Bài viết Khảo sát thành phần hóa học của cốt khí củ (polygonum cuspidatum sieb. et zucc.) với mục tiêu nghiên cứu nhằm chiết xuất, phân lập một số chất chính trong rễ củ cốt khí để làm chất chuẩn sử dụng trong kiểm nghiệm dược liệu.
Nghiên cứu Y học Y Học TP Hồ Chí Minh * Tập 15 * Phụ Số * 2011 KHẢO SÁT THÀNH PHẦN HĨA HỌC CỦA CỐT KHÍ CỦ (POLYGONUM CUSPIDATUM SIEB ET ZUCC.) Mai Thị Yến*, Võ Văn Lẹo* TÓM TẮT Mục tiêu: Chiết xuất, phân lập số chất rễ củ Cốt khí để làm chất chuẩn sử dụng kiểm nghiệm dược liệu Phương pháp: Dược liệu ngấm kiệt với cồn 96% Các phân đoạn tách phân bố lỏng-lỏng SKLM dùng để thăm dò dung mơi cho sắc ký cột Sự phân lập thành phần thực sắc ký cột với pha tĩnh silica gel Cấu trúc chất phân lập xác định liệu phổ UV, MS NMR Kết quả: hợp chất phân lập từ cao ether dầu hỏa cao ethyl acetat rễ Cốt khí (Polygonum cuspidatum Sieb et Zucc.) Dựa vào kỹ thuật phân tích phổ, hai hợp chất xác định emodin physcion Hợp chất thứ ba định tính sơ dẫn chất resveratrol Việc xác định cấu trúc cụ thể hợp chất tiếp tục Kết luận: Emodin phân lập thành phần rễ củ Cốt khí sử dụng làm chất đối chiếu kiểm nghiệm Cốt khí củ chế phẩm có chứa dược liệu Từ khóa: resveratrol, piceid, anthraglycosid A, anthraglycosid B, emodin, physcion, chrysophanol ABSTRACT INVESTIGATION OF CHEMICAL CONSTITUENTS OF POLYGONUM CUSPIDATUM SIEB ET ZUCC Mai Thi Yen, Vo Van Leo* Y Hoc TP Ho Chi Minh * Vol 15 - Supplement of No - 2011: 598 - 601 Objective: The aim of the study was to extract and isolate some main compounds from Polygonum cuspidatum roots for using in control purposes of medicinal plants Method: Powder of Polygonum cuspidatum roots was percolated with ethanol 96% Fractions were separated by liquid-liquid extraction TLC was used to investigate solvent systems for column chromatography Isolation of substances was performed by column chromatography on silica gel Structure elucidations of compounds isolated was based on data of UV, MS and NMR spectra Results: compounds were isolated from the petroleum ether and ethyl acetate extract of Polygonum cuspidatum roots Two of these compounds were spectroscopically identified to be emodin and physcion The third compound was preliminarily identified to be a derivative of resveratrol The determination of this compound is in progress Conclusion: Emodin isolated is the major anthraquinone of Polygonum cuspidatum roots This compound can be used as a standard reference in qualitative and quantitative analyses of Polygonum cuspidatum and related preparations Key words: resveratrol, piceid, anthraglycosid A, anthraglycosid B, emodin, physcion, chrysophanol Trung quốc, Việt nam, Hàn quốc, Đài loan ĐẶT VẤN ĐỀ Nhật sử dụng y học cổ truyền để chữa Cốt khí củ nước châu Á chứng viêm dị ứng, viêm gan, cao huyết *Bộ môn Dược liệu, Đại học Y Dược TP Hồ Chí Minh Tác giả liên lạc: TS Võ Văn Lẹo ĐT: 0907060790 598 Email: vovanleo1956@yahoo.com Chuyên Đề Dược Khoa Y Học TP Hồ Chí Minh * Tập 15 * Phụ Số * 