) c nồng độ chất Những thuốc thử có bán sẵn thị trường Khi sử dụng nên theo hướng dẫn nhà sản xuất 2) bền đến hai tuần Thiết bị, dụng cụ Sử dụng thiết bị, dụng cụ phòng thử nghiệm thông thường cụ thể thiết bị, dụng cụ sau: 5.1 Bộ đồng hóa (bộ phân phối, máy trộn dùng điện loại tương tự) Phải đảm bảo thiết bị làm phân tán mẫu đồng hóa kỹ mẫu khơng làm thơi nhiễm kim loại đến mức làm ức chế enzym sử dụng 5.2 Bếp điện với máy khuấy từ 5.3 Giấy lọc gấp nếp 5.4 Pipet chia độ, dùng cho phân tích enzym, phân phối phần 0,05 ml, 0,1 ml, ml ml pipet dạng pittông 5.5 Cuvet thủy tinh cuvet chất dẻo có chiều dài đường quang cm khơng hấp thụ đáng kể bước sóng 334 nm, 340 nm 365 nm 5.6 Máy đo phổ, để đo bước sóng 340 nm, có chiều rộng phổ khơng q ± nm CHÚ THÍCH: Có thể sử dụng máy đo quang có lọc phổ có gắn đèn thủy ngân, đo 365 nm 334 nm 5.7 Máy ly tâm, tạo gia tốc hướng tâm 2900 g đáy ống ly tâm (5.8), tùy chọn 5.8 Máy ly tâm, có dung tích thích hợp 5.9 Tủ lạnh, trì nhiệt độ °C Cách tiến hành 6.1 Chuẩn bị mẫu Đưa mẫu bảo quản lạnh nhiệt độ phòng Trộn tồn mẫu vật chứa máy trộn thích hợp (5.1), nghiền đồng hóa mẫu, cần Đảm bảo nhiệt độ mẫu không 60 °C Đối với mẫu dạng lỏng, pha lỗng mẫu cần phân tích hàm lượng nitrat nằm khoảng từ 30 mg/l đến 300 mg/l, cần Dung dịch mẫu thử thu dùng để phân tích mà khơng cần phải xử lý thêm kể dung dịch có màu, lấy thể tích 0,1 ml (V2) để phân tích 6.2 Phương pháp xác định 6.2.1 Chuẩn bị dung dịch mẫu Cân khoảng g lượng thích hợp khác mẫu chuẩn bị theo 6.1, xác đến miligam cho vào bình nón 100 ml, thêm 50 ml nước sơi Đậy nắp bình mặt kính đồng hồ, đặt bình vào nồi cách thủy (ví dụ: cốc thủy tinh có mỏ) khoảng từ 20 đến 30 min, khuấy để tránh bị vón cục (xem 5.2) Tránh để q nhiệt đáy bình nón cách khơng để đáy bình tiếp xúc với đáy nồi cách thủy Lấy que khuấy từ ra, thêm 5,0 ml dung dịch Carrez số (4.1) lắc hỗn hợp s đến 10 s Sau thêm 5,0 ml dung dịch Carrez số (4.2) lắc lại khoảng từ s đến 10 s Chỉnh pH hỗn hợp đến giá trị từ đến (không để vượt 9) dung dịch natri hydroxit (4.3) lắc lại Làm nguội lượng chứa bình nón đến nhiệt độ phòng lọc cho vào bình định mức 100 ml, thu V1, tráng bình nước thêm nước đến vạch Đơn vị U (là đơn vị quốc tế hay đơn vị chuẩn) xác định lượng enzym xúc tác q trình chuyển hóa mol chất phút điều kiện chuẩn 3) Nếu khối lượng mẫu ban đầu cao, ví dụ 10 g, cần phải ly tâm hỗn hợp mẫu làm 10 2900 g trước lọc sang bình định mức 100 ml Rửa chất lắng hai lần với nước ly tâm lần nữa, thu lấy phần phía vào bình định mức 100 ml pha loãng dung dịch nước đến vạch Lắc bình định mức đặt bình vào tủ lạnh (5.9) nhiệt độ khoảng °C 30 để tách hết chất béo Sau lọc lượng chứa bình qua giấy lọc gấp nếp (5.3), loại bỏ vài mililit dịch lọc Thu lấy phần dịch lọc (dung dịch mẫu) vào bình nón có nút đậy thủy tinh mài Dùng 1,0 ml (V2) dung dịch mẫu để xác định hàm lượng nitrat Dung dịch có màu đục thường khơng gây nhiễu đến phép thử 6.2.2 Đo phản ứng enzym Tiến hành xác định nhiệt độ khoảng 20 °C Độ hấp thụ cực đại NADPH bước sóng 340 nm Nếu sử dụng máy đo phổ (5.6), thực phép đo bước sóng có độ hấp thụ cực đại, sử dụng máy đo quang có lọc phổ dùng đèn thủy ngân đo bước sóng 365 nm 334 nm Sự chênh lệch (giảm) độ hấp thụ dung dịch thử (A1 - A2)dung dịch thử nên nằm khoảng từ 0,1 đến 0,5 Nếu chênh lệch độ hấp thụ q nhỏ tăng lượng dung dịch mẫu cuvet (đến 2,00 ml) Trong