Nghiên cứu xây dựng phương pháp phát hiện ký sinh trùng trichinella bằng kỹ thuật tiêu cơ

Nghiên cứu này nhằm mục đích xây dựng và đánh giá quy trình phát hiện trichinella trong thịt. Nghiên cứu sử dụng kỹ thuật tiêu cơ bằng pepsin và HCl. Mời các bạn cùng tham khảo chi tiết bài viết.

Y Học TP Hồ Chí Minh * Tập 17 * Phụ Số * 2013 Nghiên cứu Y học NGHIÊN CỨU XÂY DỰNG PHƯƠNG PHÁP PHÁT HIỆN KÝ SINH TRÙNG TRICHINELLA BẰNG KỸ THUẬT TIÊU CƠ Nguyễn Tiến Dũng*, Dương Thị Hân* TÓM TẮT Mục tiêu nghiên cứu: Nghiên cứu nhằm mục đích xây dựng đánh giá quy trình phát Trichinella thịt Phương pháp nghiên cứu: Sử dụng kỹ thuật tiêu pepsin HCl Kết quả: Kết nghiên cứu cho thấy yếu tố pH, nhiệt độ, thời gian nồng độ pepsin dịch thủy phân có ảnh hưởng lớn đến hiệu suất thủy phân khả phát Trichinella Phương pháp phát Trichinella kỹ thuật tiêu xây dựng thành công với đặc điểm kỹ thuật sau: tỉ lệ khối lượng mẫu dịch thủy phân 1:300; pH dịch thủy phân 1,5; nồng độ pepsin dịch thủy phân FIP-U/ml; nhiệt độ cho giai đoạn thủy phân 35oC, thời gian thủy phân khoảng 25 - 30 phút Kết đánh giá hiệu lực cho thấy phương pháp xây dựng có giới hạn phát ấu trùng Trichinella/50g mẫu thịt, độ nhạy 100%, độ đặc hiệu 100%, độ xác 94,4%, tỉ lệ dương tính giả 0%, tỉ lệ âm tính giả 9,1% Kết luận: Phương pháp xây dựng có thơng số kỹ thuật tương đương với phương pháp Trung tâm Ký sinh trùng Bệnh truyền nhiễm qua đường thực phẩm thuộc Cơ quan Thanh tra thực phẩm Canada với độ tin cậy 95% Phương pháp áp dụng phòng kiểm nghiệm an tồn thực phẩm Từ khóa: Ký sinh trùng, pepsin, thịt heo, thủy phân, Trichinella ABSTRACT RESEARCH METHODS OF DETECTION PARASITES TRICHINELLAWITHDIGESTION OF MEAT Nguyen Tien Dung, Duong Thi Han * Y Hoc TP Ho Chi Minh * Vol 17 - Supplement of No - 2013: 145 - 150 Objective: The objective of this study was developing the method for the detection of Trichinella in pork Methods: Digestion of meat by enzyme pepsin and hydrochloric acid Results: The study results show that several factors affect to analysis process such as pH, temperature, time, digestive enzyme concentration affect to analysis process The method for the detection of Trichinella in pork by the digestion principle has been set up successfully The new method have the specifications as follows: The rate of sample volume/hydrolyte volume is 1:300; pH of hydrolyte is 1.5; pepsin concentration in hydrolyte is FIPU/ml; temperature for hydrolysis stage is in 35°C, hydrolysis time is in 25 - 30 minutes The method validation results of the set up method show that the limit of detection are Trichinella larvae/50g, sensitivity is 100%, specificity is 100%, accuracy is 94.1%, false positive rate is 0% and false negative rate is 9.1% Conclusions: The effectiveness of set up method for detection of Trichinella in pork is equivalent to the reference method from