2011 áp, xơ vữa thành mạch cao lipid huyết(3) Các thành phần quan trọng Cốt khí bao gồm resveratrol, piceid, anthraglycosid A, anthraglycosid B, emodin, physcion chrysophanol Trong vài năm gần đây, số công trình chứng minh resveratrol có tính chống oxy hóa tác dụng ngăn ngừa ung thư Ngoài resveratrol có tác dụng ức chế ngưng tập tiểu cầu làm giảm tổn thương gan trình peroxy hóa lipid(1,2) Tiếp theo chương trình tiêu chuẩn hóa thuốc, đề tài thực nhằm vào mục tiêu chiết xuất phân lập số hợp chất từ rễ Cốt khí để làm chất chuẩn công tác kiểm nghiệm dược liệu NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Nghiên cứu Y học voltage, 3,2 (KV); cone voltage, 50 (V); extractor voltage, (V); RF lens, 0,3 (V) Chiết xuất Bột rễ Cốt khí (1,8 kg) ngấm kiệt với cồn 96% (10 l) Dịch chiết gộp cô áp suất giảm thu cao cồn lỏng (1 kg) cắn A (6,8 g) Cao lỏng khuấy với ether dầu hỏa (2 l × lần × 20 phút/lần) Gạn gộp dịch ether, cô thu hồi dung môi đến dạng cao mềm, gọi cao EP Cao cồn lỏng sau khuấy với ether dầu hỏa khuấy tiếp với ethyl acetat (2 l × lần) Gạn gộp dịch ethyl acetat, để thấy xuất tủa màu vàng, gọi tủa B Lọc lấy tủa B cô dịch lọc đến dạng cao mềm, gọi cao EA Nguyên liệu Phân lập Rễ Cốt khí củ mua TP Hồ Chí Minh vào tháng 2, năm 2009 Mẫu dược liệu lưu giữ Bộ môn Dược liệu, Đại học Y Dược TP Hồ Chí Minh Cao EP (5 g) phân tích sắc ký cột với silica gel 60 (Spain, 150g, 0.040 – 0.060 mm), pha động hỗn hợp dichloromethan – EtOAc tỉ lệ (95:5) (90:10) Các phân đoạn kiểm tra SKLM, phát UV254, 365, gộp phân đoạn Từ phân đoạn này, sau thu hồi dung môi kết tinh, thu chất PC1 (29,5 mg) and PC2 (707,4 mg) tương ứng Phương pháp nghiên cứu Phổ UV đo máy quang phổ Shimadzu SKLM thực silica gel F254 (Merck) tráng sẵn vơi hệ dung môi: Dichloromethan – EtOAc (7:3), EtOAc – acid acetic – H2O (17:1:2), petroleum ether – dichloromethan (7:3) petroleum ether – EtOAc (2:1) Sắc ký cột thực silica gel 60 (0,040-0,060 mm) với dung môi rửa giãi hỗn hợp dichloromethan – EtOAc tỉ lệ khác Phổ 1H-NMR, 13C-NMR DEPT đo máy Bruker 500Hz dung môi CDCl3 với TMS chuẩn nội Độ dời hóa học δ (ppm) ghi theo hướng trường giảm tính từ chuẩn nội TMS Phổ khối hợp chất phân lập ghi theo mode (ESI) máy Quattromicro API Water (USA) Điều kiện áp dụng sau: pump flow, 20 µl/min; mass range, 100-1000 (m/z); source temperature, 100 OC; desolvation temperature, 150 OC; capillary Chuyên Đề Dược Khoa Cao EA (5 g) phân tích sắc ký cột với silica gel 60 (Spain, 200g; 0,040 – 0,060 mm), dung môi rửa giãi hỗn hợp dichloromethan – EtOAc tỉ lệ (95:5), (90:10) (70:3), thu phân đoạn (1, 2, 3) Sau kết tinh, phân đoạn cho hợp chất (146,6 mg), phân đoạn cho hợp chất (7,2 mg) phân đoạn cho hợp chất (120,3 mg), gọi PC3 Kết so sánh SKLM với hệ dung môi dichloromethan – EtOAc (7:3) cho thấy hợp chất PC2 giống nhau; hợp chất PC1 hoàn toàn giống PC3 cho vết màu xanh mỏng phát UV365 không cho phản ứng với dung dịch kiềm 599 Nghiên cứu Y học Y Học TP Hồ Chí Minh * Tập 15 * Phụ Số * 