Tình hình nghiên cứu và mục tiêu của đề tài trình bày về: Bệnh tăng sản tuyến thượng thận bẩm sinh (CAH) là bệnh di truyền ở người gây nên do đột biến gen CYP21A2 trên nhiễm sắc thể số 6. Việc xác định đột biến gen CYP21A2 đóng vai trò quan trọng trong việc chẩn đoán xác định bệnh cũng như tư vấn di truyền. Và mục tiêu nghiên cứu nhằm ứng dụng kỹ thuật giải trình tự và kỹ thuật MLPA trong chẩn đoán đột biến gen CYP21A2.
Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 18 * Phụ bản của Số 1 * 2014 CHẨN ĐỐN DI TRUYỀN Ở CÁC BỆNH NHÂN MẮC BỆNH TĂNG SẢN TUYẾN THƯỢNG THẬN BẨM SINH Ngơ Thị Hồng Phước*, Đỗ Thị Thanh Thủy*,**, Nguyễn Ngọc Minh***, Nguyễn Thị Băng Sương*,** TĨM TẮT Đặt vấn đề: Bệnh tăng sản tuyến thượng thận bẩm sinh (CAH) là bệnh di truyền ở người gây nên do đột biến gen CYP21A2 trên nhiễm sắc thể số 6. Việc xác định đột biến gen CYP21A2 đóng vai trò quan trọng trong việc chẩn đốn xác định bệnh cũng như tư vấn di truyền. Mục tiêu: Ứng dụng kỹ thuật giải trình tự và kỹ thuật MLPA trong chẩn đốn đột biến gen CYP21A2. Đối tượng và phương pháp: Tiến hành trên hai bệnh nhân CAH được chẩn đốn dựa vào triệu chứng lâm sàng, tách chiết DNA của bệnh nhân và thực hiện kỹ thuật giải trình tự gen và MLPA (Multiplex ligation‐ dependent probe amplification) để phân tích đột biến gen CYP21A2. Kết quả: Phát hiện được một bệnh nhân bị đột biến điểm và một bệnh nhân bị đột biến mất đoạn đồng hợp tử từ exon 1 đến exon 3 của gen CYP21A2. Kết luận: Nghiên cứu đã hồn thiện quy trình và ứng dụng thành cơng kỹ thuật giải trình tự và kỹ thuật MLPA trong chẩn đốn đột biến mất đoạn gen CYP21A2 gây bệnh CAH. Từ khóa: Tăng sản tuyến thượng thận bẩm sinh, gen CYP21A2, MLPA. ABSTRACT IDENTIFICATION OF GENE MUTATIONS AT CONGENITAL ADRENAL HYPERPLASIA PATIENTS Ngo Thi Hong Phuoc, Do Thi Thanh Thuy, Nguyen Ngoc Minh, Nguyen Thi Bang Suong * Y Hoc TP. Ho Chi Minh * Vol. 18 ‐ Supplement of No 1 ‐ 2014: 502 ‐ 507 Introduction: Congenital Adrenal Hyperplasia (CAH)is a genetic disease caused by mutations in the CYP21A2gene which is located on chromosome 6. Detection of CYP21A2 gene mutations is important for diagnostic and genetic counseling. Sequencing and MLPA technique are used by many authors for diagnostic of CYP21A2 gene mutations. Objectives: Applification of sequencing and MLPA technique to identify mutations in CYP21A2 gene. Patients and Methods: Two patients were diagnosed CAH by clinical symptoms,DNA of these patients was extracted by Qiagen kit. After that we performedsequencing technique to identify point mutations and MLPA technique to identify deletion mutations in CYP21A2 gene. Results: Onepatient had point mutation and the other patient had homozygote deletion in CYP21A2 gene. Conclusions: The research was initially completed the application process and successfully in the diagnosis of CYP21A2 mutations causing CAH disease. Keywords:Congenital Adrenal Hyperplasia, CYP21A2gene, MLPA . lệ 90 ‐ 95%. Đứng thứ hai là thể 11β‐hydroxylase ĐẶT VẤN ĐỀ 5 ‐ 9%, ngoài ra thiếu hụt các enzyme khác gây Bệnh tăng sản tuyến thượng thận (CAH) là các thể bệnh: 3β-HSD, 17α‐hydroxylase và 20, bệnh di truyền trong đó thể thiếu enzym 21‐ 22‐desmolase ít gặp hơn. Sự khiếm khuyết của hydroxylase là thể bệnh hay gặp nhất, chiếm tỷ enzyme 21‐hydroxylase dẫn đến mức độ khác * Trung tâm Y Sinh học phân tử, **Bộ mơn Hóa sinh, ***B) và đoạn từ exon 3 đến exon 9 (kích thước 2051 bp). Sau đó, sản phẩm PCR được giải trình tự và kết quả phát hiện