Mục tiêu nghiên cứu của bài viết nhằm chiết xuất, phân lập và tinh chế palmatin từ dược liệu Hoàng đằng để làm chất chuẩn, chất đối chiếu phục vụ công tác kiểm tra đánh giá chất lượng dược liệu và các chế phẩm đông dược.
Tạp chí y - dợc học quân số chuyên đề dƯợC-2016 NGHIấN CU CHIT XUT, PHN LP V TINH CHẾ PALMATIN TỪ DƯỢC LIỆU HOÀNG ĐẰNG (Caulis et Radix Fibraureae) ĐỂ LÀM CHẤT CHUẨN Lê Trường Minh*; Nguyễn Minh Chính*; Phạm Văn Hiển* TĨM TẮT Mục tiêu: chiết xuất, phân lập tinh chế palmatin từ dược liệu Hoàng đằng để làm chất chuẩn, chất đối chiếu phục vụ công tác kiểm tra đánh giá chất lượng dược liệu chế phẩm đông dược Phương pháp: khảo sát lựa chọn phương pháp chiết xuất alcaloid toàn phần, phân lập phương pháp trao đổi dung môi, tinh chế sắc ký cột Kiểm tra nhận dạng cấu trúc hóa học chất tinh chế phổ UV-Vis, MS NMR Đánh giá độ tinh khiết dựa vào kết kiểm tra điểm chảy HPLC Kết quả: chiết xuất, phân lập tinh chế palmatin từ Hoàng đằng Nhận dạng hợp chất tinh chế phổ UV-Vis, MS NMR cho thấy: chất tinh chế phù hợp với liệu chuẩn palmatin Độ tinh khiết palmatin tinh chế xác định HPLC (97,31%) đo điểm chảy Kết luận: nghiên cứu chiết xuất, phân lập tinh chế palmatin xây dựng liệu chuẩn hợp chất tinh chế để làm chất chuẩn, chất đối chiếu phục vụ kiểm nghiệm dược liệu chế phẩm đông dược * Từ khóa: Palmatin; Hồng đằng; Chiết xuất; Phân lập; Tinh chế Extract and Isolation of High Purity Palmatin from Caulis et Radix Fibraureae Summary Objectives: To extract, isolate and purify palmatin from Caulis et Radix Fibraureae to use as a reference substance for quality control of materials and finished products in pharmaceuticals Methods: Investigate and choose the extract method of total alcaloids From this mixture, isolating palmatin by solvent-solvent exchange Finally, purity palmatin was isolated by column chromatography using silicagel Purity palmatin was determined structure by spectrometry of UV-Vis, MS and NMR Concentration and purity of palmatin were identified by HPLC and melting point measurement Results: It was extracted, isolated and purified palmatin from Caulis et Radix Fibraureae and established data of purified palmatin This compound was determined structure by spectrometry of UV-Vis, MS and NMR showed that complied to data of standard palmatin Purity of palmatil was checked by HPLC observed concentration of 97,31% Conclusions: Palmatin from Caulis et Radix Fibraureae was extracted, isolated and purified Data of purified palmatin was established, that potential to apply in quality control of materials and finished products in pharmaceuticals * Key words: Palmatin; Caulis et Radix Fibraureae; Reference substance; Isolation; Purify * Học viện Quân y Người phản hồi (Corresponding): Nguyễn Minh Chính (minhphar8@gmail.com) Ngày nhận bài: 20/07/2016; Ngày phản biện đánh giá báo: 01/09/2016 Ngày báo ng: 12/09/2016 80 Tạp chí y - dợc học quân số chuyên đề dợC-2016 T VN Hong ng (Caulis et Radix Fibraureae), họ Tiết dê (Menispermaceae) dược liệu quý chứa hoạt chất palmatin [1, 2, 3] Tiêu chuẩn dược liệu có dược điển, việc định lượng dừng lại mức xác định tổng alcaloid toàn phần [4] Để góp phần phục vụ cơng tác kiểm tra, đánh giá bảo đảm chất lượng dược liệu này, xây dựng tiêu định lượng palmatin yêu cầu quan trọng Để thực điều đó, cần phải có