Centre for Food-borne and Animal Parasitology of Canadian Food Inspection Agency The similarity of the reference method and the set up method is 95% of confidence This method can be applied at food laboratory to detect Trichinella in meat * Trung tâm Chất lượng Nông lâm thủy sản vùng Tác giả liên lạc: TS Nguyễn Tiến Dũng, ĐT: 0918044558, Email: dungnt.nafi4@mard.gov.vn Chuyên Đề Ký Sinh Trùng 145 Nghiên cứu Y học Y Học TP Hồ Chí Minh * Tập 17 * Phụ Số * 2013 Keywords: Parasite, pepsine, pork, digestion, Trichinella ĐẶT VẤN ĐỀ Trichinella ký sinh trùng gây bệnh cho người động vật Bệnh Trichinellosis Trichinella gây gọi bệnh sán heo ghi nhận động vật nuôi chúng chiếm tỉ lệ lớn heo Tỉ lệ mắc bệnh toàn giới gần 10.000 người/năm, tỉ lệ tử vong khoảng 0,2% Theo thống kê Tổ chức Y tế Thế giới (WHO) thịt heo nguồn chủ yếu lây truyền bệnh Trichinellosis cho người(3) Tại nước Châu Âu, Mỹ, Canada số nước khác yêu cầu phải kiểm tra Trichinella thịt trước đưa thị trường tiêu thụ xuất khẩu(2) Tại Việt Nam, nghiên cứu Trichinella thực phẩm ít, chưa xây dựng phương pháp đủ độ nhạy độ tin cậy để phân tích ký sinh trùng thực phẩm Vì việc nghiên cứu xây dựng qui trình phát Trichinella thực phẩm cần thiết Mục tiêu nghiên cứu Nghiên cứu nhằm xác định yêu cầu kỹ thuật để xây dựng phương pháp phát ký sinh trùng Trichinella thịt kỹ thuật tiêu kết hợp khuấy từ Đánh giá hiệu lực qui trình xây dựng để xác định thông số kỹ thuật phương pháp như: giới hạn phát hiện, độ xác, độ đặc hiệu, độ nhạy, tỉ lệ âm tính giả, tỉ lệ dương tính giả, đồng thời xác định phạm vi điều kiện áp dụng phương pháp ĐỐI TƯỢNG - PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Đối tượng nghiên cứu Dòng ký sinh trùng sử dụng nghiên cứu: Dòng Trichinella spiralis cung cấp Trung tâm Ký sinh trùng động vật Bệnh truyền nhiễm qua đường thực phẩm (Centre for Food-borne and Animal Parasitology), thuộc Cơ quan Thanh tra thực phẩm Canada (Canadian Food Inspection Agency) Ấu trùng T spiralis giữ mẫu thịt viên 146 Mẫu sử dụng nghiên cứu: thịt heo tươi Phương pháp nghiên cứu Chuẩn bị mẫu dịch thủy phân Chuẩn bị dung dịch thủy phân: Dùng HCl 37% để chuẩn bị dung dịch thủy phân có pH 1; 1,25; 1,5; 1,75; Làm nóng dung dịch đến nhiệt độ thủy phân xác định, thêm pepsinvào để nồng độ pepsin dung dịch thủy phânlà 6; 8; 10 FIP-U/ml Chuẩn bị mẫu: Lấy 50g mẫu (hoặc lượng mẫu xác định) cho vào máy xay, xay nhuyễn mẫu 5-10 phút, cần thiết cho dịch thủy phân chuẩn bị vào mẫu để dễ xay nhuyễn Thủy phân mẫu Chuyển mẫu xay nhuyễn vào cốc thủy tinh có dung tích lít chứa hỗn hợp thủy phân (3.2.1) Rửa lồng nắp máy dịch thủy phân để lấy toàn phần thịt sót lại Đậy cốc thủy phân giấy nhôm, đặt cốc lên bếp khuấy từ, giữ nhiệt độ khảo sát là: 30±1; 35±1; 40±1; 45±10C, bếp đặt tủ ấm có nhiệt trên, điều chỉnh tốc độ khuấy để đảm bảo dịch thủy phân phải tạo thành xốy sâu