Nghiên cứu định lượng atractylenolide III trong thân rễ bạch truật (atractylodes macrophala koidz) bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao bắt cặp detector dad

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI KHOA Y DƯỢC TRẦN NGỌC TUÂN NGHIÊN CỨU ĐỊNH LƯỢNG ATRACTYLENOLIDE III TRONG THÂN RỄ BẠCH TRUẬT (Atractylodes macrophala Koidz) BẰNG SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO BẮT CẶP DETECTOR DAD KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH DƯỢC HỌC HÀ NỘI – 2019 ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI KHOA Y DƯỢC Người thực : TRẦN NGỌC TUÂN NGHIÊN CỨU ĐỊNH LƯỢNG ATRACTYLENOLIDE III TRONG THÂN RỄ BẠCH TRUẬT (Atractylodes macrophala Koidz) BẰNG SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO BẮT CẶP DETECTOR DAD KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH DƯỢC HỌC Khóa: QH2014.Y Người hướng dẫn: TS Hồng Lê Sơn PGS.TS Nguyễn Thanh Hải HÀ NỘI – 2019 LỜI CẢM ƠN Trước tiên, xin gửi lời cảm ơn chân thành sâu sắc tới Tiến sĩ Hoàng Lê Sơn – Khoa Bào chế Chế biến PGS.Tiến sĩ Nguyễn Thanh Hải – Chủ nhiệm môn Bào chế khoa Y Dược, Đại học Quốc gia Hà Nội, Viện Dược Liệu người tận tình hướng dẫn, bảo giúp đỡ tơi suốt q trình thực khóa luận Tơi xin cảm ơn thầy môn Bào chế - khoa Y Dược, Đại học Quốc gia Hà Nội khoa Bào chế Chế biến – Viện Dược Liệu, tạo điều kiện để tơi thực khóa luận Tơi xin gửi lời cảm ơn tới Ban chủ nhiệm, Phòng ban khoa Y Dược, Đại học Quốc gia Hà Nội tồn thể thầy giáo khoa cho kiến thức quý báu suốt năm học tập, sinh hoạt rèn luyện khoa Cuối cùng, xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến gia đình bạn bè ln bên cạnh, động viên tơi lúc khó khắn q trình thực khóa luận Hà Nội, ngày tháng Trần Ngọc Tuân năm 2019 DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT LOD Giới hạn phát (Limit Of Detection) LOQ Giới hạn định lượng (Limit Of Quantitation) HPLC Sắc ký lỏng hiệu Chromatography) DAD Máy đo quang (Diode Array Detector) RSD Độ lệch chuẩn tương đối ACN Acetonitrile USP Dược điển Hoa Kì ICH Hội nghị quốc tế hài hồ hố thủ tục đăng ký dược phẩ m sử dụng cho người cao (High Performance Liquid DANH MỤC BẢNG BIỂU Bảng Hóa chất thuốc thử Trang thiết bị, máy Kết sắc ký đồ chương trình chạy phát 220nm 10 Kết diện tích p Ethanol 96% p Các thông số đánh Kết độ tuyến tí Atractylenolide III Kết đánh giá tí định lượng Atract 26µg/ml Kết đánh giá đ Atractylenolide III Kết đánh giá đ mẫu thử thêm Kết xác định h Bạch truật Việt Na DANH MỤC HÌNH ẢNH Hình Tên hình Cơng thức cấ Công thức cấ Sắc ký đồ ph sóng hấp thụ Sắc ký đồ HP định lượng A thêm chuẩn v Sắc ký đồ HP lượt 0,065 Đường chuẩn diện tích pic III Sắc ký đồ ph truật H Phổ hấp thụ truật Việt Na MỤC LỤC MỞ ĐẦU CHƯƠNG - TỔNG QUAN 1.1 Giới thiệu chung bạch truật 1.1.1 