Trong đề tài này với mục tiêu nhằm nghiên cứu những thay đổi trong quá trình trưởng thành và sự di chuyển của protein prion (PrP) đột biến mất khả năng gắn đồng trong tế bào. Nghiên cứu thực hiện Phân tích tính chất sinh hóa PrP đột biến và sự phân bố protein ở dòng tế bào chuột N2a (neuroblastoma) bằng phương pháp miễn dịch huỳnh quang tế bào (immunocytochemistry).
Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 18 * Phụ bản của Số 5 * 2014 NGHIÊN CỨU CƠ CHẾ GÂY BỆNH THỐI HĨA NÃO XỐP CỦA PROTEIN PRION DO ĐỘT BIẾN MẤT VỊ TRÍ GẮN ĐỒNG Mai Phương Thảo* TĨM TẮT Mục tiêu: Nghiên cứu những thay đổi trong q trình trưởng thành và sự di chuyển của protein prion (PrP) đột biến mất khả năng gắn đồng trong tế bào. Đối tượng – Phương pháp: Phân tích tính chất sinh hóa PrP đột biến và sự phân bố protein ở dòng tế bào chuột N2a (neuroblastoma) bằng phương pháp miễn dịch huỳnh quang tế bào (immunocytochemistry). Kết quả: Protein đột biến mất khả năng gắn đồng mang đặc tính glycosyl hóa giống protein bình thường. Đột biến tại histidine 95 (H95Y) kháng với protease ngay cả khi biểu hiện ở tế bào bình thường khơng nhiễm prion và tích tụ chủ yếu tại early và recycling endosome. Kết luận: Chúng tơi xác định được đặc tính kháng protease của đột biến H95Y khơng liên quan đến q trình tổng hợp của protein. Hơn nữa, early và recycling endosome có thể là bào quan chính nơi xảy ra q trình biến đổi cấu trúc thành dạng prion gây bệnh. TỪ KHĨA: Thối hóa não xốp (bệnh prion), protein prion (PrP), protein bệnh lý (PrPSc), gắn đồng, đoạn trình tự “8 amino acid lặp lại” (OR), kháng PK, H95Y, glycosyl hóa, vận chuyển nội bào, bào quan endosome, amyloid, thioflavin. ABSTRACT MECHANISMS OF MUTATION IN COPPER BINDING SITES OF PRION PROTEIN LEADING TO PRION FORMATION Mai Phuong Thao * Y Hoc TP. Ho Chi Minh * Vol. 18 ‐ Supplement of No 5‐ 2014: 232 ‐ 242 Objective: Elucidating cellular maturation and distribution processes of mutants carrying copper bindingsite substitution in prion protein. Materials – Methods: Using the mutagenesis on histidine residues, analyzing protein glycosylation, protease‐resistance and protein distribution in N2a cells by immunofluorescence. Results: Mutant proteins shared similar glycosylation patterns as wild‐type PrP. Mutation H95Y acquired PK‐resistance even when expressed in normal cell line. Moreover, H95Y proteins are accumulated in early and recycling endosomes. Conclusion: We found that the protease‐resistance of H95Y mutation is not related to its synthesis. In addition, early and recycling endosomes could be the main sites for prion conversion. Key words: Prion diseases, prion protein (PrP), PrP scarpie (PrPSc), copper binding, octapeptide repeat region (OR), PK‐resistance, H95Y, glycosylation, endocytosis, endosome, amyloid, thioflavin. thể tương tác với nhiều loại protein cũng như ĐẶT VẤN ĐỀ các yếu tố khác nhau, có thể có liên quan đến cơ Prion hay thối hóa