Bài viết này thông báo kết quả ứng dụng phần mềm tin học Modde 5.0 để thiết kế và tối ưu hóa quy trình tổng hợp altretamin. Altretamin được tổng hợp từ phản ứng giữa cyanuric clorid với dimethylamin trong dung môi aceton và sử dụng NaOH làm chất trung hòa axít.
TẠP CHÍ Y - DƯỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 9-2014 TỐI ƢU HĨA QUY TRÌNH TỔNG HỢP ALTRETAMIN LÀM THUỐC ĐIỀU TRỊ UNG THƢ BẰNG PHẦN MỀM TIN HỌC MODDE 5.0 Vũ Bình Dương*; Phan Đình Châu** TãM T¾T Altretamin tổng hợp từ phản ứng cyanuric clorid với dimethylamin dung môi aceton sử dụng NaOH làm chất trung hòa axít Đã ứng dụng phần mềm Modde 5.0 để thiết kế thí nghiệm tối ưu hóa điều kiện quy trình tổng hợp altretamin Kết quả: tìm điều kiện tối ưu cho tổng hợp altretamin gồm: tỷ lệ mol chất tham gia phản ứng cyanuric clorid:DMA:NaOH 1:4,05:3,75; nhiệt độ phản ứng 49 C; thời gian phản ứng 3,5 Với điều kiện tối ưu tìm được, hiệu suất quy trình đạt 88,19% Sản phẩm altretamin thu đạt tiêu chất lượng theo Dược điển Mỹ 34 (USP 34) với phiếu kiểm nghiệm số 44G 566 ngày 26 tháng năm 2014 * Từ khóa: Altretamin; Tổng hợp hóa học; Tối ưu hóa Optimization of Synthesis Process of Altretamine Using Anticancer Medicines by Modde 5.0 Software Summary Altretamine was synthesized from the reaction between cyanuric chloride and dimethylamine in acetone solvent and NaOH as a neutralizer Modde 5.0 software was applied to design experiments and optimize conditions of altretamine synthesis The optimal molar ratio of materials in the reaction was CYA:DMA:NaOH (1:4.05:3.75) at 49 C temperature in 3.5 hours The total process performance achieved 88.19% in the optimal conditions Substance (altretamine) meets requirements of USP 34 (Certificate of analysis - No 44G566 dated 26 Aug 2014) * Key words: Altretamine; Synthesis; Optimization ĐẶT VẤN ĐỀ Altretamin có tên khoa học 2,4,6-tris (dimethylamino)-s-triazin chất kháng ung thư sử dụng điều trị loại ung thư như: ung thư phổi, ung thư vú, ung thư buồng trứng (là loại ung thư phổ biến), đặc biệt dùng điều trị ung thư buồng trứng tiến triển sau phương pháp trị liệu thất bại [1, 2, 5] Altretamin lưu hành với biệt dược hexalen (U.S Bioscience), hexastat (Roger Bellon), hexamethylmelamin (Rhone-Poulenc), thuốc coi độc so với thuốc hóa trị liệu khác sử dụng điều trị ung thư thuốc có cơng thức đơn giản, q trình tổng hợp giai đoạn, tính khả thi sản xuất cao [4, 6] * Học viện Quân y ** Trường Đại học Bách khoa Hà Nội Người phản hồi (Corresponding): Vũ Bình Dương (vbduong2978@gmail.com) Ngày nhận bài: 23/09/2014; Ngày phản biện đánh giá báo: 21/11/2014 Ngày báo đăng: 26/11/2014 Tạp chí y - d-ợc học quân số 9-2014 