bệnh nhân bị đột biến điểm đồng hợp tử ở vị trí c.1276 C>T, đột biến này làm thay đổi acid amin tại codon 426 là arginin thành cysteine (đột biến p.R426C) và đã được Grischuk cơng bố vào năm 2006 trên tạp chí J ClinEndocrinoMetab(5). Arginine là một trong 4 acid amin có liên kết hydro với chuỗi propionate của heme (cysteine‐169, glycine‐178, tryptophan‐302 và arginine‐426), điều này khơng chỉ giúp định hướng heme trong protein mà còn tham gia vào việc vận chuyển điện tử. Sự đột biến thay đổi acid amin arginine tại vị trí codon 426 thành acid amin cysteine sẽ phá vỡ các liên kết hydro với nhân tố heme, khiến 505 Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 18 * Phụ bản của Số 1 * 2014 protein khơng có chức năng và gây thể mất muối CAH(6). Ở bệnh nhân này chúng tơi còn tìm thấy có sự khác biệt so với trình tự Genbank NG_007941 như sau: tại codon 10 có chèn thêm 3 nucleotid TGC, kiểm tra kết quả SNP trên website NCBI chúng tôi phát hiện đây chỉ là SNP chứ không phải đột biến. Từ kết quả này cho thấy chúng tơi đã bước đầu hồn thiện được các yếu tố thực hiện quy trình PCR để khuếch đại gen CYP21A2 như: lựa chọn trình tự mồi, chuẩn nồng độ các thành phần phản ứng, nhiệt độ của chu kì luân nhiệt trong phản ứng PCR,…cũng như quá trình giải trình tự gen để xác định đột biến. Ở bệnh nhân 2, mặc dù đã sử dụng các cặp mồi đặc hiệu như đối với bệnh nhân CAH 01 nhưng kết quả PCR khơng khuếch đại được hai đoạn gen của CYP21A2 như bệnh nhân CAH 01, trong khi đó mẫu người bình thường vẫn xuất hiện 2 vạch tương ứng với kích thước của sản phẩm PCR. Điều này cho thấy khả năng bệnh nhân bị đột biến tại vùng gắn mồi, vì vậy các mồi khơng gắn được vào phân tử DNA của bệnh nhân và không khuếch đại được vùng gen cần khảo sát. Do cả hai đoạn exon 1‐3 và exon 3‐ 9 đều không lên vạch của sản phẩm PCR nên chúng tơi nghĩ bất thường có thể liên quan đến exon gắn mồi chung là exon 3. Từ suy đốn này chúng tơi tiếp tục sử dụng phản ứng MLPA để phát hiện đột biến mất đoạn gen CYP21A2. Kết quả hình 5 cho thấy ở người bình thường, tất cả các đỉnh tương ứng với các exon của gen CYP21A2 đều xuất hiện, trong khi đó ở mẫu bệnh nhân, đỉnh của exon 1 và exon 3 khơng xuất hiện, còn đỉnh của các exon 4, 6, 8 có chiều cao chỉ bằng ½ so với người bình thường. Kết quả chứng tỏ bệnh nhân bị mất đoạn đồng hợp tử từ exon 1 đến exon 3, còn từ exon 4 đến exon 8 thì bị mất đoạn dị hợp tử. Điều này suy đốn rằngmột trong hai người bố (hoặc mẹ) của bệnh nhân sẽ mang kiểu gen CYP21A2 dị hợp tử, trong đó 1 allele bình thường và allele bị đột biến mất đoạn từ exon 1‐3. Người mẹ (hoặc bố) còn lại cũng có kiểu gen CYP21A2 dị hợp tử, mang 1 allele bị đột biến mất đoạn từ exon 1‐8. 506 Muốn khẳng định suy đốn cần tiến hành phân tích kiểu gen của bố và mẹ bệnh nhân. Việc phân tích di truyền bệnh CAH vẫn còn hạn chế tại Việt Nam nhưng đối với các nước trên thế giới vấn đề này được quan tâm từ lâu. Năm 2009, Concolino đã ứng dụng kỹ thuật MLPA để chẩn đoán đột biến mất đoạn và lặp đoạn gen CYP21A2(3). Năm 2011, tác giả Rabbani cũng đã dùng kỹ thuật MLPA để chẩn đoán đột biến mất đoạn đồng hợp tử gen CYP21A2 gây thể nam hóa ở trẻ Azeri(1). Từ đó cho thấy phương pháp MLPA có thể sử dụng trong chẩn đốn mất đoạngen CYP21A2 gây bệnh tăng sản tuyến thượng thận bẩm sinh và chúng tôi đã thành công trong việc ứng dụng phương pháp này. KẾT LUẬN Nghiên cứu đã bước đầu ứng dụng thành cơng kỹ thuật giải trình tự gen để phát hiện đột biến điểm và kỹ thuật MLPA để phát hiện đột biến mất đoạn gen CYP21A2 gây bệnh tăng sản tuyến thượng thận bẩm sinh. Điều này có ý nghĩa quan trọng trong việc chẩn đoán người lành mang gen bệnh và chẩn đốn trước sinh cho các bà mẹ có kiểu gen dị hợp tử muốn tiếp tục mang thai nhằm tránh sinh ra những đứa trẻ bị bệnh. TÀI LIỆU THAM KHẢO Bahareh R, Akbari MT, Mahdieh N, Zaridust E, Ashtiani MT, Lee HH, Auchus R, Rabbani A (2011). Homozygous complete deletion of CYP21A2causes a simple virilizing phenotype in an Azeri child. Asian Biomedicine. 