chất chuẩn palmatin đối chiếu Ở nước ta nay, chuẩn palmatin chưa sản xuất phải nhập ngoại với giá thành cao [5, 6] Xuất phát từ sở lý luận thực tiễn, chiết xuất phân lập palmatin với hàm lượng cao, bước đầu xây dựng sở liệu hợp chất phục vụ thiết lập chất chuẩn đánh giá chất lượng dược liệu chế phẩm đông dược chứa palmatin NGUYÊN LIỆU, THIẾT BỊ VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Nguyên liệu thiết bị - Dược liệu Hồng đằng Cơng ty Cổ phần Dược phẩm Trang Thiết bị Y tế Hòa Bình cung cấp, đạt tiêu chuẩn DĐVN IV - Palmatin chuẩn phòng thí nghiệm (Trung Quốc) Công ty Bioscope cung cấp: số lô 2013825, hạn sử dụng 14 - - 2015, hàm lượng 98,56% - Hệ thống sắc ký lỏng hiệu cao Water 2695E, bơm mẫu tự động, kênh dung môi Detector PDA Water 996 quét phổ rộng Cột sắc ký Gemini Phenomenex C18 250 x 4,6 mm, µm, máy đo nhiệt độ nóng chảy Stuart, SMP-10 (Đức), máy khối phổ MS 5989 B (Hewlett Pakard), phổ NMR ghi máy Bruker Advance 500 MHz Hóa chất dung mơi, thiết bị phân tích khác đạt tiêu chuẩn phòng thí nghiệm Phương pháp nghiên cứu * Khảo sát lựa chọn phương pháp chiết xuất alcaloid: Chúng tiến hành khảo sát với phương pháp chiết xuất axít lỗng cồn - Chiết xuất axít lỗng: Cân khoảng 100 g bột dược liệu, thấm ẩm chiết ngấm kiệt dung dịch H2SO4 1% 24 (600 ml x 4) Gạn lấy dịch chiết lọc Gộp dịch lọc Kiềm hóa dịch lọc Na2CO3 2% đến pH = - 8, để lắng gạn Bỏ phần dịch trên, phần lại lọc qua giấy lọc Hòa tan phần rắn cồn nóng thu dịch để lắng 12 Lọc tủa, thu alcaloid toàn phần - Chiết cồn: Cân khoảng 100 g bột dược liệu Thấm ẩm chiết ngâm lạnh bột dược liệu ethanol 90% 24 (600 ml x lần x 24 giờ/lần) Rút dịch chiết lọc Gộp dịch chiết thu được, lọc Cất thu hồi cồn, cô áp suất giảm đến cắn nhão Hoà tan cắn nhão khoảng 50 ml dung dịch HCl 10% Khuấy kỹ ngâm 24 Gạn dịch axít tiếp tục hoà tan dung dịch HCl 10% lần Lọc dịch axít, kiềm hố amoniac đặc đến pH = - Chiết alcaloid base cloroform, cất thu hồi dung môi cô cách thủy thu cắn Chỉ tiêu đánh giá: dựa vào khối lượng cắn alcaloid thơ thu 81 T¹p chÝ y - dợc học quân số chuyên đề dƯợC-2016 * Phân lập palmatin từ cắn alcaloid thô: - Đo phổ: xác định phổ UV-Vis, MS, NMR Cắn alcaloid toàn phần chiết lần với ether dầu hoả (200 ml x lần) Lọc gộp dịch chiết ether dầu hoả Lắc với dung dịch H2SO4 1% (150 ml x lần) Gạn thu lấy dịch chiết axít Kiềm hoá dịch chiết nước dung dịch Na2CO3 đến pH = - Chiết palmatin base dịch chiết với ether dầu hỏa (200 ml x lần) Làm khan, cất thu hồi ether dầu hỏa đến cắn Cắn thu hòa tan với dung dịch axít oxalic 17,5% ethanol Để yên nhiệt độ thường, thu tinh thể palmatin hydrooxalat Hòa tan tinh thể palmatin hydrooxalat nước, cho thêm từ từ dung dịch Na2CO3 vào để kiềm hóa đến pH = - Chiết palmatin base ether dầu hỏa (30 ml x lần) Cất thu hồi ether dầu hỏa cắn palmatin Kết tinh cắn palmatin aceton, thu palmatin tinh khiết - Độ tinh khiết định lượng: phương pháp HPLC * Tinh chế palmatin: Tinh chế sắc ký cột nhồi silicagel Hoạt hóa silicagel 100oC giờ, sau ngâm toluen nhồi cột Để ổn định giờ, xả bỏ toluen Hòa tan khoảng mg palmatin ml benzen tải lên cột Rửa giải hỗn hợp toluen - ethyl acetat theo tỷ lệ tăng dần ethylacetat (từ tỷ lệ 98:2 sang tỷ lệ 93:7) Xác định có mặt palmatin phân đoạn TLC Tập trung phân đoạn chứa hoạt chất, cất thu hồi dung môi đến cắn Kết tinh lại cắn aceton