Tên khoa học 1.1.2 Mô tả thực vật, phận dùng 1.1.3 Phân bố, thu hái chế biến 1.1.4 Thành phần hóa học 1.1.5 Tác dụng dược lý 1.2 Tổng quan vị thuốc Bạch thuật 1.3 Vài nét hoạt chất Atractylenolide III 1.4 Các nghiên cứu định lượng Atractylenolide III bạch truật CHƯƠNG - ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Đối tượng nghiên cứu 2.2 Trang thiết bị, dung môi, hóa chất 2.3 Phương pháp nghiên cứu 10 2.3.1 Khảo sát điều ki ệ n sắc ký 10 2.3.2 Phương pháp xử lý mẫu 10 2.3.3 Thẩm định quy trình phân tích 10 2.3.4 Phương pháp xử lý đánh giá kết 13 CHƯƠNG - KẾT QUẢ 15 3.1 Xây dựng phương pháp định lượng Atractylenolide III 15 3.1.1 Xác định bước sóng phát chất chuẩn Atractylenolide III 15 3.1.2 Xây dựng điều kiện sắc ký mẫu Bạch truật HPLC-DAD 15 3.1.3 Xác định điều kiện tối ưu hóa xử lý mẫu 17 3.1.4 Điều kiện chạy sắc ký HPLC 17 3.2 Thẩm định phương pháp phân tích 18 3.2.1 Tính đặc hiệu phương pháp 18 3.2.2 Giới hạn phát giới hạn định lượng 19 3.2.3 Độ tuyến tính 19 3.2.4 Độ thích hợp hệ thống 21 3.2.5 Độ lặp lại 21 3.2.6 Độ 22 3.3 Ứng dụng phương pháp xác định hàm lượng dược chất củ Bạch truật 23 CHƯƠNG - BÀN LUẬN 25 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT 26 TÀI LIỆU THAM KHẢO MỞ ĐẦU Bạch truật vị thuốc từ loài Atractylodes macrocephala Koidz (Họ Compossitae), có vị trí quan trọng cổ phương đơn độc Đông Á ngàn năm để điều trị số chứng bệnh đau dày, bụng trướng đầy, ung thư, chứng loãng xương béo phì Khoảng bảy mươi hợp chất xác định cấu trúc hóa học đa phần thuộc nhóm sesquiterpenoid, phenolic acid polyacetylene mối liên hệ với tác dụng lâm sàng chưa rõ ràng Cả chất tinh khiết lẫn cao dịch chiết thể tác dụng dược lý mạnh cải thiện hệ tiêu hóa thơng qua bào IEC-6, kháng số dòng tế bào ung thư gồm HepG2, LOVO, CEM, MKN-45, kích thích miễn dịch, kháng viêm, chống oxy hóa, cải thiện khả nhớ chuột Với lợi ích lâm sàng hiệu điều trị chứng minh, Bạch truật bắt đầu di thực Việt Nam từ năm 1970 tr ồng phổ biên Lào Cai, Sơn La, Hà Giang, Hà Nội Lâm Đồng Hiện tại, nghiên cứu công bố hàm lượng dược chất có Bạch truật di thực cịn hạn chế Do đó, chúng tơi thực đề tài “ Nghiên cứu định lượng Atractylenolide III thân rễ bạch truật (Atractylodes macrophala Koidz) sắc ký lỏng hiệu cao bắt cặp detector DAD” với hai mục tiêu đây: - Xây dựng phương pháp định lượng Atractylenolide III thân rễ Bạch truật phương pháp HPLC-DAD - Ứng dụng phương pháp để định lượng hàm lượng Atractylenolide III mẫu Bạch truật Việt Nam Trung Quốc Lựa chọn chấ t nghiên cứu Atractylenolide III hoạt chất thể tác dụng b ảo v ệ đường tiêu hóa, chống lỗng xương, cải thiện trí nhớ, kháng viêm mơ hình dược lý giải thích sau Hàm lượng Atractylenolide III thấp so với atractylenolide I II gây khó khăn q trình định lượng điều phản ảnh thực tế tác dụng