SÀNG LỌC ĐỘT BIẾN GEN RB1 THỂ DI TRUYỀN TRÊN CÁC BỆNH NHÂN UNG THƢ TẠI VIỆT NAM

BỘ GIÁO DỤC VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ ĐÀO TẠO VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ - Họ tên tác giả luận văn: Nguyễn Thị Thanh Hoa TÊN ĐỀ TÀI LUẬN VĂN: SÀNG LỌC ĐỘT BIẾN GEN RB1 THỂ DI TRUYỀN TRÊN CÁC BỆNH NHÂN UNG THƢ TẠI VIỆT NAM LUẬN VĂN THẠC SĨ: SINH HỌC THỰC NGHIỆM Hà Nội- 2019 BỘ GIÁO DỤC VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ ĐÀO TẠO VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ - Họ tên tác giả luận văn: Nguyễn Thị Thanh Hoa TÊN ĐỀ TÀI LUẬN VĂN SÀNG LỌC ĐỘT BIẾN GEN RB1 THỂ DI TRUYỀN TRÊN CÁC BỆNH NHÂN UNG THƢ TẠI VIỆT NAM Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm Mã số: 8420114 LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC THỰC NGHIỆM NGƢỜI HƢỚNG DẪN KHOA HỌC: TS.Nguyễn Hải Hà Hà Nội- 2019 Lời cam đoan Tôi xin cam đoan kết đề tài: “Sàng lọc đột biến gen RB1 thể di truyền bệnh nhân ung thƣ Việt Nam” cơng trình nghiên cứu cá nhân Các số liệu, kết nêu luận văn trung thực chƣa đƣợc công bố cơng trình khác Nếu khơng nhƣ nêu trên, tơi xin hồn tồn chịu trách nhiệm đề tài Hà Nội, tháng năm 2019 Học viên Nguyễn Thị Thanh Hoa Lời cảm ơn Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới TS.Nguyễn Hải Hà – Phó Trƣởng Phòng phân tích hệ gen, Viện nghiên cứu hệ gen, ngƣời thầy - ngƣời chị không hƣớng dẫn, tạo điều kiện thuận lợi giúp đỡ, chia sẻ khó khăn tơi suốt q trình làm việc hồn thành luận văn mà sống hàng ngày Thái độ làm việc chuyên nghiệp chị truyền cảm hứng cho giúp tơi cải thiện thân nhiều sau thời gian thực tập Tôi xin gửi lòng cảm ơn đặc biệt đến TS.Nguyễn Đăng Tơn –Trƣởng Phòng phân tích hệ gen, Ths.Nguyễn Phƣơng Nhung, Ths.Ma Thị Huyền Thƣơng Ths Trần Thị Bích Ngọc ln theo sát giúp đỡ bảo suốt q trình thực luận văn Qua tơi xin cảm ơn tất cô, anh, chị Viện Nghiên cứu hệ gen giúp đỡ nhiều suốt thời gian thực tập Để có đƣợc hiểu biết kiến thức chuyên ngành, xin chân thành cảm ơn thầy cô giáo khoa Công nghệ sinh học Học viện Khoa học Công nghệ truyền đạt cho kiến thức bổ ích suốt năm học qua Cuối cùng, xin gửi lời tri ân tới bố mẹ, ngƣời thân gia đình bạn bè ln ủng hộ, khích lệ động viên tinh thần suốt thời gian thực tập để hồn thành tốt luận văn thạc sĩ Em xin chân thành cảm ơn! Hà Nội, tháng năm 2019 Học viên Nguyễn Thị Thanh Hoa Danh mục ký hiệu chữ viết tắt UNBVM U nguyên bào võng mạc RB1 Retinoblastoma DNA Deoxyribonucleic acid RNA Ribonucleic acid cDNA Complement deoxyribonucleic acid mRNA Messenger ribonucleic acid -RNA thông tin bp Base pair dNTPS Deoxyribonucleotide Triphosphate PCR Polymerase chain reaction MLPA Multiplex ligation-dependent probe amplification UV Ultra violet TAE Tris-axit axetic-EDTA qPCR Quantitative polymerase chain reaction EDTA Ethylene Diamine Tetraacetic Acid DMSO Dimethyl sulfoxide Danh mục bảng biểu hình ảnh BẢNG BIỂU Bảng 1.1 Hệ thống phân loại Reese Ellsworth cho phân loại u nguyên bào võng mạc Bảng 1.2 Hệ thống phân loại quốc tế cho u nguyên bào võng mạc nội nhãn …….10 Bảng 1.3 Đánh giá nguy mang đột biến RB1 thành viên gia đình có trẻ bị UNBVM 14 Bảng 2.1 Các cặp mồi đặc hiệu cho phản ứng PCR……………………….