mà khơng bị bắn ngoài(4) Tiến hành thủy phân 30 phút để thịt thủy phân hoàn toàn Dịch sau thủy phân cho qua rây lọc có đường kính lỗ rây 180µm để vào bình lắng thứ có dung tích lít, rửa rây lọc 2-3 lần nước ấm, toàn dịch rửa cho vào bình lắng Quá trình thủy phân đạt yêu cầu hiệu suất thủy phân lớn 95%(2) Lắng mẫu Dịch thủy phân bình lắng thứ để yên 30 phút(6) Lấy nhanh khoảng 125ml phần lắng từ bình lắng thứ vào bình lắng thứ hai tích 500ml, thêm nước ấm đến đầy bình Để n dịch bình lắng thứ hai 10 phút(6) Lấy nhanh khoảng 22-27ml phần lắng từ bình lắng thứ hai đĩa petri Chuyên Đề Ký Sinh Trùng Y Học TP Hồ Chí Minh * Tập 17 * Phụ Số * 2013 đường kính 90mm có chia ơ, để n dịch lắng đĩa petri khoảng 10 phút sau quan sát đếm ấu trùng Trichinella Xác định kết Trichinellacủa mẫu kính hiển vi soi Đĩa petri chứa dịch mẫu lắng kiểm tra kính hiển vi soi độ phóng đại 15-20 lần Ấu trùng Trichinella xuất dạng cuộn lạnh, di động nhiều nóng, hình chữ C chết Trong số trường hợp ấu trùng Trichinella nằm kén Trong trường hợp nghi ngờ, ấu trùng phải quan sát độ phóng đại cao Đánh giá hiệu lực để xác định thông số kỹ thuật phương pháp Chuẩn bị mẫu gây nhiễm: Lấy 5g mẫu chuẩn xác định mật độ Trichinella trộn với 45g thịt heo kiểm tra khẳng định âm tính với ký sinh trùng Tiến hành phân tích mẫu theo bước quy trình xây dựng Xác định giới hạn phát (Limit of detection LOD) Mẫu chuẩn bị cho trình xác định giới hạn phát có mật độ Trichinella sau: 1-2; 2-3; 3-4 ấu trùng Trichinella/50g Chuẩn bị mẫu cho mật độ gây nhiễm(7) Giá trị LOD xác định theo hướng dẫn ISO 16140:2003(7) + Xác định giá trị ước lượng tới hạn (Level criteria - LC)(7): từ kết phát Trichinella lần lặp lại với mật độ gây nhiễm khác trên, xác định tỷ lệ phát n/6 Giá trị ước lượng tới hạn mật độ ký sinh trùng mẫu mà cho tỷ lệ phát tương đương 50% (có tỷ lệ phát khoảng 2/6 – 4/6) Từ giá trị ước lượng tới hạn (LC), xác định giá trị ngưỡng phát (S0) theo biểu thức sau: S0= LC/1,65 Giá trị LOD (ký sinh trùng/50g mẫu) tính sau: LOD  3,3  S  50 m Nghiên cứu Y học Xác định thông số kỹ thuật phương pháp Các thông số khác xác định bao gồm: độ đặc hiệu, độ nhạy, độ xác, tỉ lệ dương tính giả, tỷ lệ âm tính giả(1,7) Quá trình xác định thơng số kỹ thuật phương pháp thực theo hướng dẫn tiêu chuẩn ISO 16140:2003 Quá trình đánh giá thực 18 mẫu, có mẫu khơng gây nhiễm Trichinella, 11 mẫu gây nhiễm với mật độ trung bình ấu trùng Trichinella/50g mẫu KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN Nghiên cứu xây dựng phương pháp Xác định pH tối ưu cho trình thủy phân Khảo sát tiến hành pH: 1,00; 1,25; 1,50; 1,75; 2,00 Mẫu thủy phân 45±10C 30 phút với nồng độ enzym 10 FIPU/ml Thí nghiệm lặp lại 10 lần pH khảo sát Kết khảo sát cho thấy khả thủy phân pepsin thay đổi theo pH môi trường: khoảng pH 1,00– 1,50 hiệu suất thủy phân đạt yêu cầu đặt quy trình ≥ 95% đạt