Thẩm định phương pháp định lượng amphotericin B trong thuốc tiêm đông khô liposome amphotericin B bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao

Mục tiêu nghiên cứu của bài viết nhằm thẩm định phương pháp định lượng amphotericin B (AmB) trong thuốc tiêm đông khô liposome amphotericin B bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) nhằm góp phần tiêu chuẩn hóa chất lượng sản phẩm.

TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 3-2016 THẨM ĐỊNH PHƢƠNG PHÁP ĐỊNH LƢỢNG AMPHOTERICIN B TRONG THUỐC TIÊM ĐÔNG HÔ LIPOSOME AMPHOTERICIN B BẰNG SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO Nguyễn Tuấn Quang*; Nguyễn Thái Sơn**; Phạm Thị Minh Huệ*** TÓM TẮT Mục tiêu: thẩm định phương pháp định lượng amphotericin B (AmB) thuốc tiêm đông khô liposome amphotericin B sắc ký lỏng hiệu cao (HPLC) nhằm góp phần tiêu chuẩn hóa chất lượng sản phẩm Đối tượng phương pháp: thuốc tiêm đông khô liposome AmB bào chế Bộ môn Bào chế, Trường Đại học Dược Hà Nội Tiến hành phân tích AmB phương pháp HPLC với cột: Phenomenex C18 (250 x 4,6 mm; µm), detector PDA, bước sóng 407 nm, tốc độ dòng 1,0 ml/phút, thể tích tiêm 10 µl, pha động: acetonitrile - natri acetat 10 mM pH 4,0 (theo gradient thể tích) Kết quả: phương pháp đảm bảo tính đặc hiệu, tính tương thích, tính tuyến tính, độ đúng, độ xác có khoảng xác định từ 15 - 25 µg/ml Áp dụng phương pháp để xác định hàm lượng AmB thuốc tiêm đông khô liposome AmB 50,07 ± 0,51 mg/lọ (100,15 ± 1,02% so với hàm lượng ghi nhãn) Kết luận: phương pháp định lượng đảm bảo yêu cầu sử dụng để định lượng AmB thuốc tiêm đơng khơ liposome AmB * Từ khóa: Amphotericin B; Liposome; Thuốc tiêm đông khô; Sắc ký lỏng hiệu cao Validation of an Analytical Assay Method for Amphotericin B in Amphotericin B Liposomal Lyophilized Powder for Injection by High Performance Liquid Chromatography Summary Objectives: To validate the analytical assay method for amphotericin B in amphotericin B liposomal lyophilized powder for injection by high performance liquid chromatography (HPLC) aiming to standardize the quality of the products Participants and methodology: Amphotericin B liposomal lyophilized powder for injection produced by Department of Pharmaceutics, Hanoi University of Pharmacy is analyzed using the HPLC system with the column Phenomenex C18 (250 x 4.6 mm, µm), detector PDA, the wave length of 407 nm, the water flow speed of 1.0 ml/min, injection volume of 10 µl, a mixture of acetonitrile - natri actetate 10 mM pH 4.0 (gradient volume) as mobile phase Results: The method ensures the specificity, compatibility, linearity, propriety, accuracy and is approximately determined from 15 µg/ml to 25 µg/ml As a result, the amount of amphotericin B measured in amphotericin B liposomal lyophilized powder for injection is 50.07 ± 0.51 (mg/vial) * Học viện Quân y ** Bệnh viện Quân y 103 *** Đại học Dược Hà Nội Người phản hồi (Corresponding): Nguyễn Tuấn Quang (dsquang2000@yahoo.com) Ngày nhận bài: 24/01/2016; Ngày phản biện đánh giá báo: 25/02/2016 Ngày báo đăng: 01/03/2016 13 TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 3-2016 (100.15 ± 1.02% of the amount written on the label) Conclusion: The method meets all the requirements and can be used to measure the amount of amphotericin B in amphotericin B liposomal lyophilized powder for injection * Key words: Amphotericin B; Liposome; Lyophilized powder for injection; High performance liquid chromatography ĐẶT VẤN ĐỀ Amphotericin B kháng sinh chống nấm, phổ rộng, sử dụng từ lâu chủ yếu dạng tiêm tĩnh mạch trường hợp nhi m nấm hệ thống Tuy nhiên, hạn chế dược chất không tan nước, nên sinh khả dụng không cao gây nhiều tác dụng phụ, đặc biệt gây độc cho thận [1, 3] Việc nghiên cứu đưa hoạt chất AmB vào hệ mang thuốc liposome để cải thiện sinh khả dụng làm giảm độc tính thận AmB vấn đề có ý nghĩa khoa học thực ti n cao Thuốc tiêm đông khô liposome AmB bào chế thành công quy mô 30 lọ/mẻ với tiêu vật lý đạt yêu cầu hệ mang thuốc nano Việc nghiên cứu định lượng AmB thuốc tiêm đông khô liposome AmB quan trọng, góp phần xây dựng cơng thức bào chế, tiêu chuẩn hóa chất lượng sản phẩm Để định lượng AmB, sử dụng phương pháp quang phổ hấp phụ tử ngoại khả kiến (UV-Vis) hay xác định hoạt lực thuốc kháng sinh phương pháp thử vi sinh vật [2] Tuy nhiên, phương pháp có độ xác khơng cao u cầu điều kiện thí nghiệm nghiêm ngặt Vì vậy, báo chúng tôi: Thông báo kết thẩm định phương pháp định lượng AmB thuốc tiêm đông khô liposome AmB sắc ký lỏng hiệu cao 14 NGUYÊN LIỆU, THIẾT BỊ VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Nguyên liệu thiết bị - Thuốc tiêm đông khô liposome AmB bào chế Bộ môn Bào chế, Trường Đại học Dược Hà Nội, số lô NC 0315, hạn sử dụng 03 - 2017 - Hóa chất: acetonitril, methanol, axít acetic, natri acetat trihydrat, nước cất pha tiêm đạt tiêu chuẩn cho HPLC; chất chuẩn AmB (Dr Ehrenstorfer, Đức, 95%); hóa chất dung mơi khác đạt tiêu chuẩn tinh khiết phân tích - Hệ thống sắc ký lỏng hiệu cao Water e2695 (Mỹ) gồm hệ bơm kênh dung môi, autosampler, detector PDA, cột phenomenex C18 (250 x 4,6 mm, µm) - Dụng cụ: cân phân tích Mettler toledo (độ xác 0,1 mg) dụng cụ phân tích khác đạt tiêu chuẩn thí nghiệm Phƣơ g pháp ghi cứu - Điều kiện sắc ký: + Cột: Phenomenex C18 (250 x 4,6 mm; µm) + Detector UV bước sóng: 407 nm + Tốc độ dòng: 1,0 ml/phút + Thể tích tiêm: 10 µl + Pha động: acetonitrile - natri acetat 10 mM pH 4,0 (theo gradient thể tích) [4, 5] TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 3-2016 Thời gian (phút) Tốc độ dòng (ml/phút) % đệm natri acetat % acetonitril 0,01 1,00 70,0 30,0 Tính hàm lượng (%) AmB chế phẩm theo công thức: St * ft * mc * HLc 4,00 1,00 40,0 60,0 8,00 1,00 20,0 80,0 9,00 1,00 60,0 40,0 * Dung dịch natri acetat 10 mM pH 4,0: cân xác 0,2014 g natri acetat trihydrat 0,5111 g axít acetic hòa tan 1.000 ml nước cất Điều chỉnh dung dịch pH (nếu cần), lọc qua màng lọc 0,45 µm - Phương pháp xử lý mẫu: + Mẫu chuẩn: cân xác 10,0 mg AmB chuẩn hòa tan bình định mức 100 ml methanol Hút xác ml dung dịch cho vào bình định mức 10 ml, thêm methanol vừa đủ đến vạch, lắc Lọc qua màng lọc 0,45 µm + Mẫu thử: lấy lọ chế phẩm thêm 10 ml nước cất vô khuẩn để pha tiêm, lắc để thu hỗn dịch liposome Chuyển sang bình định mức 250 ml, thêm 50 ml hỗn hợp dung môi methanol-cloroform (3/1, tt/tt), tiếp tục pha lỗng đến vạch, lắc Hút xác ml dung dịch cho vào bình định mức 10 ml, thêm methanol vừa đủ đến vạch, lắc Lọc qua màng lọc 0,45 µm + Mẫu trắng (placebo): lấy lọ placebo thêm 10 ml nước cất vô khuẩn để pha tiêm, lắc Chuyển sang bình định mức 250 ml, thêm 50 ml hỗn hợp dung môi methanolcloroform (3/1, tt/tt), tiếp tục pha loãng đến vạch, lắc Hút xác ml dung dịch cho vào bình định mức 10 ml, thêm methanol vừa đủ đến vạch, lắc Lọc qua màng lọc 0,45 µm H (%) = x 100% Sc * fc * Mn Trong đó: H (%): hàm lượng % AmB chế phẩm St, Sc: diện tích píc mẫu thử mẫu chuẩn ft, fc: hệ số pha loãng mẫu thử, mẫu chuẩn mc: khối lượng chất chuẩn (mg) HLc: hàm lượng tinh khiết chất chuẩn (%) Mn: hàm lượng hoạt chất ghi nhãn (mg) - Thẩm định phương pháp: với tiêu chí tính đặc hiệu, tính thích hợp hệ thống, tuyến tính, độ đúng, độ xác khoảng xác định [4] KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ BÀN LUẬN Tí h đặc hiệu Tiến hành sắc ký mẫu chuẩn, mẫu thử mẫu trắng Sắc ký đồ mẫu thể hình 1, hình hình Kết sắc ký đồ (SKĐ) cho thấy: mẫu thử cho píc AmB có thời gian lưu tương ứng với thời gian lưu píc AmB mẫu chuẩn Píc AmB mẫu thử cân đối, tách hoàn toàn khỏi píc tạp Hệ số chồng phổ UV píc AmB thu SKĐ dung dịch thử phổ UV píc tương ứng SKĐ dung dịch chuẩn xấp xỉ (hệ số chồng phổ = 0,9999) Đồng thời, mẫu trắng khơng thấy xuất píc có thời gian lưu tương ứng với thời gian lưu AmB mẫu chuẩn mẫu thử 15 TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 3-2016 Diện tích píc (mAU.s) Thời gian (phút) Hình 1: SKĐ mẫu trắng Diện tích píc (mAU.s) Thời gian (phút) Hình 2: SKĐ mẫu chuẩn AmB Diện tích píc (mAU.s) Thời gian (phút) Hình 3: SKĐ AmB mẫu thử 16 Thời gian (phút) TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 3-2016 Tính thích hợp Tiến hành tiêm lặp lại lần dung dịch AmB chuẩn có nồng độ khoảng 25 µg/ml vào hệ thống sắc ký Bảng 1: Kết đánh giá tính thích hợp hệ thống sắc ký Stt Thời gia ƣu píc (s) Diện tích píc (mAU.s) Hệ số đối xứng Số đĩa ý thu ết 5,606 1309969 1,18 45987 5,588 1309678 1,21 44845 5,594 1309601 1,18 42653 5,582 1296938 1,19 44628 5,589 