Lọc thu tinh thể, sấy áp suất giảm 600C giờ, sử dụng chất hút ẩm phosphor pentaoxyt * Nhận dạng kiểm tra chất tinh chế: - Đo điểm chảy: phụ lục 6.7 DĐVN IV, phương pháp 82 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ BÀN LUẬN Kết khảo sát lựa chọn phương pháp chiết Bảng 1: Kết khảo sát lựa chọn phương pháp chiết xuất alcaloid toàn phần từ dược liệu Hoàng đằng Số thứ tự Chiết xuất với axít Chiết xuất với cồn Alcaloid Tỷ lệ lượng Alcaloid Tỷ lệ lượng toàn phần chiết toàn phần chiết (g) (%) (g) (%) 3,35 3,35 2,56 2,56 3,17 3,17 2,32 2,32 3.26 3,26 2,65 2,65 3,22 3,22 2,59 2,59 3,40 3,40 2,45 2,45 X (%) 3,28 2,51 Trong phương pháp chiết khảo sát phần phương pháp nghiên cứu, kết cho thấy: chiết xuất với dung mơi axít lỗng cho hiệu suất cao (3,28%) so với phương pháp chiết xuất với cồn (2,51%), dễ thực hiện, dung môi dễ kiếm, giá thành thấp Với kết này, chúng tơi lựa chọn dung mơi chiết axít lỗng Kết nhận dạng kiểm tra hợp chất tinh chế * Kết đo điểm chảy: Tiến hành đo điểm chảy hợp chất nghiên cứu theo DĐVN IV (Phụ lục 6.7, phương pháp 1: đo ống mao quản) Hợp chất tinh chế có nhiệt độ nóng chảy 237 - 2380C, phù hợp với điểm chảy ca palmatin chun Tạp chí y - dợc học quân số chuyên đề dợC-2016 Kt qu nhn dng kiểm tra hợp chất tinh chế * Kết đo điểm chảy: Tiến hành đo điểm chảy hợp chất nghiên cứu theo DĐVN IV (Phụ lục 6.7, phương pháp 1: đo ống mao quản) Hợp chất tinh chế có nhiệt độ nóng chảy 237 - 2380C, phù hợp với điểm chảy palmatin chuẩn * Kết đo phổ UV: Tiến hành đo phổ tử (UV) Hòa tan mẫu thử mẫu đối chiếu MeOH, nồng độ 0,01 mg/ml 10.951 Extracted 0.030 261.6 345.1 240.3 0.025 0.020 AU 0.015 0.010 0.005 0.000 220.00 240.00 260.00 280.00 300.00 nm 320.00 340.00 360.00 380.00 400.00 Hình 1: Phổ UV hợp chất tinh chế MeOH Kết xác định phổ UV-Vis cho thấy hợp chất thu MeOH có cực đại hấp thụ 240,3; 261,6 345,1 nm * Kết đo phổ MS: Phân tích phổ MS máy MS 5989 B (Hewlett Pakard) ion hóa phun điện tử Hình 2: Phổ MS hợp chất tinh chế Kết cho thấy chất phân tích cho mảnh ion phân tử phù hợp với khối lượng phân tử tương ứng, phổ đồ xuất píc 337 [M-CH3], 336 [M-CH4]-, 322 [M-2(CH3)]-, 308 [M-CH4 -CO]- 83 T¹p chÝ y - dợc học quân số chuyên đề dƯợC-2016 * Kết đo phổ NMR: (a) (b) (c) Hình 3: Phổ NMR 1H-NMR (a), 13C-NMR (b), DEPT (c) Phổ cộng hưởng từ chiều cho thấy: phổ 1H-NMR xuất tín hiệu proton vòng thơm bị vị trí cộng hưởng δH (ppm) 7,05 7,61 hai tín hiệu singlet Tín hiệu δH (ppm) 8,02 (d, J = Hz) 8,09 (d, J = Hz) xác nhận vị trí ortho proton vòng thơm thứ 2 tín hiệu singlet δH (ppm) 8,80 9,76 xác nhận có mặt proton H-13 H-8 Tín hiệu proton δH (ppm) 3,32 (2H, m) 4,96 (2H, J = 6,25 Hz) xác nhận có mặt proton H-5 H-6 vòng B Ngồi ra, phổ 1H-NMR hợp chất M2Pal xuất tín hiệu nhóm methoxy δH (ppm) 4,00; 3,94; 4,22 4,10 vị trí OMe-2, OMe-3, OMe-9 OMe-10 Phổ 13C-NMR xuất tín hiệu 21 ngun tử carbon, có carbon bậc 4; carbon CH; carbon CH 84 carbon CH3 xác định phổ DEPT 90 DEPT135 Xác định có mặt vòng thơm với 15 tín hiệu carbon olefin có độ dịch chuyển hóa học vùng từ 109,9 đến 153,6; carbon methylen nối với nguyên tử nitơ δC (ppm) 57,3; carbon CH nối với nguyên tử nitơ δC (ppm) 146,3 carbon bậc bốn nối với nguyên tử nitơ δC (ppm) 139,5 Ngồi ra, phổ 13C-NMR xuất tín hiệu nhóm methoxy xác định δC (ppm) 57,1; 57,3; 62,6 57,7 Các liệu phổ nêu cho thấy hợp