Ở nước ta, nhu cầu thuốc điều trị ung thư lớn, thuốc ung thư phải nhập ngoại với giá thành đắt, chi phí cho điều trị cao Hiện nay, Học viện Quân y nghiên cứu cải tiến quy trình tổng hợp altretamin với hiệu suất cao, thực đơn giản, dễ dàng triển khai sản xuất quy mô công nghiệp [3] Trong này, thông báo kết ứng dụng phần mềm tin học Modde 5.0 để thiết kế tối ưu hóa quy trình tổng hợp altretamin NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Nguyên liệu, hóa chất Cyanuric clorid, dimethylamin, aceton, cồn 96º, natri hydroxyd, altretamin chuẩn Thiết bị nghiên cứu - Cân điện tử Electronic Balance WTCF; cân phân tích Metller có độ xác 0,1 mg, tủ sấy Medda, máy khuấy từ gia nhiệt IKA RH Basic (Đức), máy cất quay Rotavapor R.200, bơm hút chân không, phễu lọc hút chân không Buchner - Dụng cụ thủy tinh đạt tiêu chuẩn dùng cho phòng thí nghiệm tổng hợp hữu (bình ba cổ 500 ml, 1.000 ml, sinh hàn hồi lưu, nhiệt kế, bình cầu 250 ml, bình gạn có nút mài 250 ml, bình định mức, pipet ống nghiệm…) - Bản mỏng silicagel Kieselgel 60 F254 (Merck), đèn soi sắc ký UV hai bước sóng 254 360 nm - Máy đo nhiệt độ nóng chảy Stuart, SMP-10 - Máy ghi phổ hồng ngoại (IR) GXPerkinElmer (Mỹ) - Máy ghi phổ khối lượng (MS) AutoSpec Primer Phòng Phân tích Cấu trúc, Viện Hóa học (Viện Khoa học Công nghệ Việt Nam) - Máy ghi phổ cộng hưởng từ hạt nhân ( H - NMR 13C - NMR) Bruker - AV500 Phòng Phân tích Cấu trúc, Viện Hóa học (Viện Khoa học Công nghệ Việt Nam) Phƣơng pháp nghiên cứu * Phương pháp tổng hợp tinh chế altretamin: Tổng hợp altretamin từ nguyên liệu cyanuric clorid (CyA) dimethylamin (DMA) dung môi aceton với NaOH làm chất xúc tác trung hòa axít theo sơ đồ phản ứng sau: CH3 Cl N N Cl N + (CH3)2NH Cl H3 C N CH3 N CH3 N + NaCl + H2O NaOH N Aceton H 3C Cyanuric clorid N N CH3 Altretamin Phản ứng tiến hành điều kiện nhiệt độ, tỷ lệ mol chất CyA:DMA:NaOH thời gian phản ứng khác (theo dõi sắc ký lớp mỏng) Hỗn hợp sau phản ứng cho vào nước đá để thu lấy tủa, lọc rửa tủa kết tinh lại cồn 960 [3] Sản phẩm kết tinh xác định nhiệt độ nóng chảy, sắc ký lớp mỏng, khối lượng tính hiệu suất phản ứng * Phương pháp thiết kế thí nghiệm tối ưu hóa: - Thiết kế thí nghiệm: Sử dụng phương pháp thiết kế theo mơ hình mặt hợp tử tâm với trợ TẠP CHÍ Y - DƯỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 9-2014 giúp phần mềm Modde 5.0 [7] để khảo sát yếu tố ảnh hưởng tới hiệu suất phản ứng bao gồm: nhiệt độ phản ứng, tỷ lệ mol DMA, tỷ lệ mol NaOH với mức khác mã hóa bảng Các yếu tố gọi biến độc lập hay tham số Hiệu suất phản ứng gọi biến phụ thuộc hay hàm số (Y%) Sử dụng phần mềm thiết kế tối ưu Modde 5.0 để thiết kế thí nghiệm, phần mềm đưa