Mục tiêu nghiên cứu của bài viết nhằm thiết lập kỹ thuật multiplex PCR phục vụ đánh giá và kiểm soát nhiễm trong sinh thiết phôi phục vụ sàng lọc và chẩn đoán phôi tiền làm tổ. Mời các bạn cùng tham khảo.
TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ CHUYÊN ĐỀ HÌNH THÁI HỌC-2017 ĐÁNH GIÁ VÀ KIỂM SỐT NHIỄM ADN TRONG SINH THIẾT PHƠI PHỤC VỤ CHẨN ĐỐN VÀ SÀNG LỌC TIỀN LÀM TỔ Hoàng Văn Lương*; Nguyễn Duy Bắc*; Trần Ngọc Anh* Nguyễn Thanh Tùng*; Nguyễn Văn Điều*; Nguyễn Duy Ánh** Nguyễn Thị Sim**; Phạm Đức Minh***; Đàm Linh Phương*; Đặng Tiến Trường** TÓM TẮT Mục tiêu: thiết lập kỹ thuật multiplex PCR phục vụ đánh giávà kiểm sốt nhiễm sinh thiết phơi phục vụ sàng lọc chẩn đốn phơi tiền làm tổ Đối tượng phương pháp: xây dựng phản ứng multiplex PCR mẫu gADN; tiến hành đánh giá 96 tế bào sinh thiết 96 mẫu dung dịch rửa tương ứng Kết quả: thiết lập phản ứng multiplex PCR đủ mạnh; kết đánh giá nhiễm ADN cho thấy 13,54% số mẫu media blank bị nhiễm 87,5% số mẫu tế bào sinh thiết phơi có chứa ADN Kết luận: thiết lập phản ứng multiplex PCR đủ mạnh, đánh giá trạng nhiễm ADN ngoại lai sinh thiết sàng lọc trước chuyển phôi đơn giản hiệu Chất lượng q trình sinh thiết kiểm sốt nhiễm cải thiện đáng kể * Từ khóa: Kiểm sốt nhiễm; Sinh thiết phôi; Multiplex PCR Access and Control DNA Contamination in Embryo Biopsy Procedure for Preimplantation Genetic Diagnosis/Screening Summary Objectives: To establish a multiplex PCR method for contamination and quality control of embryo biopsy in PGD/PGS Subjects and methods: Establish multiplex PCR on gDNA; evaluation of embryo biopsy on 96 single cells along with 96 media blank samples biopsied from the same embryos Results: Established efficiency multiplex PCR; evaluation of embryo biopsy showed that 13.54% of media blank samples were contaminated and 87.5% of total single cells samples contained DNA Conclusion: Successfully established a simple but effective DNA contamination and quality control method by multiplex PCR in embryo biopsy and PGS The quality of embryo biopsy procedure and DNA were approval * Keywords: DNA contamination control; Embryo biopsy; Multiplex PCR ĐẶT VẤN ĐỀ giá tình trạng bất thường di truyền Trong chẩn đoán sàng lọc trước cấp độ gen đến toàn nhiễm sắc thể; chuyển sinh (PGD/S - Preimplantation Genetic lựa chọn phôi không bất thường Disgnosis/Screening), phôi đánh trước chuyển vào tử cung có thai * Học viện Quân y ** Bệnh viện Phụ sản Hà Nội ** Trường Đại học Khoa học Công nghệ Hà Nội Người phản hồi (Corresponding): Đặng Tiến Trường (truongdtvmmu@gmail.com) Ngày nhận bài: 27/07/2017; Ngày phản biện đánh giá báo: 30/08/2017 Ngày báo đăng: 05/09/2017 219 TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ CHUYÊN ĐỀ-2017 Các phôi tạo từ quy trình thụ tinh ống nghiệm (IVF-In vitro fertilization) sinh thiết thu nhận tế bào phơi phục vụ phân tích di truyền nhiều phương