Chẩn đoán di truyền ở các bệnh nhân mắc bệnh tăng sản tuyến thượng thận bẩm sinh

Tình hình nghiên cứu và mục tiêu của đề tài trình bày về: Bệnh tăng sản tuyến thượng thận bẩm sinh (CAH) là bệnh di truyền ở người gây nên do đột biến gen CYP21A2 trên nhiễm sắc thể số 6. Việc xác định đột biến gen CYP21A2 đóng vai trò quan trọng trong việc chẩn đoán xác định bệnh cũng như tư vấn di truyền. Và mục tiêu nghiên cứu nhằm ứng dụng kỹ thuật giải trình tự và kỹ thuật MLPA trong chẩn đoán đột biến gen CYP21A2.

Nghiên cứu Y học  Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 18 * Phụ bản của Số 1 * 2014 CHẨN ĐỐN DI TRUYỀN Ở CÁC BỆNH NHÂN   MẮC BỆNH TĂNG SẢN TUYẾN THƯỢNG THẬN BẨM SINH  Ngơ Thị Hồng Phước*, Đỗ Thị Thanh Thủy*,**, Nguyễn Ngọc Minh***, Nguyễn Thị Băng Sương*,**  TĨM TẮT  Đặt vấn đề: Bệnh tăng sản tuyến thượng thận bẩm sinh (CAH) là bệnh di truyền ở người gây nên do đột  biến gen CYP21A2 trên nhiễm sắc thể số 6. Việc xác định đột biến gen CYP21A2 đóng vai trò quan trọng trong  việc chẩn đốn xác định bệnh cũng như tư vấn di truyền.   Mục tiêu: Ứng dụng kỹ thuật giải trình tự và kỹ thuật MLPA trong chẩn đốn đột biến gen CYP21A2.  Đối tượng và phương pháp: Tiến hành trên hai bệnh nhân CAH được chẩn đốn dựa vào triệu chứng lâm  sàng, tách chiết DNA của bệnh nhân và thực hiện kỹ thuật  giải  trình  tự  gen  và  MLPA  (Multiplex  ligation‐ dependent probe amplification) để phân tích đột biến gen CYP21A2.   Kết quả: Phát hiện được một bệnh nhân bị đột biến điểm và một bệnh nhân bị đột biến mất đoạn đồng hợp  tử từ exon 1 đến exon 3 của gen CYP21A2.   Kết luận: Nghiên cứu đã hồn thiện quy trình và ứng dụng thành cơng kỹ thuật giải trình tự và kỹ thuật  MLPA trong chẩn đốn đột biến mất đoạn gen CYP21A2 gây bệnh CAH.  Từ khóa: Tăng sản tuyến thượng thận bẩm sinh, gen CYP21A2, MLPA.  ABSTRACT IDENTIFICATION OF GENE MUTATIONS AT CONGENITAL ADRENAL HYPERPLASIA PATIENTS  Ngo Thi Hong Phuoc, Do Thi Thanh Thuy, Nguyen Ngoc Minh, Nguyen Thi Bang Suong  * Y Hoc TP. Ho Chi Minh * Vol. 18 ‐ Supplement of No 1 ‐ 2014: 502 ‐ 507  Introduction:  Congenital  Adrenal  Hyperplasia  (CAH)is  a  genetic  disease  caused  by  mutations  in  the  CYP21A2gene  which  is  located  on  chromosome  6.  Detection  of  CYP21A2  gene  mutations  is  important  for  diagnostic and genetic counseling. Sequencing and MLPA technique are used by many authors for diagnostic of  CYP21A2 gene mutations.  Objectives: Applification of sequencing and MLPA technique to identify mutations in CYP21A2 gene.  Patients  and  Methods: Two patients were diagnosed CAH by clinical symptoms,DNA of these patients  was  extracted  by  Qiagen  kit.  After  that  we  performedsequencing  technique  to  identify  point  mutations  and  MLPA technique to identify deletion mutations in CYP21A2 gene.  Results: Onepatient had point mutation and the other patient had homozygote deletion in CYP21A2 gene.   