thí nghiệm cần tiến hành Bảng 1: Ký hiệu mức biển đầu vào Mức -1 Mức sở Mức Nhiệt độ phản ứng (t C) X1 40 49 58 Tỷ lệ mol DMA (mol) X2 3,75 4,5 Tỷ lệ mol NaOH (mol) X3 3,75 4,5 - Tối ưu hóa: Sau có kết làm thực nghiệm, sử dụng phẩn mềm Modde để phân tích ảnh hưởng biến độc lập đến hiệu suất phản ứng (biến phụ thuộc) việc thiết lập phương hồi quy bậc mối tương quan biến phụ thuộc biến độc lập Phương trình có dạng: Y = b0 + b1X1 + b2X2 + b3X3 + b1(X1)2 + b2(X2)2 + b3(X3)2 + b1,2,3(X1 X2 X3 ) Ngoài ra, phần mềm đưa dự đốn điều kiện tối ưu để hiệu suất phản ứng cao (Y = max) Sau thu điều kiện tối ưu từ phần mềm, làm lại thí nghiệm để thẩm định kết tối ưu * Phương pháp xác định độ tinh khiết cấu trúc hóa học: - Sơ kiểm tra độ tinh khiết sản phẩm sắc ký lớp mỏng đo nhiệt độ nóng chảy - Xác định cấu trúc altretamin tổng hợp dựa vào phân tích phổ tử ngoại (UV), phổ hồng ngoại (IR) phổ khối lượng (MS), phổ cộng hưởng từ hạt nhân (1H - NMR 13C -NMR) KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ BÀN LUẬN KÕt qu¶ thiÕt kÕ thÝ nghiÖm thùc nghiÖm Sau đưa biến độc lập vào phần mềm Modde 5.0, phần mềm đưa kết thiết kế gồm 17 thí nghiệm Tiến hành 17 thí nghiệm tổng hợp altretamin theo thiết kế Sau thí nghiệm, cân xác định khối lượng sản phẩm tính hiệu suất phản ứng T¹p chÝ y - d-ợc học quân số 9-2014 Bng 2: Kt thiết kế thí nghiệm thực nghiệm thu Đ STT X1 X2 X3 X1 (X2) (X3) (Y%) -1 -1 -1 40 3 54,95 -1 -1 58 3 57,52 -1 -1 40 4.5 56,34 1 -1 58 4.5 60,92 -1 -1 40 4.5 78,94 -1 58 4.5 80,07 -1 1 40 4.5 4.5 85,35 1 58 4.5 4.5 87,91 -1 0 40 3.75 3.75 84,61 10 0 58 3.75 3.75 88,06 11 -1 49 3.75 79,19 12 49 4.5 3.75 88,03 13 0 -1 49 3.75 61,28 14 0 49 3.75 4.5 84,46 15 0 49 3.75 3.75 86,09 16 0 49 3.75 3.75 85,88 17 0 49 3.75 3.75 86,25 Nhập kết thực nghiệm vào phần mềm Modde 5.0, nhận phương trình hồi quy sau: Y = 86,17 + 1,43X1 + 2,79X2 + 12,57X3 - 2,63X22 - 13,37 X23 + 1,18X2X3, Phương trình có hệ số tương quan R2 = 0,996 Điều chứng tỏ có mèi tương quan chặt chẽ biến đầu đầu vào theo phương trình hồi quy tìm Phần mềm đưa mặt đáp ảnh hưởng biến độc lập (yếu tố khảo sát) tới hiệu suất phản ứng Hình 1: Mặt đáp tối ưu thực nghiệm yếu tố đầu vào tới hiệu suất 10 T¹p chÝ y - d-ợc học quân số 9-2014 Phõn tớch nh hng yếu tố kết hợp yếu tố độc lập cho thấy: tăng nhiệt độ hiệu suất phản ứng tăng, tăng không nhiều Khi tăng tỷ lệ mol NaOH, hiệu suất tăng, tăng tới tỷ lệ 3,75 hiệu suất tăng, chí giảm chút Tỷ lệ mol DMA ảnh hưởng nhiều tới hiệu suất phản ứng Khi tăng tỷ lệ tới khoảng 4, hiệu suất tăng nhanh, tỷ lệ hiệu suất giảm Trong yếu tố khảo sát, mức độ ảnh hưởng tới hiệu suất xếp từ tới nhiều sau: nhiệt độ < tỷ lệ NaOH < DMA Chạy trương trình tổi ưu hóa phần mềm Modde với kết từ 17 mẻ thí nghiệm thu điều kiện tối ưu cho hiệu suất cao là: nhiệt độ (X1) = 490C; tỷ lệ mol DMA:CYA (X2) = 4,05; tỷ lệ mol NaOH:CYA (X3) = 3,75 Khi đó, hiệu suất theo tính tốn phần mềm 88,06% Tiến hành thực nghiệm với điều kiện tối ưu để kiểm chứng lại kết dự đoán phần mềm Modde 5.0 đưa Bảng 3: Kết thực nghiệm kiểm tra kết tối ưu hóa (%) Dự đốn (1) Thực nghiệm (2) 88,06 88,52 171 - 173 88,06 88,01 171 - 173 88,06 87,65 171 - 173 88,06 87,99 171 - 173 88,06 88,34 171 - 173 88,06 88,61 171 - 173 X 88,06 88,19 p p1, > 0,05 (0C) Kết thực nghiệm tiến hành phản ứng theo điều kiện dự đoán phần mềm tối ưu cho thấy hiệu suất phản ứng đạt 88,19% (dự đoán phần mềm 88,06%) Như vậy, khác biết dự đoán phần mềm thực nghiệm khơng có ý nghĩa thống kê với p > 0,05 Có thể sử dụng điều kiện tối ưu mà phần mềm đưa là: tỷ lệ mol CYA:DMA: NaOH = 1:4,05:3,75, phản ứng thực 3,5 giờ, nhiệt độ phản ứng 49oC Thiết lập quy trình sản suất Với điều kiện tối ưu hóa, chúng tơi xây dựng quy trình tổng hợp altretamin quy mơ phòng thí nghiệm sau: cho 9,4 g (0,05 mol) cyanuric clorid vào bình ba cổ dung tích 500 ml, có lắp sinh hàn, nhiệt kế, phểu nhỏ giọt, nồi cách thủy, máy khuấy từ, cho vào 40 ml aceton, khuấy 10 phút, tiếp cho thêm vào dung dịch 23 ml dimetylamin 40% (0,205 mol) Làm lạnh nước đá, vừa khuấy vừa cho 7,5 g (0,1875 mol) natri hydroxyd vào, khuấy 10 phút, sau đun hồi lưu 30 phút Sau phản ứng kết thúc, vừa khuấy vừa cho nước đá để thu lấy tủa, tinh chế lại sản phẩm vào hỗn hợp phản ứng 120 ml nước cất - đá, tủa tạo khuấy tiếp 30 phút, sau lọc qua phễu Buchner lấy sản phẩm thơ Kết tinh lại tồn sản phẩm thơ etanol 96o, sấy khô sản phẩm 70oC tủ hút chân không giờ, thu 9,37 g sản phẩm altretamin, tinh thể hình kim trắng, nhiệt độ nóng chảy 172 - 174oC Hiệu suất 89,19% 11 T¹p chí y - d-ợc học quân số 9-2014 Kết xác định độ tinh khiết, nhận dạng cấu trúc hóa học kiểm nghiệm sản phẩm Kết xác định độ tinh khiết mẫu thu gồm: - Đo điểm chảy: nhiệt độ chảy sản phẩm altretamin mẻ khác dao động từ 171 - 174oC UV, λmax (nm) IR (KBr), υmaxcm δs max cm-1 - Sắc ký mỏng: sơ kiểm tra sắc ký lớp mỏng so với chất chuẩn với hệ dung môi khai triển (toluen:AcOEt:CHCl 3:MeOH 6:1:4:3) cho vết gọn (Rf = 0,769) lên ngang vết altretamin chuẩn, thị rõ ánh sáng đèn tử ngoại t¹i bước sóng 254 nm - Số liệu phân tích phổ (bảng 4): 226 -1 226 2858 (υCaromatic-N-CH3); 2278 (δsC-H/N- 2866 (υCaromatic-N-CH3); 2278 (δsC-H/N- CH3), 1527 CH3), 1528 (υC=N); 1385 (δsCH3); 1211 (υC=N); 1386 (δsCH3); 1211 (υC-N) (υC-N) EI MS (m/z) 210 (M+); 195 [M+-CH3]; 167 [M+-N(CH3)2]; 210 (M+); 195 [M+-CH3]; 167 [M+-N(CH3)2]; 