2011 Tính chất hợp chất phân lập PC1: Bột tinh thể màu đỏ cam, không mùi; tan methanol, chloroform, dichloromethan, ether, aceton, dung dịch kiềm; không tan nước UV: λmax (MeOH, nm): 222,0; 253,0; 266,0; 288,0; 436,0 EIMS, m/z 285,071 [M+H]+ 1H-NMR, δ (500 MHz, CDCl3, ppm): 12,22 (1H, s, 8-OH); 12,02 (1H, s, 1-OH), 7,59 (1H, d, H-4); 7,33 (1H, d, H-5); 7,05 (1H, dd, H-2); 6,65 (1H, d, H-7); 3,92 (1H, s, 6-OCH3); 2,43 (3H, s, 3-CH3) 13C-NMR, δ (125 MHz, CDCl3, ppm): 190,9 (C-10); 181,9 (C-9); 166,7 (C-6); 165,3 (C-8); 162,7 (C-1); 148,4 (C-3); 135,5 (C-14); 133,4 (C-12); 124,5 (C-2); 121,4 (C-4); 113,8 (C-11); 110,4 (C-13); 108,2 (C-5); 106,9 (C-7); 56,04 (6-OCH3); 22,07 (3-CH3) PC2: Bột tinh thể màu đỏ cam, không mùi; tan methanol, chloroform, dichloromethan, ether, aceton, dung dịch kiềm; không tan nước UV: λmax (MeOH, nm): 224,0; 253,0; 265,0; 286,0; 433,0 EIMS, m/z 271,071[M+H]+ 1H-NMR, δ (500 MHz, DMSO, ppm): 12,08 (1H, s, 8-OH); 12,01 (1H, s, 1-OH); 7,49 (1H, d, H-4); 7,16 (1H, d, H-5); 7,11 (1H, dd, H-2); 6,59 (1H, d, H-7); 2,41 (3H, s, 3-CH3) 13CNMR, δ (125 MHz, DMSO, ppm): 189,6 (C-9); 181,2 (C-10); 165,6 (C-8); 164,4 (C-1); 161,4 (C-6); 148,2 (C-3); 134,98 (C-14); 132,7 (C-12); 124,06 (C4); 120,4 (C-2); 113,2 (C-11); 108,85 (C-5); 108,77 (C-13); 107,9 (C-7); 21,50 (3-CH3) PC3: Bột kết tinh màu trắng, không mùi; tan methanol, ethyl acetat, aceton UV: λmax (MeOH, nm): 306 KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN Xác định cấu trúc PC1 VÀ PC2 PC1 Các tín hiệu phổ 13C-NMR cho thấy PC1 có 16 carbon bao gồm 10 carbon tứ cấp, carbon tam cấp carbon sơ cấp Trong số carbon này, có carbon nhóm methyl cộng hưởng 22,07 56,04 ppm, carbon tứ cấp nhóm carbonyl cộng hưởng 190,9 181,9 ppm Những tín hiệu khác nằm khoảng 106,9 – 166,7 ppm thuộc carbon 600 sp2 nhân thơm Phổ 1H-NMR PC1 cho thấy có diện proton nhóm OH 12,22 12,02 ppm, proton carbon bên vòng thơm 2,43 ppm 3,92 ppm, proton lại cộng hưởng 6,65-7,59 ppm, đặc điểm proton gắn với carbon sp2 Dựa vào liệu phổ PC1 so sánh liệu với liệu công bố, cấu trúc PC1 xác định physcion (Bảng Hình 1) Bảng Dữ liệu phổ 13C-NMR 1H-NMR PC1 so sánh với physcion(4) Số C 10 11 12 13 14 3-CH3 6-OCH3 1-OH 8-OH PC1 / CDCl3 δC (ppm) 162,7 124,5 148,4 121,2 108,2 166,7 106,9 165,3 181,9 190,9 113,8 133,4 110,4 135,5 22,07 56,04 - δH (ppm) Physcion / CDCl3 δC (ppm) 162,5 7,05 (1H, dd) 124,5 148,5 7,59 (1H, d) 121,3 7,33 (1H, d) 108,2 166,6 6,65 (1H, d) 106,8 165,2 182,0 190,8 113,7 133,3 113,7 135,3 2,43 (3H, s) 22,2 3,93 (3H, s) 56,1 12,02 (1H, s) 12,22 (1H, s) - δH (ppm) 7,08 (1H, dd) 7,62 (1H, d) 7,36 (1H, d) 6,69 (1H, d) 2,45 (3H, s) 3,95 (3H, s) 12,1 (1H, s) 12,3 (1H, s) PC2 Các tín hiệu phổ 13C-NMR cho thấy PC2 có 15 carbon bao gồm 10 carbon tứ cấp, carbon tam cấp carbon sơ cấp Trong số carbon này, có carbon nhóm methyl cộng hưởng 21,50 ppm, carbon tứ cấp nhóm carbonyl cộng hưởng 189,59 181,21ppm Những tín hiệu khác nằm khoảng 107,88 – 165,56 ppm thuộc carbon sp2 nhân