não dạng xốp là một chế bệnh sinh của bệnh prion. Từ bề mặt tế bào, bệnh lý gây ra do sự biến đổi cấu trúc của PrPC quay trở lại bào tương bằng con đường vận protein PrPC (cellular) bình thường sang dạng chuyển nội bào “endocytosis”(21), đi đến các bào gây bệnh PrPSc (scrapie). PrPC là một protein quan endosome, và cuối cùng bị phân hủy tại màng, bám trên bề mặt tế bào. Tại đây, PrPC có lysosome hoặc được đưa trở lại bề mặt tế bào để * Bộ mơn Sinh lý học, ĐH Y Dược TpHCM Tác giả liên lạc: TS Mai Phương Thảo ĐT: 091832 9999 232 Email: maithao292@gmail.com Chuyên Đề Điều Dưỡng Kỹ Thuật Y Học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 18 * Phụ bản của Số 5 * 2014 tiếp tục thực hiện chức năng trên màng tế bào. Ngoài con đường ln chuyển này, các dạng PrPC khác cũng được phát hiện trên mơ hình tế bào cũng như in vivo. Các nghiên cứu gần đây cho thấy PrP có khả năng biến đổi qua lại giữa dạng gắn bên ngồi màng tế bào và dạng nội bào(8, 9). Vai trò và chức năng của PrP màng tế bào vẫn chưa được hiểu biết đầy đủ nhưng rõ ràng là PrPC có vai trò quan trọng trong cơ chế bệnh sinh của prion(8). Protein PrP trên màng tế bào được sinh tổng hợp từ lưới nội sinh chất (Endoplasmic reticulum, ER) và chiếm dưới 10% tồng lượng PrP. Giống như các loại protein khác được tổng hợp từ ER, một lượng PrP nhất định gấp cuộn sai và được di chuyển ngược trở lại vào trong nội bào và cuối cùng là bị giáng hóa ở các proteasome. Khi chức năng của các proteasome bị rối loạn, PrP sẽ tích tụ lại ở nội bào, tuy nhiên cơ chế gây bệnh cụ thể của lượng PrP tích tụ này vẫn còn phải làm sáng tỏ(3,26). Nghiên cứu của chúng tơi nhằm mục đích cho thấy sự tích tụ PrP nội bào có thể là chìa khóa kích hoạt bệnh lý thối hóa thần kinh prion. ĐỐI TƯỢNG – PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Plasmid dùng để biến nạp vào tế bào Các đột biến điểm thay thế histidine bằng tyrosine (H60Y, H68Y, H76Y, H84Y, H95Y) có gắn đi 3F4 (L108M, V111M) được nhân bản (clone) vào vector pcDNA3.1 mang gen mã hóa PrP chuột (MoPrP(1‐254)) bằng kit Quick Change site‐directed mutagenesis (Stratagene). Tế bào chuột N2a (mouse neuroblastoma cell line) và tế bào chuột nhiễm prion ScN2a (prion‐ infected neuroblastoma cell line) được nuôi cấy trong môi trường Opti‐MEM (GIBCO) chứa 10% huyết thanh bê (FBS) và 1% penicillin‐ streptomycin ở 37°C, 5% CO2. Biến nạp tạm thời (transient transfection) được thực hiện bằng X‐ treme gene DNA transfection (Roche Biochemicals) theo hướng dẫn của nhà sản xuất. Sau khi biến nạp 72 giờ, dịch tế bào sẽ được thu và phân tích. Chuyên Đề Điều Dưỡng Kỹ Thuật Y Học Nghiên cứu Y học Thí nghiệm về tính chất sinh hóa của PrPSc và PrPC Các tế bào được ly giải trong dung dịch ly giải (chứa 10 mM Tris–HCl pH 8.0, 150 mM NaCl, 0.5% Nonidet P‐40 substitute, 0.5% sodium deoxycholate), phần chất ly giải sẽ được định lượng nồng độ protein bằng BCA kit (Pierce) và được trữ ở nhiệt độ ‐20oC cho đến