Conclusions: The research was initially completed the application process and successfully in the diagnosis  of CYP21A2 mutations causing CAH disease.  Keywords:Congenital Adrenal Hyperplasia, CYP21A2gene, MLPA .  lệ 90 ‐ 95%. Đứng thứ hai là thể 11β‐hydroxylase  ĐẶT VẤN ĐỀ  5 ‐ 9%, ngoài ra thiếu hụt các enzyme khác gây  Bệnh  tăng  sản  tuyến  thượng  thận  (CAH)  là  các  thể  bệnh:  3β-HSD,  17α‐hydroxylase  và  20,  bệnh  di  truyền  trong  đó  thể  thiếu  enzym  21‐ 22‐desmolase  ít  gặp  hơn.  Sự  khiếm  khuyết  của  hydroxylase là thể bệnh hay gặp nhất, chiếm tỷ  enzyme  21‐hydroxylase  dẫn  đến  mức  độ  khác  * Trung tâm Y Sinh học phân tử, **Bộ mơn Hóa sinh, ***B�)  và  đoạn  từ  exon  3  đến  exon  9  (kích  thước 2051 bp). Sau đó, sản phẩm PCR được giải  trình tự và kết quả phát  hiện  bệnh  nhân  bị  đột  biến  điểm  đồng  hợp  tử  ở  vị  trí  c.1276  C>T,  đột  biến này làm thay đổi acid amin tại codon 426 là  arginin thành cysteine (đột biến p.R426C) và đã  được  Grischuk  cơng  bố  vào  năm  2006  trên  tạp  chí  J  ClinEndocrinoMetab(5).  Arginine  là  một  trong  4  acid  amin  có  liên  kết  hydro  với  chuỗi  propionate  của  heme  (cysteine‐169,  glycine‐178,  tryptophan‐302  và  arginine‐426),  điều  này  khơng chỉ giúp định hướng heme trong protein  mà  còn  tham  gia  vào  việc  vận  chuyển  điện  tử.  Sự đột biến thay đổi acid amin arginine tại vị trí  codon  426  thành  acid  amin  cysteine  sẽ  phá  vỡ  các  liên  kết  hydro  với  nhân  tố  heme,  khiến  505 Nghiên cứu Y học  Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 18 * Phụ bản của Số 1 * 2014 protein  khơng  có  chức  năng  và  gây  thể  mất  muối  CAH(6).  Ở  bệnh  nhân  này  chúng  tơi  còn  tìm thấy có sự khác biệt so với trình tự Genbank  NG_007941 như sau: tại codon 10 có chèn thêm  3  nucleotid  TGC,  kiểm  tra  kết  quả  SNP  trên  website  NCBI  chúng  tôi  phát  hiện  đây  chỉ  là  SNP  chứ  không  phải  đột  biến.  Từ  kết  quả  này  cho thấy chúng tơi đã bước đầu hồn thiện được  các  yếu  tố  thực  hiện  quy  trình  PCR  để  khuếch  đại  gen  CYP21A2  như:  lựa  chọn  trình  tự  mồi,  chuẩn nồng độ các thành phần phản ứng, nhiệt  độ  của  chu  kì  luân  nhiệt  trong  phản  ứng  PCR,…cũng  như  quá  trình  giải  trình  tự  gen  để  xác định đột biến.  Ở bệnh nhân 2, mặc dù đã sử dụng các cặp  mồi  đặc  hiệu  như  đối  với  bệnh  nhân  CAH  01  nhưng kết quả PCR khơng khuếch đại được hai  đoạn gen của CYP21A2 như bệnh nhân CAH 01,  trong  khi  đó  mẫu  người  bình  thường  vẫn  xuất  hiện  2  vạch  tương  ứng  với  kích  thước  của  sản  phẩm  PCR.  