chất có khung protoberberin Đối chiếu với sở liệu cơng bố nhận thấy hợp chất M2Pal palmatin * Kết phân tích HPLC: Thực phương pháp phân tích palmatin HPLC để định lượng palmatin Tạp chí y - dợc học quân số chuyên ®Ị d−ỵC-2016 Phương pháp thẩm định đáp ứng yêu cầu tính tương thích hệ thống, chọn lọc đặc hiệu, độ cao (98,03 - 99,89%) lặp lại (RSD từ 0,27 - 0,96%) Hàm lượng palmatin sản phẩm tinh chế có hàm lượng 97,3 ± 0,67% P a lm a t in - 3 0.050 0.040 AU 0.030 0.020 38 05 01- 04 aP A mal 02 nit U 03 01 0 05 0.1 0.1 05 0.2 05.2 0.3 05.3 04 05 0.5 05 0.6 i.6M setu0n57 05.7 0.8 05.8 0.9 09 05 0.1 05.1 0.1 0521 05.21 0.31 0.010 0.000 0.00 0.50 1.00 1.50 2.00 2.50 3.00 3.50 4.00 4.50 5.00 5.50 6.00 6.50 7.00 Minutes 7.50 8.00 8.50 9.00 9.50 10.00 10.50 11.00 11.50 12.00 12.50 13.00 Hình 4: Sắc ký đồ HPLC palmatin Kết xác định độ tinh khiết hợp chất tinh chế cho thấy: tạp chất ngun trạng < 3% Trong đó, tổng diện tích píc tạp < 0,05% KẾT LUẬN Nghiên cứu chiết xuất, phân lập tinh chế palmatin từ dược liệu Hồng đằng Sử dụng phương pháp chiết với axít loãng cho hiệu suất cao (3,28%) so với phương pháp chiết cồn Hợp chất tinh chế nhận dạng xác định cấu trúc hóa học kết phân tích phổ UV-Vis, MS phổ NMR Các liệu thu khẳng định hợp chất tinh chế palmatin Xác định độ tinh khiết hàm lượng palmatin tinh chế dựa vào đo điểm chảy sắc ký HPLC với hàm lượng > 97% TÀI LIỆU THAM KHẢO Bộ môn Dược liệu, Trường Đại học Dược Hà Nội Bài giảng Dược liệu tập tập NXB Y học 1998 Bộ Y tế Dược điển Việt Nam IV Nhà xuất Y học Hà Nội 2009 Committee on Asean Reference Substances Guidelines for the establishment, handling, storage and use of Asean reference substances Thailand 2005, pp.2-12 Committee on Asean Reference Substances SOP for the production of Asean reference substances Thailand 2009, pp.1-6 Gao JM et al One-step purification of palmatine and its derivative dl-tetrahydropalmatine from Enantia chlorantha using high-performance displacement chromatography Journal of Chromatography A 2008, 1208 (1+2), pp.47-53 International Laboratory Accreditation Cooperation (ILAC) G1 Guidelines for the requirements for the competence of reference materials producers 2008, pp.6-7 Bộ môn Dược học Cổ truyền, Trường Đại học Dược Hà Nội Dược học Cổ truyền Nhà xuất Y học 2000 International Laboratory Accreditation Cooperation (ILAC) G9 Guidelines for the selection and use of reference materials 2005, pp.4-15 Bộ mơn Hóa phân tích, Trường Đại học Dược Hà Nội Kiểm nghiệm thuốc Trung tâm Thông tin - Thư viện Đại học Dược Hà Nội 10 International Organisation for Standardization ISO Guide 30: 1992 Terms and definitions used in connection with reference materials 1992 85 ... thiết lập chất chuẩn đánh giá chất lượng dược liệu chế phẩm đông dược chứa palmatin NGUYÊN LIỆU, THIẾT BỊ VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Nguyên liệu thiết bị - Dược liệu Hoàng đằng Công ty Cổ phần Dược. .. ®Ị d−ỵC-2016 ĐẶT VẤN ĐỀ Hồng đằng (Caulis et Radix Fibraureae), họ Tiết dê (Menispermaceae) dược liệu quý chứa hoạt chất palmatin [1, 2, 3] Tiêu chuẩn dược liệu có dược điển, việc định lượng dừng... 17,5% ethanol Để yên nhiệt độ thường, thu tinh thể palmatin hydrooxalat Hòa tan tinh thể palmatin hydrooxalat nước, cho thêm từ từ dung dịch Na2CO3 vào để kiềm hóa đến pH = - Chiết palmatin base ether