trường hợp này, giảm lượng nước sử dụng cho lượng mẫu thử lượng mẫu trắng cuvet Nếu chênh lệch độ hấp thụ lớn, pha loãng dung dịch mẫu Nếu bước cần thiết phải tính đến hệ số pha lỗng (F) phần tính kết Chỉ cần mẫu trắng cho dãy mẫu thử Bảng - Phương án dùng pipet Dung dịch hút pipet cho vào cuvet Mẫu trắng Dung dịch thử Dung dịch đệm (4.4) 1,00 ml 1,00 ml Dung dịch FAD (4.5) 0,05 ml 0,05 ml Dung dịch NADPH (4.6) 0,10 ml 0,10 ml - 1,00 ml 2,00 ml 1,00 ml Dung dịch mẫu (6.2.1) Nước Trộn sau khoảng đo độ hấp thu (A1) không dùng cuvet so sánh (5.5), sau bắt đầu cho phản ứng cách thêm sau: Dung dịch nitrat reductaza (4.7) 0,05 ml 0,05 ml Trộn sau 40 đo nhanh liên tiếp độ hấp thụ (A2) dung dịch, không dùng cuvet so sánh Lặp lại phép đo sau 20 thu độ hấp thụ (A3) Tính kết Trong phản ứng hình thành sở phép xác định đường tuyến tính thể mối quan hệ lượng NADPH sử dụng hết chênh lệch độ hấp thụ với nồng độ nitrat Tính chênh lệch độ hấp thụ mẫu trắng ΔAtrắng theo công thức (1): ΔAmẫu trắng = (A1 - A2)mẫu trắng - 2x (A2 - A3)mẫu trắng (1) Tính chênh lệch độ hấp thụ dung dịch thử ΔAdung dịch thử theo công thức (2): ΔAdung dịch thử = (A1 - A2)dung dịch thử - 2x (A2 - A3)dung dịch thử (2) Tính chênh lệch độ hấp thụ mẫu trắng ΔA cho giá trị trắng theo công thức (3): ΔA = ΔAdung dịch thử - ΔAmẫu trắng (3) Tính nồng độ chất dung dịch pha loãng dùng phép đo hấp thụ quang theo định luật Beer- Lambert Tính phần khối lượng w, nitrat, miligam kilogam mẫu, theo công thức (4): w A M V1 V3 F 1000 V2 m (4) ΔA chênh lệch độ hấp thụ công thức (3); M khối lượng phân tử tương đối ion nitrat (M = 62,0 g/mol); V1 tổng thể tích dung dịch mẫu (6.2.1) (V1 = 100 ml), tính mililit (ml); V2 thể tích dung dịch mẫu dùng để chuẩn bị dung dịch thử (6.2.2) (V2 = 1,0 ml), tính mililit (ml); V3 tổng thể tích dung dịch thử (6.2.2) (V3 = 3,20 ml), tính mililit (ml); F hệ số pha loãng (F = 1); m khối lượng mẫu ban đầu, tính gam (g); độ hấp thụ phân tử NADPH, nghĩa 6,3 x 103 l.mol-1.cm-1 340 nm, 3,5 x 10 3l mol-1.cm-1 365 nm (Hg), 6,18 x 103 l.mol-1.cm-1 334 nm (Hg); chiều dài đường quang cuvet (1 cm), tính centimet (cm) Nếu dùng phương án theo Bảng dung dịch mẫu khơng phải pha lỗng, tính phần khối lượng w nitrat, miligam kilogam mẫu, theo công thức (5): w A 19840000 m (5) đó: ΔA xem công thức (3); m xem công thức (4) Báo cáo kết theo miligam kilogam miligam lít theo số nguyên ghi theo quy định hành Độ chụm Các chi tiết phép thử liên phòng thử nghiệm phương pháp nêu Phụ lục A Các giá trị thu từ phép thử liên phòng thử nghiệm khơng áp dụng cho dải nồng độ chất phân tích chất khác với dải nồng độ chất phân tích chất nêu 8.1 Độ lặp lại Chênh lệch tuyệt đối kết hai phép thử đơn lẻ độc lập, thu vật liệu thử giống hệt nhau, người thực sử dụng thiết bị thực khoảng thời gian ngắn, không % trường hợp vượt giá trị lặp lại r sau đây: Các giá trị là: Sản phẩm rau chân vịt (spinach) x = 64 mg/kg r = 15,5 mg/kg Nước cà rốt x = 200 mg/l r = 12,2 mg/l 8.2 Độ tái lập Chênh lệch tuyệt đối kết hai phép thử đơn lẻ độc lập, thu vật liệu thử giống hệt nhau, hai phòng thử nghiệm khác thực hiện, không % trường hợp vượt giá trị tái lập R sau đây: Các giá trị là: Sản phẩm rau chân vịt (spinach) x = 64 mg/kg R = 24,5 mg/kg Nước cà rốt x = 200mg/l R = 17,7 mg/l Báo cáo thử nghiệm Báo cáo thử nghiệm phải bao gồm thông tin nêu EN 12014-1 Phụ lục A (Tham khảo) Dữ liệu