cao dịch chiết Bạch truật lại tốt đơn chất riêng biệt Kiểm sốt chất nhỏ có lợi ích trường hợp CHƯƠNG - TỔNG QUAN 1.1 Giới thiệu chung bạch truật 1.1.1 Tên khoa học Bạch truật có tên khoa học Atractylodes macrocephala Koidz thuộc họ Cúc (Compossitae) [1] 1.1.2 Mô tả thực vật, phận dùng Đặc điểm: Cây thảo, sống lâu năm, có thân rễ to, mọc đất Thân thẳng, cao 0.30.8m, đơn độc phân nhánh phận trên, phần thân hóa gỗ Lá mọc cách, dài Lá phần thân có cuống dài, phần có cuống ngắn, gốc rộng, bọc lấy thân Phiến xẻ sâu thành thùy, thùy lớn, hình trứng trịn, hai đầu nhọn, hai thùy bên nhỏ hơn, hình trứng mũi mác, phần gốc khơng đối xứng Các gần thân có phiến ngun, hình thn hình trứng mũi mác, mép có cưa Đầu lớn, phần có bắc hình xẻ sâu, hình lơng chim Bao hình chng, có bắc mỏng xếp thành hàng Lá bắc nhỏ hình trứng tam giác, to dần phía Hoa nhiều, tràng hình ống, phần màu trắng, phần màu đỏ tím, xẻ làm thùy hình mũi mác, xoắn ngồi Năm nhị hàn liền (có nhị bị thối hóa), nhị hình sợi dẹp Bầu thon mặt ngồi có lơng nhung, màu nâu nhạt, đoạn có lơng hình lơng chim Vịi hình màu tím nhạt đầu nhị xẻ thành thùy nơng hình đầu, mặt ngồi có lơng ngắn Quả bế, thuôn, dẹp, màu xám [2] Bộ phận dùng làm thuốc: Dùng thân rễ cứng chắc, có dầu thơm nhẹ, ruột màu trắng ngà [2,10] 1.1.3 Phân bố, thu hái chế biến Phân bố: Bạch truật trồng chủ yếu Trung Quốc Đến năm 1970, Bạch truật bắt đầ u di thực trồng Lào Cai, Sơn La, Hà Giang, Hà Nội Lâm Đồng [2,10] Thu hái sơ chế: Cây trồng bạch truật thu hái từ cuối tháng 10 đến đầu tháng 11 (thường từ 8-22/11) Lúc thu hoạch, chọn ngày nắng ráo, đất khô, nhổ nhẹ nhàng Sau nhổ, lấy dao cất bỏ thân đem củ chế biến [1,10] - Bước sóng 220 nm - Pha động đẳng dịng với hệ dung mơi ACN Nước (43:57) 30 phút Các thông số peak trình bày bảng Bảng 5: Các thông số HPLC đánh giá Atractylenolide III STT Thơng số Thời gian lưu, tR Diện tích pic (ứng với du độ 26µg/ml) Độ phân giải, R Hệ số kéo đuôi pic Số đĩa lý thuyết 3.2 Thẩm định phương pháp phân tích 3.2.1 Tính đặc hiệu phương pháp Tiến hành phân tích mẫ u: Dung dịch Atractylenolid III chuẩn, dung dịch mẫu thử, dung dịch mẫu thử thêm chuẩn dung dịch mẫu trắng với điều kiện phân tích HPLC trình bày trên, thu kết đánh giá sắc ký đồ tương ứng hình Hình 4: Sắc ký đồ HPLC đánh giá độ đặc hiệu phương pháp đó: 1-Mẫu trắng; 2- Mẫu thử; 3-Mẫu thử thêm chuẩn; 4- Mẫu chuẩn 18 Kết nhận xét: Trên sắc ký đồ thu cho thấy, thời gian lưu mẫu Atractylenolid III mẫu chuẩn, mẫu thử mẫu thử thêm chuẩn tương ứng v ới mẫu trắng Pic Atractylenolid III khơng bị trùng với pic khác Phương pháp xây dựng phù hợp với chất Atractylenolide III cần phân tích 3.2.2 Giới hạn phát (LOD) giới hạn định lượng (LOQ) Chúng tiến hành chạy với điều kiện xây dựng Dựa vào diện tích pic chất nền, chúng tơi tiến hành