cực đại 98,50% pH 1,5 (Biểu đồ 1), dịch lắng đục đều, đồng nhất, không phân tầng, dễ dàng quan sát kính hiển vi Tại pH 1,75 hiệu suất thủy phân đạt yêu cầu đặt quy trình nhiên dịch sau thủy phân nhiều mảnh, sợi thịt có kích thước lớn gây khó khăn cho việc phát ấu trùng (Hình 1) Tại pH 2,0 hiệu suất thủy phân thấp hiệu suất yêu cầu quy trình, dịch thủy phân sau lắng phân thành lớp, đục khơng thể quan sát kính hiển vi Như pH hoạt động tối ưu pepsin khoảng 1,0-1,5 Trong khoảng pH khơng có khác biệt hiệu suất thủy phân pepsin không ảnh hưởng đến việc đếm kết dịch lắng kính hiển vi soi Do để tiết kiệm chi phí, giảm giá thành cho q trình phân tích, giá trị pH 1,50 chọn pH tối ưu để thực phản ứng thủy phân mẫu Trong đó: m khối lượng mẫu thử nghiệm (m = 50g) Chuyên Đề Ký Sinh Trùng 147 Nghiên cứu Y học Ấu trùng Trichine Y Học TP Hồ Chí Minh * Tập 17 * Phụ Số * 2013 Mảnh, sợi gân thịt ấu trùng Khả thủy phân pepsin với vỏ nang collagen ấu trùng thấp so với protein khác thịt Do pepsin cần phải có hoạt độ đủ lớn để thủy phân hồn tồn thịt mẫu vỏ nang ấu trùng (2) Khi tiến hành phân tích mẫu chuẩn chứa ấu trùng Trichinella với nồng độ pepsin dịch thủy phân FIP-U/ml khả thủy phân vỏ nang ấu trùng bắt đầu giảm, số nang ấu trùng chưa bị thủy phân hồn tồn nên ấu trùng nằm nang (Hình 2) Do nồng độ pepsin chọn FIP-U/ml dịch thủy phân Hình Kết quan sát kính hiển vi sau lắng độ phóng đại 40 lần Biểu đồ Sự thay đổi hiệu suất thủy phân theo nồng độ pepsin Hình Các dạng ấu trùng Trichinella thu thủy phân với nồng độ pepsin FIP-U/ml Xác định nhiệt độ tối ưu cho giai đoạn thủy phân mẫu Xác định nồng độ pepsin tối ưu cho giai đoạn thủy phân mẫu Khảo sát tiến hành pH 1,50, mẫu thủy phân 45±20C 30 phút, nồng độ enzym dịch thủy phân thay đổi khoảng 6-10 FIP-U/ml Thí nghiệm lặp lại 10 lần nồng độ enzym Kết khảo sát cho thấy khoảng nồng độ pepsin 6-10 FIP-U/ml hiệu suất thủy phân thay đổi không đáng kể, đạt khoảng 98% Kết quan sát dịch sau lắng kính hiển vi tốt Tuy vậy, nghiên cứu không khảo sát nồng độ pepsin thấp vì: (1) q trình thủy phân, pepsin khơng thủy phân thịt mẫu mà thủy phân lớp vỏ nang 148 Biểu đồ Sự thay đổi hiệu suất thủy phân theo nhiệt độ thủy phân Khảo sát tiến hành pH 1,50; nồng độ pepsin FIP-U/ml, nhiệt độ thủy phân điểm 30, 35, 40, 45oC; thời gian thủy phân 30 Chuyên Đề Ký Sinh Trùng Y Học TP Hồ Chí Minh * Tập 17 * Phụ Số * 2013 phút Thí nghiệm lặp lại 10 lần nhiệt độ khảo sát Kết khảo sát cho thấy khoảng 35–45oC hiệu suất thủy phân có khácbiệt không đáng kể, đạt khoảng 97,8–98,0% (Biểu đồ 3) Trong khoảng nhiệt độ này, hiệu suất thủy phân ổn định thử nghiệm với loại thịt khác Vì để thuận tiện cho thao tác phân tích tiết kiệm điện gia nhiệt trình kiểm nghiệm, nhiệt độ tối ưu trình thủy phân chọn 350C Biểu đồ Sự thay đổi hiệu suất thủy phân theo thời gian Xác định thời gian thủy phân tối ưu Khảo