độ chụm Các thông số sau thu hai phép thử liên phòng thử nghiệm [1], [2] phù hợp với ISO 5725:1986 [5]* Các phép thử Max von Pettenkofer-lnstitute thuộc Cơ quan Y tế Liên bang, Cục Hóa chất Thực phẩm, Berlin, Đức thực Bảng A.1 - Dữ liệu độ chụm Rau chân vịt Nước ép cà rốt 1988 1992 Số lượng mẫu 1 Số lượng phòng thử nghiệm 19 Số lượng phòng thử nghiệm lại sau trừ ngoại lệ 16 Số lượng ngoại lệ Số lượng kết chấp nhận 80 35 Giá trị trung bình x 64 mg/kg 200 mg/kg Đô lệch chuẩn lặp lại, sr 5,5 mg/kg mg/l 8,7 % 2,1 % Giới hạn lặp lại, r 15,5 mg/kg 12,2 mg/l Độ lệch chuẩn tái lập, sR 8,7 mg/kg mg/l 13,6% 3,3 % 24,5 mg/kg 17,7 mg/l Năm thử nghiệm Độ lệch chuẩn tương đối lặp lại, RSDr Độ lệch chuẩn tương đối tái lập, RSDR Giới hạn tái lập, R THƯ MỤC TÀI LIỆU THAM KHẢO [1] Untersuchung von Lebensmitteln: Bestimmung von Nitrat in Gemtisesaften: L 26.26-2 1088-06 (Food Analysis: Determination of nitrate in vegetable Juices: L 26.26-21988-05) in: Amtitiche Sammtung von Ihuersuckitnasverfahren nach § 35LMBG: Verfahren zur Probenahme und Untersuchung von lebensmittteln, TaboJcerxeugnissen, hosmetisdien Mittetn und Bedaifsgegensltinden und Bedarfsgegenssundheitsamt (In: Collection of official methods under article 35 of the German Federal Foods Act; Methods of Sampling and analysis of foods, tobacco * ISO 5725:1986 hủy products, cosmetics and commodity goods/Federal Health Office) Losebbiiausgabe, Stand Aug 1993 Bd (Loose leaf edition, as of 1993-08 Vol.1) Berlin, Kohu Beuth Verlag GmbH [2] Untersuchung von Lebensmitteln: Bestimmung von Nitrat in Gemiisebrei fur Saugltnge und Kleinkinder L 48.03.05-11988-05 (Food Analysis Determination of nitrate in mashed vegetables for babies and infants: L 48.03.05-11988-05) in: AmUiche Sommlung von Untersuchungsverfahren nacft § 35LMBG: Verfahren zur Probenahme und IhUersuchung von LebensmiUetn, labakerzeugnissen, kosmeUschen Mitteln und Bed^rfsgegenstanden/Bimdf^tmAd^iisamt (In: Collection of official methods under article 35 of the German Federal Foods Act; Methods of Sampling and analysis of foods, tobacco products, cosmetics and commodity goods/Fedacal Health Office) Loseblattausgabe, Stand Aug 1993 Bd (Loose leaf edition, as of 1993-08 Vol 1.) Berlin, Kola Beuth Verlag GmbH [3] BeuUer, H.-O., Wurst, B., and Fischer, S.,: Eine neue Methode zur enzymatischen Bestimmung von Nitrat in Lebensmitteln (A new method for the enzymatic determination of nitrate in foodstuffs), In: DL Lebensm Bundsch 82,1986, 283-289 [4] Enzyme commission (EQ: Classification System Enzyme Handbook, Springer Berlin 1969 [5] ISO 5725:1986 Precision of test methods - Determination of repeatability and reproducibility for a standard test method by inter-laboratory tests ... 48.03.0 5-1 198 8-0 5) in: AmUiche Sommlung von Untersuchungsverfahren nacft § 35LMBG: Verfahren zur Probenahme und IhUersuchung von LebensmiUetn, labakerzeugnissen, kosmeUschen Mitteln und Bed^rfsgegenstanden/Bimdf^tmAd^iisamt... Juices: L 26.2 6-2 198 8-0 5) in: Amtitiche Sammtung von Ihuersuckitnasverfahren nach § 35LMBG: Verfahren zur Probenahme und Untersuchung von lebensmittteln, TaboJcerxeugnissen, hosmetisdien Mittetn... tích phòng thí nghiệm - u cầu kỹ thuật phương pháp thử EN 1201 4-1 , Foodstuffs - Determination of nitrate and/or nitrite content - Part 1: General considerations (Thực phẩm - Xác định hàm lượng