1299925 1,21 43620 5,591 1301446 1,20 43413 Trung bình 5,592 1304593 1,20 44191 RSD % 0,14 0,45 Độ lệch chuẩn tương đối thời gian lưu diện tích píc mẫu chuẩn AmB 0,14% 0,45% Hệ số đối xứng píc AmB 1,20 (đạt yêu cầu < 2), số đĩa lý thuyết 44141 (đạt yêu cầu không 1000) Như vậy, phương pháp phân tích hồn tồn phù hợp với hệ thống sắc ký Tính tuyến tính Pha dãy dung dịch AmB chuẩn pha động có nồng độ từ 10 - 40 µg/ml Tiến hành sắc ký dung dịch theo điều kiện sắc ký nêu Bảng 2: Kết khảo sát tính tuyến tính phương pháp định lượng AmB Stt Nồ g độ AmB (µg/ml) Diện tích píc (mAU.s) 10 535148 15 793702 20 1055328 25 1309969 30 1583122 35 1863179 40 2104649 Phương trình hồi quy: y = 52680x + 3719 Hệ số tương quan (r): 0,999 Hệ số góc: 52680 Hệ số chắn: 3719 %Y: 0,352 17 TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 3-2016 Diện tích píc (mAU.s) Nồng độ AmB (µg/ml) Hình 4: Đồ thị biểu di n tương quan tuyến tính nồng độ diện tích píc AmB Trong khoảng nồng độ khảo sát, có tương quan tuyến tính chặt chẽ nồng độ AmB diện tích píc với hệ số tương quan r ≈ Tỷ lệ (%) hệ số chắn Y nồng độ 20 µg/ml 0,352% (đạt yêu cầu < 2%) Độ đú g Tiến hành phương pháp thêm chuẩn vào mẫu trắng để thu dung dịch mẫu tự tạo có lượng AmB chuẩn tương ứng 75%, 100% 125% hàm lượng ghi nhãn (37,5 mg; 50 mg 62,5 mg) Tiến hành sắc ký dung dịch mẫu tự tạo (tại mức nồng độ, thực mẫu độc lập) mẫu chuẩn có nồng độ tương ứng, mẫu tiêm 01 lần Ghi lại sắc ký đồ, đáp ứng píc xác định tỷ lệ (%) AmB thu hồi Bảng 3: Kết khảo sát độ phương pháp định lượng AmB Tỷ lệ Stt Tỷ lệ so với đị h ƣợng (%) Mẫu trắng (lọ) Lƣợng chuẩn AmB thêm vào (mg) Diện tích píc (mAU.s) Lƣợng AmB tìm lại (mg) 75 36,20 676541 36,53 100,94 75 36,20 679798 36,71 101,42 75 36,20 678665 36,65 101,26 thu hồi (%) Diện tích píc chuẩn (mAU.s): 676848 18 TB: 101,21 RSD (%): 0,24 100 48,26 911535 48,25 99,97 100 48,26 924120 48,91 101,35 100 48,26 922721 48,84 101,20 TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 3-2016 Diện tích píc chuẩn (mAU.s): 920755 TB: 100,84 RSD (%): 0,75 125 60,33 1184609 60,15 99,72 125 60,33 1201927 61,03 101,17 125 60,33 1195221 60,69 100,61 Diện tích píc chuẩn (mAU.s): 1199666 TB: 100,50 RSD (%): 0,73 X (%) (n = 9): 100,85 RSD (%) (n = 9): 0,62 Phương pháp có độ thu hồi AmB mức nồng độ nằm giới hạn cho phép 98 - 102%, với RSD kết 0,62% (nằm giới hạn < 2%) Do đó, phương pháp đạt yêu cầu độ Độ xác * Độ lặp lại: Độ lặp lại phương pháp định lượng xác định định lượng lần mẫu thử điều kiện sắc ký nêu với diện tích píc mẫu chuẩn 1055328 Bảng 4: Kết đánh giá độ lặp lại phương pháp định lượng AmB (n = 6) Lọ Diện tích píc (mAU.s) Kết đị h ƣợng (%) 1063779 100,55 1078622 101,95 1060442 100,23 1050567 99,30 1051289 99,37 1052519 99,48 X 100,15 RSD % 1,02 Phương pháp có độ lặp lại cao với giá trị độ lệch