sát tiến hành với dịch thủy phân có pH 1,50, nồng độ pepsin FIP-U/ml, trình thủy phân 350C khoảng thời gian 15, 20, 25, 30 phút Thí nghiệm lặp lại 10 lần giá trị thời gian khảo sát Kết khảo sát cho thấy tăng thời gian, hiệu suất thủy phân tăng dần (Biểu đồ 4) Sau 20 phút, hiệu suất thủy phân trung bình đạt 95% Nhưng tiến hành thủy phân 20 phút, thủy phân không ổn định loại mẫu khác nhau, số mẫu chứa nhiều collagen gân lipid có hiệu suất thấp so với yêu cầu Khi tăng thời gian thủy phân lên 25 phút 30 phút, hiệu suất thủy phân đạt yêu cầu với tất loại mẫu khác Vì thời gian tốt cho trình thủy phân qui trình phân tích Trichinella xác định 25-30 phút Đề xuất phương pháp phát ký sinh trùng Trichinella thịt kỹ thuật tiêu Trên sở thông số xác định 4.1, quy trình phát ký sinh trùng Trichinella sản phẩm thịt thiết lập sau: 50g mẫu thịt xay nhuyễn, thủy phân, lắng đếm kết Trichinella thực 3.2.1 đến 3.2.4 với yêu cầu kỹ thuật quy trình sau: pH dịch thủy phân 1,5; nồng độ pepsin dịch thủy phân FIP-U/ml; nhiệt độ thủy phân 350C; thời gian thủy phân khoảng 25 - 30 phút Chuyên Đề Ký Sinh Trùng Nghiên cứu Y học Đánh giá thông số kỹ thuật phương pháp phát Trichinella xây dựng Các thông số đánh giá là: giới hạn phát hiện, độ chọn lọc, độ đặc hiệu, tỉ lệ dương tính giả, tỉ lệ âm tính giả(1,7) Các thơng số xác định dựa theo ISO 16140:2003 Xác định giới hạn phát phương pháp Quá trình xác định giới hạn phát phương pháp thực 3.2.5 Kết phân tích mẫu gây nhiễm Bảng Bảng Kết khảo sát để xác định LOD phương pháp Mật độ Số mẫu Số lần cho Tỉ lệ phát Mẫu Trichinella /50g lặp lại kết dương mẫu dương tính tính T1 3/6 50% T2 4/6 67% T4 6/6 100% Từ kết nhận Bảng 1, giá trị xác định sau: Giá trị ước lượng tới hạn phương pháp LC = ấu trùng/50g mẫu; Giá trị ngưỡng S0 = 0,61; Giới hạn phát phương pháp LOD = ấu trùng/50g mẫu Xác định thông số kỹ thuật phương pháp Các thông số kỹ thuật phương pháp xây dựng xác định 18 mẫu, có mẫu khơng gây nhiễm Trichinella, 11 mẫu gây nhiễm với mật độ trung bình ấu trùng Trichinella/50g mẫu Kết đánh giá thơng số trình bày Bảng Bảng Kết xác định thông số kỹ thuật phương pháp Độ Thông Độ đặc Dương Âm Độ nhạy số đánh hiệu tính giả tính Kết luận (%) xác giá (%) (%) giả (%) (%) Phươn g pháp 100 100 94,4 9,1 Đạt tiêu Yêu Tham ≥ 98,0 ≥ 90,1 ≥ 94,4 ≤ 9,6 ≤ 2,0 cầu chiếu(*) (*Tham chiếu theo MMC-Microbiology Methods Committee, Canada) 149 Nghiên cứu Y học Y Học TP Hồ Chí Minh * Tập 17 * Phụ Số * 2013 Các thông số kỹ thuật phương pháp tiêu phát Trichinella Bảng cho thấy chúng hoàn toàn đáp ứng yêu cầu phương pháp phân tích tiêu chuẩn Đồng thời cho thấy có tương đồng kết phân tích Trichinella phương pháp xây dựng kết mẫu chuẩn Trung tâm Ký sinh trùng động vật Bệnh truyền nhiễm qua đường thực phẩm, thuộc Cơ quan Thanh tra thực phẩm Canada xác (Accuracy - AC) 94,4%, tỉ lệ âm tính giả 9,1%, tỉ lệ dương