Điều  này  cho  thấy  khả  năng  bệnh  nhân  bị  đột  biến  tại  vùng  gắn  mồi,  vì  vậy  các  mồi  khơng  gắn  được  vào  phân  tử  DNA  của  bệnh nhân và không khuếch đại được vùng gen  cần khảo sát. Do cả hai đoạn exon 1‐3 và exon 3‐ 9  đều  không  lên  vạch  của  sản  phẩm  PCR  nên  chúng tơi nghĩ bất thường có thể liên quan đến  exon gắn mồi chung là exon 3. Từ suy đốn này  chúng tơi tiếp tục sử dụng phản ứng MLPA để  phát hiện đột biến mất đoạn gen CYP21A2. Kết  quả hình 5 cho thấy ở người bình thường, tất cả  các  đỉnh  tương  ứng  với  các  exon  của  gen  CYP21A2  đều  xuất  hiện,  trong  khi  đó  ở  mẫu  bệnh  nhân,  đỉnh  của  exon  1  và  exon  3  khơng  xuất hiện, còn đỉnh của các exon 4, 6, 8 có chiều  cao  chỉ  bằng  ½  so  với  người  bình  thường.  Kết  quả chứng tỏ bệnh nhân bị mất đoạn đồng hợp  tử từ exon 1 đến exon 3, còn từ exon 4 đến exon  8 thì bị mất đoạn dị hợp tử. Điều này suy đốn  rằngmột trong hai người bố (hoặc mẹ) của bệnh  nhân  sẽ  mang  kiểu  gen  CYP21A2  dị  hợp  tử,  trong  đó  1  allele  bình  thường  và  allele  bị  đột  biến mất đoạn từ exon 1‐3. Người mẹ (hoặc bố)  còn  lại  cũng  có  kiểu  gen  CYP21A2  dị  hợp  tử,  mang 1 allele bị đột biến mất đoạn từ exon 1‐8.  506 Muốn khẳng định suy đốn cần tiến hành phân  tích  kiểu  gen  của  bố  và  mẹ  bệnh  nhân.  Việc  phân tích di truyền bệnh CAH vẫn còn hạn chế  tại  Việt  Nam  nhưng  đối  với  các  nước  trên  thế  giới  vấn  đề  này  được  quan  tâm  từ  lâu.  Năm  2009, Concolino đã ứng dụng kỹ thuật MLPA để  chẩn  đoán  đột  biến  mất  đoạn  và  lặp  đoạn  gen  CYP21A2(3). Năm 2011, tác giả Rabbani cũng đã  dùng kỹ thuật MLPA để chẩn đoán đột biến mất  đoạn  đồng  hợp  tử  gen  CYP21A2  gây  thể  nam  hóa ở trẻ Azeri(1). Từ đó cho thấy phương pháp  MLPA  có  thể  sử  dụng  trong  chẩn  đốn  mất  đoạngen  CYP21A2  gây  bệnh  tăng  sản  tuyến  thượng  thận  bẩm  sinh  và  chúng  tôi  đã  thành  công trong việc ứng dụng phương pháp này.  KẾT LUẬN  Nghiên  cứu  đã  bước  đầu  ứng  dụng  thành  cơng kỹ thuật giải trình tự gen để phát hiện đột  biến  điểm  và  kỹ  thuật  MLPA  để  phát  hiện  đột  biến mất đoạn gen CYP21A2 gây bệnh tăng sản  tuyến  thượng  thận  bẩm  sinh.  Điều  này  có  ý  nghĩa  quan  trọng  trong  việc  chẩn  đoán  người  lành  mang  gen  bệnh  và  chẩn  đốn  trước  sinh  cho các bà mẹ có kiểu gen dị hợp tử muốn tiếp  tục mang thai nhằm tránh sinh ra những đứa trẻ  bị bệnh.  TÀI LIỆU THAM KHẢO  Bahareh  R,  Akbari  MT,  Mahdieh  N,  Zaridust  E,  Ashtiani  MT,  Lee HH,  Auchus  R,  Rabbani  A  (2011).  Homozygous  complete  deletion of CYP21A2causes a simple virilizing phenotype in an  Azeri child. Asian Biomedicine. 889‐892.  Brook C, Hughes I, and Kelnar C (2000). Antenatal Treatment of  a Mother Bearing a Fetus with Congenital Adrenal Hyperplasia.  Archive Disease Children Fetal Neonatal. 82(3):F176‐81.  Concolino  P, Mello  E, Toscano  V, Ameglio  F, Zuppi  C, Capoluongo E (2009). Multiplex ligation – dependent probe  amplification (MLPA) assay for the detection of CYP21A2 gene  deletions/  duplications  in  Congenital  Adrenal  Hyperplasia:  First technical report.Clin Chim Acta. 402(1‐2):164‐70.  