chuẩn tương đối RSD = 1,02% (đạt yêu cầu < 2%) * Độ xác trung gian: Độ xác trung gian phương pháp định lượng xác định độ lặp lại, tiến hành khác ngày không kiểm nghiệm viên 19 TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 3-2016 Bảng 5: Kết đánh giá độ xác trung gian phương pháp định lượng AmB Stt Kiểm nghiệm viên Kiểm nghiệm viên Diện tích píc chuẩn: 1055328 Diện tích píc chuẩn: 1005747 Diện tích píc (mAU.s) Kết định lượng (%) Diện tích píc (mAU.s) Kết định lượng (%) 1063779 100,55 1049223 100,10 1078622 101,95 1050606 100,23 1060442 100,23 1051256 100,29 1050567 99,30 1040455 99,26 1051289 99,37 1060356 101,16 1052519 99,48 1054064 100,56 Trung bình 100,15 100,27 RSD % 1,02 0,62 Kết (%) định lượng trung bình (n = 12): 100,21 RSD (%) (n = 12): 0,80 Khoả g xác định Trong phần xác định độ đúng, độ tuyến tính mức nồng độ 75%, 100% 125% so với hàm lượng AmB ghi nhãn đảm bảo độ đúng, độ lặp lại độ tuyến tính Vì vậy, khoảng xác định phương pháp định lượng từ 15 - 25 µg/ml Kết đị h ƣợng AmB thuốc ti m đô g hô liposome-AmB Từ phương pháp thẩm định, tiến hành xác định hàm lượng AmB thuốc tiêm đông khô liposome AmB Kết cho thấy: hàm lượng AmB thuốc tiêm đông khô liposome AmB 50,07 ± 0,51 (mg/lọ) (n = 6) KẾT LUẬN Đã thẩm định phương pháp định lượng AmB thuốc tiêm đông khô liposome AmB HPLC Phương pháp có tính đặc hiệu tính thích hợp cao với hệ thống sắc ký, đảm bảo tính tuyến tính, độ độ xác theo yêu cầu 20 phân tích, khoảng xác định từ 15 - 25 µg/ml Hàm lượng AmB thuốc tiêm đơng khô liposome AmB 50,07 ± 0,51 (mg/lọ) (đạt 100,15 ± 1,02% so với hàm lượng ghi nhãn) TÀI LIỆU THAM KHẢO Bộ mơn Hóa dược, Trường Đại học Dược Hà Nội Hóa dược - tập NXB Y học 2007, tr.195-196 Bộ Y tế Dược điển Việt Nam IV NXB Y học 2009, tr.91-92 Bộ Y tế Dược thư Quốc gia Việt Nam NXB Y học 2002, tr.146-148 Nguyễn Minh Đức Sắc ký lỏng hiệu cao số ứng dụng vào nghiên cứu, kiểm nghiệm dược phẩm, dược liệu hợp chất tự nhiên NXB Y học Thành phố Hồ Chí Minh 2006, tr.138,148-149 Italia JL et al High-performance liquid chromatographic analysis of amphotericin B in rat plasma using α-naphthol as an internal standard Analytica Chimica Acta 2009, 634 (1), pp.110-114  ... định phương pháp định lượng AmB thuốc tiêm đông khô liposome AmB sắc ký lỏng hiệu cao 14 NGUYÊN LIỆU, THIẾT B VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Nguyên liệu thiết b - Thuốc tiêm đông khô liposome AmB b o... thẩm định, tiến hành xác định hàm lượng AmB thuốc tiêm đông khô liposome AmB Kết cho thấy: hàm lượng AmB thuốc tiêm đông khô liposome AmB 50,07 ± 0,51 (mg/lọ) (n = 6) KẾT LUẬN Đã thẩm định phương. .. 6) KẾT LUẬN Đã thẩm định phương pháp định lượng AmB thuốc tiêm đông khô liposome AmB HPLC Phương pháp có tính đặc hiệu tính thích hợp cao với hệ thống sắc ký, đảm b o tính tuyến tính, độ độ xác