tính giả 0% Các thông số cho phép khẳng định phương pháp xây dựng đáp ứng yêu cầu để áp dụng phòng kiểm nghiệm an tồn vệ sinh thực phẩm TÀI LIỆU THAM KHẢO KẾT LUẬN Đã nghiên cứu xây dựng thành công phương pháp phát ký sinh trùng Trichinella thịt kỹ thuật tiêu nguyên tắc thủy phân hoàn toàn thịt mẫu enzym pepsin acid hyhrochloric, dịch sau thủy phân lắng lần bình lắng đọc kết kính hiển vi soi Phương pháp xây dựng có đặc điểm kỹ thuật sau: tỉ lệ khối lượng mẫu/dịch thủy phân 1:300; pH dịch thủy phân 1,5; nồng độ pepsin dịch thủy phân FIP-U/ml; nhiệt độ thích hợp cho giai đoạn thủy phân 35oC, thời gian thủy phân 25-30 phút Các thông số kỹ thuật phương pháp xây dựng xác định sau: giới hạn phát (LOD) ấu trùng Trichinella/50g mẫu, độ nhạy (Sensitivity - SE) 100%, độ đặc hiệu (Specificity - SP) 100%, độ 150 Community Reference Laboratory for Parasite Guideline for the detection of Trichinella larvae at the slaughterhouse or connected laboratory in a Quality Assurance System, Istituto Superiore di Sanità, 2006 European Community Regulation (EC) No 2075/2005 of the European Parliament and of the Council of December 2005 laying down specific rules on official controls for Trichinella in meat, Off J EC, L 338, pp 60-82, 2005 FAO/WHO/OIE Guidelines for the surveillance, management, prevention and control of Trichinellosis World Organisation for Animal Health (OIE), 2007 Forbes L.B & Gajadhar, A.A A validated Trichinella digestion assay and an associated sampling and quality assurance system for use in testing pork and horse meat, Journal of Food Protection, Vol 62, pp 1308-1313, 1999 Forbes, L B.,et al Complete Validation of a Unique Digestion Assay To DetectTrichinella Larvae in Hors e Meat Demonstrates the Reliability of this Assay for Meeting Food Safety and Trade Requirements Journal of Food Protection, Vol 71, pp 558-563, 2008 Gajadhar, A A., et al The double separatory funnel technique for the detection of Trichinella larvae in pork, Version 1.0, Official protocol Canadian Food Inspection Agency, Ottawa, Canada, 1996 ISO 16140:2003 Microbiology of food and animal feeding stuffs – Protocol for the validation of alternative method, first edition, 2003 Chuyên Đề Ký Sinh Trùng ... việc nghiên cứu xây dựng qui trình phát Trichinella thực phẩm cần thiết Mục tiêu nghiên cứu Nghiên cứu nhằm xác định yêu cầu kỹ thuật để xây dựng phương pháp phát ký sinh trùng Trichinella thịt kỹ. .. điều kiện áp dụng phương pháp ĐỐI TƯỢNG - PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Đối tượng nghiên cứu Dòng ký sinh trùng sử dụng nghiên cứu: Dòng Trichinella spiralis cung cấp Trung tâm Ký sinh trùng động vật Bệnh... trình phân tích Trichinella xác định 25-30 phút Đề xuất phương pháp phát ký sinh trùng Trichinella thịt kỹ thuật tiêu Trên sở thông số xác định 4.1, quy trình phát ký sinh trùng Trichinella sản