thơm Phổ 1H-NMR PC2 cho thấy có diện proton nhóm OH 12,08 12,01 ppm, proton carbon bên ngồi vòng thơm 2,41 ppm, proton lại cộng hưởng 6,59-7,49 ppm, đặc điểm proton gắn với carbon sp2 Chuyên Đề Dược Khoa Y Học TP Hồ Chí Minh * Tập 15 * Phụ Số * 2011 OH Dựa vào liệu phổ PC2 so sánh liệu với liệu công bố, cấu trúc PC2 xác định emodin, anthraquinon quan trọng rễ Polygonum cuspidatum (Bảng Hình 2) HO Số C δC (ppm) 164,4 120,4 148,2 124,0 108,8 161,4 107,9 165,6 189,6 10 181,2 11 113,2 12 132,7 13 108,7 14 135,0 3-CH3 21,5 1-OH 8-OH - δH (ppm) 7,11 (1H, s) 7,49 (1H, s) 7,16 (1H, dd) 6,59 (1H, dd) 2,41 (3H, s) 12,01 (1H, s) 12,08 (1H, s) OH 13 MeO Emodin / DMSO δC (ppm) δH (ppm) 164,4 120,4 7,07 (1H, s) 148,2 124,0 7,42 (1H, s) 108,8 7,11(1H, dd) 161,4 107,9 6,56 (1H, dd) 165,6 189,6 181,2 113,3 132,7 108,7 135,0 21,5 2,38 (3H, s) 11,96 (1H, s) 12,04 (1H, s) O OH 11 14 O 10 14 12 CH3 Kết quả: Có hợp chất phân lập từ cao ether dầu hỏa cao ethyl acetat rễ Cốt khí (Polygonum cuspidatum Sieb et Zucc.) Hai hợp chất xác định emodin physcion Hợp chất thứ ba định tính sơ dẫn chất resveratrol Việc xác định cấu trúc cụ thể hợp chất thứ ba tiếp tục KẾT LUẬN Các khảo sát đề tài cho thấy emodin thành phần rễ Polygonum cuspidatum Các hợp chất phân lập có độ tinh khiết cao đáp ứng yêu cầu làm chất đối chiếu phân tích định tính định lượng Polygonum cuspidatum chế phẩm có sử dụng dược liệu CH3 H.1 PC1 = Physcion Chuyên Đề Dược Khoa H.2 PC2 = Emodin 12 11 O 10 OH TÀI LIỆU THAM KHẢO O 13 Bảng Dữ liệu phổ 13C-NMR 1H-NMR PC2 so sánh với emodin(3) PC2 / DMSO Nghiên cứu Y học Peihong Fan, Anne-Emmanuelle Hay, Andrew Marston, Hongxiang Lou, Kurt Hostettmann (2009) Chemical variability of the invassive neophytes Polygonum cuspidatum Sieb et Zucc and Polygonum sachalinensis F.Schmidt ex Maxim Biochemical Systematics and Ecology, 37, 24-34 Bret C.Vastano, Yong Chen, Nanqun Zhu, Chi-Tang Ho, Zhengyi Zhou, Robert T Rosen (2000) Isolation and identification of stilbenes in two varieties of Polygonum cuspidatum J Agri Food Chem., 48, 253-256 Xin Chu, Ailing Sun, Renmin Liu (2005) Preparative isolation and purification of five compounds from the Chinese medicinal herb Polygonum cuspidatum Sieb et Zucc by highspeed counter-current chromatography J Chromatography A, 1097, 33-39 Meselhy M.R (2003) Constituents from Moghat, the roots of Glossostemon bruguieri (Desf.) Molecules, 8, 614-621 601 ... (Merck) tráng sẵn vơi hệ dung môi: Dichloromethan – EtOAc (7:3), EtOAc – acid acetic – H2O (17:1:2), petroleum ether – dichloromethan (7:3) petroleum ether – EtOAc (2:1) Sắc ký cột thực silica gel... OH 11 14 O 10 14 12 CH3 Kết quả: Có hợp chất phân lập từ cao ether dầu hỏa cao ethyl acetat rễ Cốt khí (Polygonum cuspidatum Sieb et Zucc.) Hai hợp chất xác định emodin physcion Hợp chất thứ ba...Y Học TP Hồ Chí Minh * Tập 15 * Phụ Số * 2011 áp, xơ vữa thành mạch cao lipid huyết(3) Các thành phần quan trọng Cốt khí bao gồm resveratrol, piceid, anthraglycosid