152[195152[195-N(CH3)2]; 96[167-NH=C-N(CH3)2]; N(CH3)2]; 96[167-NH=C-N(CH3)2]; 81[152-NH=C81[152-NH=C-N(CH3)2] N(CH3)2] 3,08 (s, 18H, 6-CH3) 3,09 (s, 18H, 6-CH3) 165,66(s,3C,Ctriazin); 35,65(s,6C,6CH3) 165,66(s,3C,Ctriazin); 35,65(s,6C,6CH3) H-NMR (ppm) 13 C-NMR (ppm) Từ kết đo diểm chảy, phân tích sắc ký mỏng, phân tích phổ IR, MS,1H - NMR 13C - NMR hợp chất tổng hợp chất chuẩn cho phép kết luận altretamin tổng hợp tinh khiết có cấu trúc dự kiến - Chất lượng altretamin tổng hợp được: kiểm nghiệm theo Dược điển Mỹ 2010 (USP 34) Kết mẫu gửi kiểm nghiệm đạt yêu cầu chất lượng theo Dược điển Mỹ 2010 (USP 34), Phiếu kiểm nghiệm số 44G 566 ngày 26 tháng năm 2014 Viện Kiểm nghiệm Thuốc Trung ương KẾT LUẬN Đã ứng dụng phần mềm Modde 5.0 để thiết kế thí nghiệm tối ưu hóa điều kiện quy trình tổng hợp altretamin Kết quả: tìm điều kiện tối ưu cho tổng hợp altretamin gồm: tỷ lệ mol chất tham gia phản ứng cyanuric clorid:DMA:NaOH 1:4,05:3,75; nhiệt độ phản ứng 490C; thời gian phản ứng 3,5 Với điều kiện tối ưu, hiệu suất 12 quy trình đạt 88,19% Sản phẩm altretamin thu đạt tiêu chất lượng theo Dược điển Mỹ 34 (USP 34) với phiếu kiểm nghiệm số 44G 566 ngày 26 tháng năm 2014 TÀI LIỆU THAM KHẢO Nguyễn Bá Đức Hóa chất điều trị ung thư NXB Y học Hà Nội 2003, tr.130-137 Trịnh Văn Quang Bách khoa toàn thư, ung thư học NXB Y học 2002, tr.69-70 TẠP CHÍ Y - DƯỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 9-2014 Phan Đình Châu, Vũ Bình Dương, Nguyễn Thị Thu Hằng, Bùi Thị Thu Hà Nghiên cứu quy trình sản xuất altretamin thuốc điều trị ung thư Tạp chí Dược học 2014, số 462, tr.2-6 Đinh Thị Thanh Hải, Hoàng Thu Trang Nghiên cứu tổng hợp altretamin làm thuốc điều trị ung thư Tạp chí Dược học 2010, 407, tr.25-27 Goodman and Gilman’s The Pharmacological th basis of Therapeutics 10 Ed MC Grow Hill Inc New York, London, Seol, Tokyo, Singapore, Sydney, Toronto 2001, Vol II, Chapter 52 Kaiser D W et al J Am Chem Soc 1952, 73, pp.2984-2986 Sartorius Stedim Biotech Company User guide Bio Pat Modde 5.0 2013 13 ... xuất altretamin thuốc điều trị ung thư Tạp chí Dược học 2014, số 462, tr.2-6 Đinh Thị Thanh Hải, Hoàng Thu Trang Nghiên cứu tổng hợp altretamin làm thuốc điều trị ung thư Tạp chí Dược học 2010,... KHẢO Nguyễn Bá Đức Hóa chất điều trị ung thư NXB Y học Hà Nội 2003, tr.130-137 Trịnh Văn Quang Bách khoa toàn thư, ung thư học NXB Y học 2002, tr.69-70 TẠP CHÍ Y - DƯỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 9-2014 Phan...Tạp chí y - d-ợc học quân số 9-2014 Ở nước ta, nhu cầu thuốc điều trị ung thư lớn, thuốc ung thư phải nhập ngoại với giá thành đắt, chi phí cho điều trị cao Hiện nay, Học viện Quân y nghiên