pháp, hầu hết có giai đoạn khuếch đại phản ứng chuỗi (PCR - Polemerase Chain Reaction) Đặc trưng PCR PGD PGS cực nhạy nên dễ nhiễm ADN ngoại lai khả alen (ADO - allele Dropout) [7, 9] Trong đó, nhiễm ADN ngoại lairất khó kiểm soát dẫn đến chẩn đoán sai Nguồn ADN ngoại lai phong phú, chủ yếu xảy giai đoạn trước tiến hành PCR, sinh thiết phơi rửa tế bào phơi [10]; ADN ngoại nhiễm từ kỹ thuật viên sinh thiết phôi ADN khu vực sinh thiết, rửa tế bào Mẫu media blank xuất ADN q trình sinh thiết phôi không thành công khiến tế bào bị vỡ làm thất thoát ADN vào giọt rửa Bên cạnh đó, thành cơng sinh thiết rửa tế bào đánh giá sinh thiết tế bào, không bị vỡ; rửa tế bào đảm bảo không bị nhiễm ADN ngoại lai Hiện nay, có nhiều phương pháp kiểm sốt nhiễm: khơng sử dụng lại vật tư cho lần sinh thiết phôi tiếp theo; mặc đồ bảo hộ, rửa tế bào tủ hút vô trùng đặt phòng riêng biệt [7]; lau bề mặt thiết bị khử ADN [6]; sử dụng đầu có cột lọc; dùng đèn cực tím để khử nhiễm tủ hút [1, 2, 8, 3] Tuy nhiên, phương pháp chưa thể khẳng định có xuất ADN ngoại nhiễm hay không? Đến nay, trung tâm PGD giới tiến hành thử nghiệm đánh giá kết sinh thiết rửa tế bào phôi trước tiến hành PGD lâm sàng nhằm đảm bảo chất lượng kết chẩn đoán [4] Ở Việt Nam, có số báo cáo chẩn đốn trước chuyển phơi chưa thấy có nội dung đề cập vấn đề Nghiên cứu này, kỹ thuật multiplex PCR đủ nhạy thiết lập thực hành đánh giá q trình sinh thiết phơi, rửa tế bào thành công không bị nhiễm ADN ngoại lai VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Vật liệu nghiên cứu - ADN tổng số đối tượng nam, nữ; mẫu tế bào phôi mẫu dung dịch rửa cuối mẫu tế bào phôi tương ứng - Primer tổng hợp IDT (Mỹ) (bảng 1); KOH (Sigma); tricine (Sigama); 2x PCR Master mix Solution i-Taq, PBS (Sigma), nước tinh khiết (Invitrogen), agarose (Merk); Redsafe (Intron) - Thiết bị nghiên cứu: máy PCR ProFlex (Thermo Fisher Scientific, Mỹ), máy ly tâm lạnh Mikro 22R (Heltich, Đức), máy điện di (Cleaver Scientific, Anh), máy chụp ảnh gel OmniDOCi (Cleaver Scientific, Anh) thiết bị khác Phòng Phân tích ADN, Bộ môn Giải phẫu, Học viện Quân y Bảng 1: Thông tin cặp mồi phản ứng multiplex PCR o Tên mồi Trình tự 5’-3’ Tm ( C) FIIX-4F [5] ATGGGCTTGGACTTGGTATG 60,4 FIIX-4R [5] AGCAGCTCCTCACCAGGAT 62,3 DYS14F [11] GGGCCAATGTTGTATCCTTCTC 62,7 DYS14R [11] GCCCATCGGTCACTTACACTTC 64,5 220 Sản phẩm 318 bp 84 bp TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ CHUYÊN ĐỀ HÌNH THÁI HỌC-2017 Phƣơng pháp nghiên cứu * Giai đoạn tối ưu hóa: xác định nhiệt độ gắn mồi tối ưu cặp mồi phản ứng multiplex PCR 20 ng ADN toàn hệ gen, sau tiến hành phản ứng multiplex PCR 200 pg 20 pg ADN toàn hệ gen để xác định chu trình nhiệt phù hợp đánh giá khả thành công phản ứng multiplex PCR mẫu tế bào sinh thiết từ phôi * Giai đoạn đánh giá quy trình sinh thiết phơi: tiến hành phản ứng multiplex PCR mẫu tế bào sinh thiết từ phôi mẫu media blank