khi sử dụng. Trong phản ứng cắt bằng enzyme protease K (PK, Roche) để nhận diện PrPSc, protein được ủ với PK ở 37oC hoặc ở 25oC. Để ngừng phản ứng, chúng tôi dùng dung dịch phenylmethyl‐ sulphonyl fluoride (PMSF) 2mM. Sau đó, các mẫu protein sẽ được siêu ly tâm với vận tốc 100,000g trong vòng 1 giờ ở 4°C (Optima TL, Beckman Coulter, Inc.). Khối kết tủa sẽ được tái hòa tan trong dung dịch nạp mẫu. Để đánh giá mức độ trưởng thành của protein đột biến, chúng tơi tiến hành khảo sát sự glycosyl hóa của protein, sử dụng cặp enzyme Endoglycosidase H (EndoH) và PNGAse F (New England Biolabs). Phản ứng được thực hiện ở 37oC và ủ trong 16 giờ. Để ngừng phản ứng, chúng tơi hòa tan trong dung dịch nạp mẫu. Các mẫu này sẽ được chạy điện di SDS‐PAGE 10% và lai với kháng thể 3F4 (Covance) phát hiện PrP. Hình ảnh kết quả Western blot này sẽ được chụp bằng phần mềm UVI Soft (UVITEC, Cambridge). Hóa tế bào (Immunocytochemistry) miễn dịch Tế bào N2a được nuôi trên các lame được phủ poly‐L‐lysine trong vòng 24 giờ và được cố định bằng paraformaldehyde (PFA) 4%. Các tế bào này sẽ được ủ với kháng thể 1 trong vòng 12 giờ ở nhiệt độ 4oC trong dung dịch blocking chứa 0.2% Triton X‐100 (nhằm phá vỡ cấu trúc màng tế bào, giúp các kháng thể có thể dễ dàng xâm nhập nội bào). Ngày hơm sau, các tế bào được rửa và ủ với kháng thể 2 có gắn huỳnh quang trong vòng 1 giờ ở nhiệt độ phòng. Riêng trong thí nghiệm nhằm phát 233 Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 18 * Phụ bản của Số 5 * 2014 hiện PrP ở bề mặt tế bào thì các tế bào được ủ với kháng thể kháng 3F4 ở 4°C trong vòng 15 phút mà khơng cần dung dịch Triton X‐100 0.2%. Để phát hiện PrP nội bào, ban đầu các tế bào được ủ với kháng thể 3F4 trong vòng 15 phút ở 4°C, và sau đó được ủ ở 37oC trong vòng 1 giờ nhằm giúp cho các protein được đánh dấu ở bề mặt tế bào di chuyển vào bên trong tế bào. Tiếp theo, các tế bào sẽ được ủ với trypsin 0.5% (Sigma) nhằm loại bỏ tất cả các protein còn sót lại trên màng(18). Sau đó, các tế bào được ủ với kháng thể 2 AlexaFlour‐488 trong dung dịch có chứa Triton X‐100. Để phát hiện các kết tụ bằng Thioflavin‐S (ThS), tế bào được cố định bằng PFA 4% và rửa với dung dịch PBS có chứa Triton X‐100 0,2%(19,25). Đối với các bào quan, chúng tôi sử dụng kháng thể anti‐Calnexin (lưới nội sinh chất), anti‐ EEA1 (cho early endosome), anti‐Tfn (cho recycling endosome), anti‐M6PR (cho late endosomes) và anti‐LAMP2 (cho lysosomes). Tất cả các kháng thể này được cung cấp bởi công ty Abcam và được sử dụng theo đúng quy trình hướng dẫn của nhà sản xuất. Nhân tế bào được nhuộm bằng DAPI (VECTOR Laboratories). Các hình ảnh được chụp và xử lí bằng kính hiển vi confocal Leica DMIR2 và phần mềm Leica Confocal (Leica). Phân tích thống kê T‐test được dùng để phân tích và so sánh các kết quả. Sự khác biệt có ý nghĩa thống kê khi p 0,05) (Hình 1B). Tuy nhiên ở các nồng độ PK trung gian (3 và 10μg/mL), H95Y kháng PK rõ rệt (p