pha lỗng dung dịch chuẩn đến S/N= 2-3 pha lỗng thêm lần S/N khơng nằm khoảng giới hạn giá trị giá trị giới hạn phát LOD, từ suy giới hạn định Hình 5: Sắc ký đồ HPLC Atractylenolide III với nồng độ 0,065µg/ml 0,65µg/ml lượng LOQ Kết nhận xét: Tại n ồng độ 0.065 µg/ml tỷ lệ S/N tương ứng Từ chúng tơi suy kết LOD v ới tỷ lệ tín hiệu nhiễu S/N=3 giá trị LOD = 0,039µg/ml Kết thu sau: - Giới hạn phát (LOD): 0,039 (µg/ml) - Giới hạn định lượng (LOQ): 0,117 (µg/ml) 3.2.3 Độ ến tính Tiến hành chạ y sắc ký dãy dung dịch chuẩn Atractylenolide III có nồng độ từ 104µg/ml đến 1,625µg/ml với điều kiện xây dựng Kết khảo sát n ồng độ diện tích pic dung dịch Atractylenolide tương ướng bảng 19 Bảng 6: Kết độ tuyến tính phương pháp HPLC định lượng Atractylenolide III với dãy nồng độ chuẩn Nồng độ (µg/ml) 1.625 3.25 6.5 13 19.5 26 32.5 52 104 Phương trình đường Hình 6: Đường chuẩn biểu diễn mối quan hệ nồng độ diện tích pic mẫu chuẩn Atractylenolide III 20 2 Kết nhận xét: Độ tuyến tính đánh giá qua hệ số tương quan R R = 0,9987 cho thấy đường chuẩn có độ tuyến tính cao đảm bảo để thực phép phân tích định lượng Atractylenolide III 3.2.4 Tính thích hợp hệ thống Tính thích hợp hệ thống thực sắc ký tiêm lần với mộ t mẫu chuẩn nồng độ 26µg/ml Kết đánh giá thông qua giá trị độ lệch tương đối RSD ( diện tích pic thời gian lưu sau lần phân tích lặp lại mẫu chuẩn Atractylenolide III có nồng độ 26 µg/ml Kết trình bày bảng7 Bảng 7: Kết đánh giá tính thích hợp hệ thống c phương pháp định lượng Atractylenolide III với mẫu chuẩn nồng độ 26µg/ml STT Trung bình RSD (%) Kết nhận xét: Độ lệch chuẩn tương đối (RSD) diện tích pic thời gian lưu nh ỏ 2%, kết cho thấy tính thích hợp phương pháp xây dựng đạt 3.2.5 Độ lặp lại Độ lặp lại đánh giá theo phương pháp trình bày Độ lặp lại đánh giá thông qua sô độ chệch tương đối (RSD) hàm lượng dược chất dược liệu 2% Kết thu trình bày bảng 21 Bảng 8: Kết đánh giá độ lặp lại phương pháp định lượng Atractylenolide III với mẫu bạch truật chiết với Ethanol 96% Khối lượng dược liệu (g) Hàm lượng Atractynolide III (%) TB hàm lượng (%) RSD (%) Kết nhận xét: Độ lệch chuẩn tương đối (RSD) 2% cho thấy phương pháp xây dựng có độ lặp lại cao 3.2.6 Độ Độ đánh giá theo phương pháp trình bày Độ đánh giá qua độ thu đồ dược chất cần phân tích Atractylenolide III 98-102% theo quy định ICH độ lệch chuẩn tương đối (RSD) lần lặp lại mẫu đánh giá độ thu hồi  2% Kết trình bày bảng Bảng 9: Kết đánh giá độ thu hồi phương pháp định lượng mẫu thử thêm chuẩn Atractylenolide III Nồng độ dược chất (µg/ml) 24,2 Kết nhận xét: Độ thu hồi trung bình phương pháp định lượng Atractylenolide III dược liệu bạch truật sắc ký lỏng hiệu cao HPLC đạt khoảng 98-102%, chứng tỏ phương pháp xây dựng có độ cao 3.3 Ứng dụng phương pháp xác định hàm lượng dược chất củ bạch truật Phân tích hàm lượng Atractylenolide III mẫu dược liệu Việt Nam Trung Quốc phương pháp xây dựng Kết qu ả trình bày bảng 10 so sánh sắc ký đồ hai mẫu bạch truật Việt Nam truật Trung Quốc hình Bảng 10: Kết xác định hàm lượng Atractylenolide III mẫu bạch truật Việt Nam Trung Quốc M Mẫu V Mẫu Tr 23 B A Hình 7: Sắc ký đồ phân tích Atractylenolide III mẫu Bạch truật HPLCDAD A- Bạch truật Việt Nam, B- Bạ ch truật Trung Quốc Hình 8: Phổ hấp thụ UV thành phần khác mẫu bạch truật Việt Nam Nhận xét: Dựa vào kết cho thấy bạch truật trồng Việt Nam Trung Quốc có hàm lượng Atractynolide III 0,06 0,08%, tương ứng So sánh phổ đồ, bạch truật Việt Nam xuất số pic khác (UV hình 8), điều cho thấy, bạch truật Việt Nam cần số nghiên cứu khác thành phần hóa học Điều lý giải áp dụng điều kiện chạy dược điển Hồng Kông lại thất bại mẫu dược liệu Việt Nam 24 CHƯƠNG - BÀN LUẬN Trong nghiên cứu này, phương pháp định lượng Atractylenolide III thân rễ bạch truật xây dựng thẩm định Trong đó, điều kiện pha động HPLC-DAD MeOH :H2O có tỷ lệ 43 :57 Độ xác phương pháp đạt sau thẩm định theo hướng dẫn ICH Kết áp dụng phương pháp vừa xây dựng cho thấy Atractynolide III mẫu trồng Việt Nam thấp Trung Quốc Do mẫu thu thập bị giới hạn số lượng, cần nghiên cứu với cỡ mẫu lớn để khẳng định chắn khác biệt Tuy nhiên, giá trị thu cao nhiều lần yêu cầu dược điển Hồng Kông yêu cầu 0,019% Chứng tỏ, bạch truật thu hái Việt Nam có đủ điều kiện thâm nhập thị trường dược liệu Hồng Kơng, nơi cửa ngõ giao thương bên ngồi vào Trung Quốc nhiều nơi khác giới Bên cạnh đó, hai phổ đồ thu thể rõ khác biệt peak phụ Điều cho thấy tiềm sinh học thành phần hóa học trồng Việt Nam chưa khám phá hết Mặt khác, điều gây khó khăn áp dụng dược điển Hồng Kông phân tích mẫu Bạch truật Việt Nam Phương pháp phân tích vừa xây dựng áp dụng tốt cho đối tượng Dược liệu nguồn gốc từ Trung quốc Từ đó, chúng tơi đề nghị tiếp tục nghiên cứu sâu thành phần hóa học tác dụng dược lý bạch truật Việt Nam Và nghiên cứu sau tập trung tăng số lượng mẫu để đưa giới hạn hàm lượng Atractynolide III tiêu chuẩn sở bạch truật trồng Việt Nam 25 ... thực : TRẦN NGỌC TUÂN NGHIÊN CỨU ĐỊNH LƯỢNG ATRACTYLENOLIDE III TRONG THÂN RỄ BẠCH TRUẬT (Atractylodes macrophala Koidz) BẰNG SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO BẮT CẶP DETECTOR DAD KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP... “ Nghiên cứu định lượng Atractylenolide III thân rễ bạch truật (Atractylodes macrophala Koidz) sắc ký lỏng hiệu cao bắt cặp detector DAD? ?? với hai mục tiêu đây: - Xây dựng phương pháp định lượng. .. lượng Atractylenolide III thân rễ Bạch truật phương pháp HPLC -DAD - Ứng dụng phương pháp để định lượng hàm lượng Atractylenolide III mẫu Bạch truật Việt Nam Trung Quốc Lựa chọn chấ t nghiên cứu Atractylenolide