tương ứng nhằm xác định xuất ADN Thành phần phản ứng multiplex PCR thể tích 25 µl gồm: 1x PCR Master mix Solution; 0,5 µM mồi cặp FIIX-4; 0,75 µM mồi cặp DYS14, 20 pg gADN (chứng dương) mẫu tế bào µl dung dịch PBS ly giải 1,5 µl KOH 0,6M; trung hòa 1,5 µl tricine 0,6M; nước tinh khiết tùy chỉnh để phù hợp với thể tích phản ứng 25 µl Q trình gồm lần đánh giá, lần đánh giá 24 mẫu tế bào sinh thiết từ phôi với 24 mẫu media blank tương ứng Tế bào sau sinh thiết phôi đặt 2,5 µl dung dịch PBS vào ống PCR, sau bổ sung 1,5 µl KOH 0,6 M, ủ 65oC 10 phút để ly giải tế bào sau bổ sung 1,5 µl trisine 0,6 M để trung hòa * Địa điểm thời gian nghiên cứu: - Trung tâm Công nghệ Phôi, Học viện Quân y; Bệnh viện Phụ sản Hà Nội; Bệnh viện Phụ sản Trung ương - Thời gian: 12 - 2016 đến - 2017 * Đạo đức nghiên cứu: Nghiên cứu Hội đồng Đạo đức nghiên cứu y sinh Học viện Quân y phê duyệt KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ BÀN LUẬN Kết tối ƣu hóa phản ứng multiplex PCR mẫu ADN (Hình 1: Ảnh minh họa kết tối ưu hóa nhiệt độ gắn mồi DYS14 ((-): chứng âm ; 55, 60, 61, 62, 65 băng sản phẩm phản ứng Ta 55oC, 60oC, 61 oC, 62 oC, 65oC; M50, M100: Marker 50 bp, 100 bp) 221 TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ CHUYÊN ĐỀ-2017 Hình 2: Ảnh minh họa kết tối ưu hóa nhiệt độ gắn mồi FIIX-4 ((-): chứng âm ; 55, 60, 61, 62, 65 băng sản phẩm phản ứng Ta 55oC, 60oC, 61 oC, 62 oC, 65oC; M100: Marker, 100 bp) Để thiết lập phản ứng PCR đủ nhạy nhằm xác định có mặt đoạn ADN ngoại lai, lượng ADN tương đương một vài tế bào, nghiên cứu sử dụng cặp mồi DYS14 có amplicon Cặp mồi FIIX-4 - Xác định Ta primer Ta phản ứng multiplex PCR Hình hình cho kết nhiệt độ gắn mồi tối ưu cặp mồi DYS14 FIIX4 60oC Hình 3: Hình ảnh minh họa phản ứng multiplex PCR mẫu ADN có nồng độ 10 pg/µl khác (F1-F5: sản phẩm phản ứng PCR 20 pg ADN nữ; M1-M5: sản phẩm phản ứng PCR 20 pg ADN nữ; (-): chứng âm; M100: marker 100 bp) 222 TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ CHUYÊN ĐỀ HÌNH THÁI HỌC-2017 Có nhiều yếu tố ảnh hưởng tới kết phản ứng PCR nhiệt độ gắn mồi, thời gian gắn mồi, thời gian kéo dài chuỗi, hoạt động enzym, nồng độ dNTP, nồng độ Mg2+…Khi tối ưu hóa phản ứng PCR, cần phải tối ưu hóa tất yếu tố để đạt kết tốt Tuy nhiên, công việc nhiều thời gian, cơng sức hóa chất Vì vậy, thực tế tối ưu hóa phản ứng PCR thường tiến hành lựa chọn thành phần phản ứng tiêu chuẩn tối ưu hóa nhiệt độ gắn mồi (Ta) Nghiên cứu này, sử dụng 2x Master mix Solution INtRON để tiết kiệm thời gian chi phí tối ưu hóa yếu tố liên quan tới thành phần phản ứng Ta phản ứng phụ thuộc vào nhiệt độ nhiệt độ nóng chảy (Tm) mồi thường Tm từ 5-10oC Căn vào Tm (bảng 1), tiến hành thử nghiệm tối ưu hóa dải nhiệt 55 - 65oC Sau đó, tiến hành phản ứng multiplex PCR mẫu ADN có nồng độ 10 ng/µl giảm dần xuống 100 pg/µl, 20 pg/µl kết hợp với điều chỉnh chu trình nhiệt phù hợp cho phản