Day  DJ, Speiser  PW, Schulze  E, Bettendorf  M, Fitness  J, Barany  F, White  PC  (1996).  Identification  of  Non‐Amplifying  CYP21  Genes  When  Using  PCR‐Based  Diagnosis  of  21‐Hydroxylase  Deficiency in Congenital Adrenal Hyperplasia (CAH) Affected  Pedigrees. Hum Mol Genet. 5(12):2039‐48.  Grischuk  Y, Rubtsov  P, Riepe  FG, Grötzinger  J, Beljelarskaia  S, Prassolov  V, Kalintchenko  N, Semitcheva  T, Peterkova  V, Tiulpakov  A, Sippell  WG, Krone  N  (2006).  Four  novel  missense  mutations  in  the  CYP21A2  gene  detected  in  Russian  patients suffering from the classical form of congenital adrenal  Chuyên Đề Sức Khỏe Sinh Sản và Bà Mẹ Trẻ em  Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 18 * Phụ bản của Số 1 * 2014  hyperplasia:  identification,  functional  characterization,  and  structural analysis. J.Clin Endocrinol Metab;91(12):4976‐80.  Haider  S, Islam  B, DʹAtri  V, Sgobba  M, Poojari  C, Sun  L, Yuen  T, Zaidi M, New MI (2013).Structure phenotype correlations of  human  CYP21A2  mutattions  in  congenital  adrenal  hyperplasia.Proc Natl Acad Sci USA; 110(7):2605‐10.  Loke KY, Lee YS, Lee WW, Poh LK (2001). Molecular Analysis  of  CYP‐21  Mutations  for  Congenital  Adrenal  Hyperplasia  in  Singapore.Horm Res; 55(4):179‐84.  Speiser  PW,  Dupont  J,  Zhu  D,  Serrat  J,  Buegeleisen  M,  Tusie‐ Luna  MT,  Lesser  M,  New  MI,  White  PC  (1992).  Disease  expression  and  molecular  genotype  in  congenital  adrenal  hyperplasia  due  to  21‐hydroxylase  deficiency.  J  Clin.  Invest;  90(2): 584‐595.    Nhi Khoa Nghiên cứu Y học Trần  Vân  Khánh,  Lê  Thị  Phương,  Trần  Huy  Thịnh  và  Tạ  Thành Văn (2012). Phát  hiện  đột  biến  gen  CYP21A2  ở  bệnh  nhân  tăng  sản  thượng  thận  bẩm  sinh.Tạp  chí  nghiên  cứu  Y  học, 78(1):100‐103.  10 Vrzalova’  Z,  et  al  (2011).Chimeric  CYP21A1P/  CYP21A2  genes  identified  in  Czech  patients  with  congenital  adrenal  hyperplasia. Eur J Med Genet; 54(2):112‐7.    Ngày nhận bài báo:       01/11/2013  Ngày phản biện nhận xét bài báo:   26/11/2013  Ngày bài báo được đăng:   05/01/2014    507 ... biến mất đoạn gen CYP21A2 gây bệnh tăng sản tuyến thượng thận bẩm sinh.   Điều  này  có  ý  nghĩa  quan  trọng  trong  việc  chẩn đoán người  lành  mang  gen  bệnh và  chẩn đoán trước  sinh cho các bà mẹ có kiểu gen dị hợp tử muốn tiếp ... gây  thể  nam  hóa ở trẻ Azeri(1). Từ đó cho thấy phương pháp  MLPA  có  thể  sử  dụng  trong  chẩn đốn  mất  đoạngen  CYP21A2  gây  bệnh tăng sản tuyến thượng thận bẩm sinh và  chúng ... Huy  Thịnh  và  Tạ  Thành Văn (2012). Phát  hiện  đột  biến  gen  CYP21A2  ở bệnh nhân tăng sản thượng thận bẩm sinh. Tạp  chí  nghiên  cứu  Y  học, 78(1):100‐103.  10 Vrzalova’  Z,  et