889‐892. Brook C, Hughes I, and Kelnar C (2000). Antenatal Treatment of a Mother Bearing a Fetus with Congenital Adrenal Hyperplasia. Archive Disease Children Fetal Neonatal. 82(3):F176‐81. Concolino P, Mello E, Toscano V, Ameglio F, Zuppi C, Capoluongo E (2009). Multiplex ligation – dependent probe amplification (MLPA) assay for the detection of CYP21A2 gene deletions/ duplications in Congenital Adrenal Hyperplasia: First technical report.Clin Chim Acta. 402(1‐2):164‐70. Day DJ, Speiser PW, Schulze E, Bettendorf M, Fitness J, Barany F, White PC (1996). Identification of Non‐Amplifying CYP21 Genes When Using PCR‐Based Diagnosis of 21‐Hydroxylase Deficiency in Congenital Adrenal Hyperplasia (CAH) Affected Pedigrees. Hum Mol Genet. 5(12):2039‐48. Grischuk Y, Rubtsov P, Riepe FG, Grötzinger J, Beljelarskaia S, Prassolov V, Kalintchenko N, Semitcheva T, Peterkova V, Tiulpakov A, Sippell WG, Krone N (2006). Four novel missense mutations in the CYP21A2 gene detected in Russian patients suffering from the classical form of congenital adrenal Chuyên Đề Sức Khỏe Sinh Sản và Bà Mẹ Trẻ em Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 18 * Phụ bản của Số 1 * 2014 hyperplasia: identification, functional characterization, and structural analysis. J.Clin Endocrinol Metab;91(12):4976‐80. Haider S, Islam B, DʹAtri V, Sgobba M, Poojari C, Sun L, Yuen T, Zaidi M, New MI (2013).Structure phenotype correlations of human CYP21A2 mutattions in congenital adrenal hyperplasia.Proc Natl Acad Sci USA; 110(7):2605‐10. Loke KY, Lee YS, Lee WW, Poh LK (2001). Molecular Analysis of CYP‐21 Mutations for Congenital Adrenal Hyperplasia in Singapore.Horm Res; 55(4):179‐84. Speiser PW, Dupont J, Zhu D, Serrat J, Buegeleisen M, Tusie‐ Luna MT, Lesser M, New MI, White PC (1992). Disease expression and molecular genotype in congenital adrenal hyperplasia due to 21‐hydroxylase deficiency. J Clin. Invest; 90(2): 584‐595. Nhi Khoa Nghiên cứu Y học Trần Vân Khánh, Lê Thị Phương, Trần Huy Thịnh và Tạ Thành Văn (2012). Phát hiện đột biến gen CYP21A2 ở bệnh nhân tăng sản thượng thận bẩm sinh.Tạp chí nghiên cứu Y học, 78(1):100‐103. 10 Vrzalova’ Z, et al (2011).Chimeric CYP21A1P/ CYP21A2 genes identified in Czech patients with congenital adrenal hyperplasia. Eur J Med Genet; 54(2):112‐7. Ngày nhận bài báo: 01/11/2013 Ngày phản biện nhận xét bài báo: 26/11/2013 Ngày bài báo được đăng: 05/01/2014 507 ... biến mất đoạn gen CYP21A2 gây bệnh tăng sản tuyến thượng thận bẩm sinh. Điều này có ý nghĩa quan trọng trong việc chẩn đoán người lành mang gen bệnh và chẩn đoán trước sinh cho các bà mẹ có kiểu gen dị hợp tử muốn tiếp ... gây thể nam hóa ở trẻ Azeri(1). Từ đó cho thấy phương pháp MLPA có thể sử dụng trong chẩn đốn mất đoạngen CYP21A2 gây bệnh tăng sản tuyến thượng thận bẩm sinh và chúng ... Huy Thịnh và Tạ Thành Văn (2012). Phát hiện đột biến gen CYP21A2 ở bệnh nhân tăng sản thượng thận bẩm sinh. Tạp chí nghiên cứu Y học, 78(1):100‐103. 10 Vrzalova’ Z, et