ứng multiplex PCR, kết thể hình 3; mẫu g ADN nữ (F1 đến F5) xuất sản phẩm có kích thước 318 bp; xuất băng (84 bp 318 bp) mẫu gADN nam (M1 đến M5) Qua nhiều thử nghiệm khác, xác định thành phần phản ứng chu trình nhiệt phẩn ứng bảng Bảng 1: Chu trình nhiệt tối ưu hóa phản ứng multiplex PCR Bắt đầu Biến tính Gắn mồi Kéo dài Kết thúc Bảo quản 95 95 60 72 72 11 Thời gian 15 phút 20 giây 30 giây 20 giây phút +∞ Số chu kỳ 1 o Nhiệt độ ( C) 45 Kết thực nghiệm tế bào sinh thiết từ phơi dƣ Q trình đánh giá gồm giai đoạn khảo sát, giai đoạn có hiệu chỉnh bổ sung biện pháp để làm tăng tỷ lệ thu tế bào giảm tỷ lệ nhiễm ADN ngoại lai Hình 3: Hình ảnh minh họa kết kiểm soát ADN ngoại nhiễm đánh giá q trình sinh thiết phơi lần (M50: marker 50 bp; 1AN, 2AN…: mẫu media blank phôi số 1, 2…; 1A, 2A: mẫu chứa tế bào sinh thiết từ phôi 1, 2…; NC (negative control): đối chứng âm; PC (positive control): đối chứng dương) 223 TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ CHUYÊN ĐỀ-2017 Mỗi giai đoạn tiến hành thí nghiệm 24 mẫu tế bào sinh thiết từ phôi dư 24 mẫu dung dịch rửa giọt rửa cuối tương ứng với phôi Theo lý thuyết, tất mẫu media blank đối chứng âm khơng có sản phẩm multiplex PCR, mẫu chứa tế bào sinh thiết từ phôi xuất sản phẩm cặp mồi FIIX-4 số mẫu có sản phẩm cặp mồi DYS14, hệ gen tế bào có nhiễm sắc thể Y Các mẫu phát sản phẩm cặp mồi DYS14 FIIX-4 kết luận có chứa ADN Hình 4: Hình ảnh minh họa kết kiểm sốt ADN ngoại nhiễm đánh giá q trình sinh thiết phơi lần (M50: marker 50 bp; 73AN, 74AN…: mẫu media blank phôi số 73, 74…; 73A, 74A: mẫu chứa tế bào sinh thiết từ phôi 73, 74…; NC (negative control): đối chứng âm; PC (positive control): đối chứng dương) Mẫu media blank tế bào sinh thiết từ phơi số 2, có sản phẩm cặp mồi FIIX-4, mẫu media blank phôi số 73, 74, 76 có sản phẩm cặp mồi DYS14, chứng tỏ có xuất ADN ngoại nhiễm Đối chứng âm phản ứng multiplex PCR đánh giá trình sinh thiết phơi âm tính, khơng phát có sản phẩm phản ứng multiplex PCR nên loại trừ trường hợp phản ứng bị nhiễm trình làm multiplex PCR kiểm sốt nhiễm Q trình sinh thiết phôi thành công mẫu chứa tế bào sinh thiết từ phôi phải chứa tế bào Điều khẳng định phát có sản phẩm cặp mồi DYS14 FIIX-4 mẫu Bảng 1: Kết kiểm soát nhiễm ADN ngoại lai thu tế bào 96 ống chứa tế bào sinh thiết từ phôi mẫu media blank tương ứng Mẫu chứa tế bào Mẫu media blank (24) (24) (24) (24) Tổng (96) (24) (24) (24) Số mẫu chứa ADN 18 20 20 22 84 2 13 Tỷ lệ chứa AND (%) 75,00 83,33 8,33 8,33 13,54 Giai đoạn (n) 83,33 91,67 87,50 20,83 16,67 Tổng (96) (24) Trong số 96 mẫu media blank tế bào sinh thiết này, tổng cộng 84/96 mẫu tương ứng với tỷ lệ 87,5% số tế bào sinh thiết phơi có chứa ADN 13/96 mẫu media 224 TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ CHUYÊN ĐỀ HÌNH THÁI HỌC-2017 blank tương ứng với tỷ lệ 13,54% mẫu bị nhiễm ADN ngoại lai Tuy nhiên, qua lần khảo sát, kết sinh thiết phôi có cải thiện đáng kể: tăng tỷ lệ sinh thiết phôi thành công (lần lượt 75%; 83,33%; 83,33%; 91,67%) giảm số lần sinh thiết bị nhiễm ADN ngoại lai (lần lượt 20,83%; 16,67%; 8,33%; 8,33%; 13,54%) KẾT LUẬN Thiết lập phản ứng multiplex PCR đủ nhạy, đánh giá tình trạng nhiễm ADN ngoại lai sinh thiết sàng lọc trước chuyển phôi đơn giản hiệu Kết thu tế bào kiểm soát nhiễm trình sinh thiết rửa tế bào phôi cải thiện đáng kể TÀI LIỆU THAM KHẢO Agrawal V, Roy N Contaminating insert degradation by preincubation colony PCR: a method for avoiding false positives in transformant screening Anal Biochem 2008, 375 (1), pp.159-161 Champlot S, Berthelot C, Pruvost M, Bennett E.A, Grange T, Geigl EM An efficient multistrategy DNA decontamination procedure of PCR reagents for hypersensitive PCR applications PLoS One 2010, (9) Dallas-Yang Q, Jiang G, Sladek F.M Avoiding false positives in colony PCR Biotechniques 1998, 24 (4), pp.580-582 Harper J.C, Sengupta S, Vesela K, Thornhill A, Dequeker E, Coonen E, Morris MA Accreditation of the PGD laboratory Hum Reprod, 2010, 25 (4), pp.1051-1065 Machado F.B, Medina-Acosta E Highresolution combined linkage physical map of short tandem repeat loci on human chromosome band Xq28 for indirect haemophilia A carrier detection Haemophilia 2009, 15 (1), pp.297-308 Prince A.M, Andrus L PCR: how to kill unwanted DNA Biotechniques, 1992, 12 (3), pp.358-360 Stern HJ Preimplantation genetic diagnosis: prenatal testing for embryos finally achieving its potential Journal of clinical medicine 2014, (1), pp.280-309 Tamariz J, Voynarovska K, Prinz M, Caragine T The application of ultraviolet irradiation to exogenous sources of DNA in plasticware and water for the amplification of low copy number DNA Journal of forensic sciences 2006, 51 (4), pp.790-794 Thornhill A.R, Snow K Molecular diagnostics in preimplantation genetic diagnosis J Mol Diagn 2002, (1), pp.11-29 10 Thornhill A.R, Snow K Molecular diagnostics in preimplantation genetic diagnosis The Journal of molecular diagnostics: JMD 2002, (1), 11 11 Zimmermann B, El-Sheikhah A, Nicolaides K, HOLzGREVE W., Hahn S Optimized real-time quantitative PCR measurement of male fetal DNA in maternal plasma Clinical chemistry 2005, 51 (9), pp.1598-1604 225 ... tiến hành PCR, sinh thiết phơi rửa tế bào phơi [10]; ADN ngoại nhiễm từ kỹ thuật viên sinh thiết phôi ADN khu vực sinh thiết, rửa tế bào Mẫu media blank xuất ADN q trình sinh thiết phơi khơng... cơng khiến tế bào bị vỡ làm thất ADN vào giọt rửa Bên cạnh đó, thành cơng sinh thiết rửa tế bào đánh giá sinh thiết tế bào, không bị vỡ; rửa tế bào đảm bảo không bị nhiễm ADN ngoại lai Hiện nay,... multiplex PCR đủ nhạy thiết lập thực hành đánh giá trình sinh thiết phôi, rửa tế bào thành công không bị nhiễm ADN ngoại lai VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Vật liệu nghiên cứu - ADN tổng số đối tượng