……26 Bảng 3.1 Đặc điểm lâm sàng đối tƣợng nghiên cứu 36 Bảng 3.2 Nồng độ DNA tổng số mẫu bệnh nhi UNBVM 40 Bảng 3.3 Đột biến RB1 đƣợc xác định bệnh nhân UNBVM phƣơng pháp giải trình tự Sanger .……………………………………………………………44 Bảng 3.4 Mối liên hệ giá trị DQ số .47 Bảng 3.5 Các đột biến đoạn lớn gen RB1 đƣợc xác định phƣơng pháp MLPA………………………………………………………………… 49 HÌNH ẢNH Hình 1.1 Hình ảnh siêu âm UNBVM Hình 1.2 Hình ảnh cắt lớp vi tính UNBVM Hình 1.3 Soi đáy mắt trƣớc điều trị hóa chất giảm tế bào 12 Hình 1.4 Soi đáy mắt trƣớc điều trị hóa chất giảm tế bào 12 Hình 1.5 Giải th ch mặt di truyền đột biến chức gen RB1 16 Hình 1.6 Tái tổ hợp nguyên phân 17 Hình 1.7 Hoạt động bất thƣờng DNA polymerase ch p DNA 18 Hình 1.8 Sự phân chia bất thƣờng nhiễm sắc thể nguyên phân 19 Hình 1.9 Vị trí gen RB1 nhiễm sắc thể số 13 19 Hình 1.10 Cấu trúc gen protein RB1 20 Hình 3.1 Ảnh minh hoạ điện di đồ sản phẩm DNA tổng số tách chiết t mẫu máu bệnh nhân gia đình 39 Hình 3.2 Ảnh minh hoạ điện di đồ sản phẩm PCR t mẫu UNBVM 42 Hình 3.3 Sơ đồ biểu diễn đột biến gen RB1 đƣợc phát 23 bệnh nhân 44 Hình 3.4 Kết dạng biểu đồ sóng (electrophotogram) sau phân tích MLPA…49 Hình 4.1 Hình ảnh minh họa trình tự đột biến đƣợc phát bệnh nhân UNBVM 52 Hình 4.2 Sơ đồ phả hệ gia đình mắc UNBVM 53 MỤC LỤC MỞ ĐẦU CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 GIỚI THIỆU CHUNG VỀ BỆNH U NGUYÊN BÀO VÕNG MẠC 1.1.1 Tình hình u nguyên bào võng mạc giới Việt Nam 1.1.2 Biểu lâm sàng UNBVM 1.1.3 Chẩn đoán UNBVM 1.1.4 Phân loại UNBVM 1.1.5 Điều trị UNBVM 10 1.1.6 Tƣ vấn di truyền cho bệnh nhân u nguyên bào võng mạc 13 1.1.7 Cơ chế gây bệnh u nguyên bào võng mạc 15 1.1.7.1 t p tron n u n p n 17 1.1.7.2 Hoạt độn 1.1.7.3 p n tt n tt N po m r s tron t n n n ms t p N 17 18 1.2 GIỚI THIỆU VỀ GEN RB1 19 1.3 CÁCH TIẾP CẬN VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU, KỸ THUẬT SỬ DỤNG NHẰM XÁC ĐỊNH ĐỘT BIẾN GEN RB1 TRÊN THẾ GIỚI VÀ VIỆT NAM 21 CHƢƠNG 2: NGUYÊN VẬT LİỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHİÊN CỨU 23 2.1 VẬT LİỆU NGHİÊN CỨU 23 2.1.1 Đối tƣợng nghiên cứu 23 2.1.2 Dụng cụ, trang thiết bị 23 2.1.3 Hóa chất 24 2.2 PHƢƠNG PHÁP NGHİÊN CỨU 24 2.2.1 Phƣơng pháp lấy mẫu 25 2.2.2 Phƣơng pháp tách chiết DNA genomic 25 2.2.3 Phƣơng pháp khuếch đại gen (PCR) 26 2.2.4 Phƣơng pháp giải trình tự gen 30 2.2.5 Phƣơng pháp Multiplex Ligation-dependent Probe Amplification (MLPA) 31 2.2.6 Phƣơng pháp phân t ch kết 34 CHƢƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 36 3.1 KẾT QUẢ 36 3.1.1 Thu thập mẫu nghiên cứu 36 3.1.2 Tách chiết DNA tổng số 39 3.1.3 PCR khuếch đại đoạn gen RB1 41 3.1.4 Phát đột biến giải trình tự gen RB1 43 3.1.5 Phát thay đổi cấu trúc gen MLPA 46 3.2 THẢO LUẬN 50 CHƢƠNG KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 55 4.1 KẾT LUẬN 55 TÀI LIỆU THAM KHẢO 56 MỞ ĐẦU U nguyên bào võng mạc (retinoblastoma, UNBVM) bệnh u ác tính mắt thƣờng gặp trẻ em dƣới tuổi, gây đột biến gen RB1 (retinoblastoma 1) UNBVM xuất với tỷ lệ khoảng 1/15000 đến 1/20000 trẻ tƣơng ứng với khoảng 9000 trƣờng hợp năm, bệnh xảy hai giới tính nam nữ, khơng phụ thuộc vào nguồn gốc chủng tộc [5-8] Trên giới, ƣớc tính có khoảng 3001 đến 3376 trẻ em chết UNBVM hàng năm Tỷ lệ tử vong châu Á (39%) cao nhiều so với châu Âu, Canada Mỹ (3–5%) khoảng cách tiếp cận y tế [9] Hầu hết trƣờng hợp UNBVM liên quan đến chức hai alen gen áp chế khối u RB1 nằm nhiễm sắc thể số 13 [7] Khoảng 40% trẻ UNBVM thể di truyền 60% trƣờng hợp lại thể khơng di truyền [10] RB1 gen áp chế khối u đƣợc tìm thấy, nằm vị tr 13q14.2, có k ch thƣớc DNA 183 kb Cho đến nay, 1750 đột biến gen RB1 khác phát đƣợc bệnh nhân UNBVM đƣợc công bố ngân hàng liệu đột biến gen RB1 (RB1 Gene Mutation Database) [11], đột biến gen RB1 gây bệnh UNBVM không đồng xuất rải rác vùng promoter 27 exon Việc xác định đột biến gen RB1 gây bệnh bệnh nhân UNBVM gia đình sở để thực điều trị cho bệnh nhân hiệu tƣ vấn di truyền cho gia đình bệnh nhân Việc chẩn đốn sớm phƣơng pháp điều trị th ch hợp có vai trò quan trọng việc tiên lƣợng khả sống sót bệnh nhân UNBVM [12] Ở nƣớc phát triển, mục tiêu điều trị bảo tồn thị lực việc kiểm tra gen RB1 đƣợc áp dụng nhƣ kiểm tra định kì nhóm bệnh nhân UNBVM [13-16] Ở Việt Nam, phần lớn bệnh nhân nhập viện giai đoạn muộn nên bị lỡ hội điều trị bảo tồn mắt Mặc dù nhiều kinh ph đƣợc đầu tƣ cho việc (a) Ngƣời khỏe mạnh (b) Rb21 RB21 48 (c) RB38 Hình 3.4: Kết dạng biểu đồ sóng (electrophotogram) sau phân tích MLPA Bảng 3.5: Các đột biến đoạn lớn gen RB1 đƣợc xác định phƣơng pháp MLPA Mã bệnh nhân Mất đoạn Th a hƣởng t mẹ/bố RB5 Mất toàn alen NY/NY RB20 Mất tồn alen NY/Có RB21 Mất tồn alen NY /Có RB25 Mất tồn alen NA/NY RB38 Mất exon 4-27 NY/NY RB40 Mất toàn alen NY/NY NY: mẫu chƣa đƣợc kiểm tra 49 3.2 THẢO LUẬN U nguyên bào võng mạc khối u ác tính nội nhãn nguyên phát xảy trẻ em có nguy tử vong cao Việt Nam mƣời nƣớc có tỷ lệ mắc bệnh cao khu vực châu Á - Thái Bình Dƣơng [50] Đây nghiên cứu sàng lọc toàn diện đột biến dòng mầm gen RB1 bệnh nhân Việt Nam mắc u nguyên bào võng mạc Cho đến có 1750 đột biến khác gen RB1 đƣợc báo cáo đột biến nằm rải rác toàn gen Tuy nhiên, đột biến điểm đƣợc tìm thấy nghiên cứu phân bố với mật độ cao hai vùng: exon vùng trình tự mã hóa hai pocket pRb A B (Hình 3.3) Đây vùng tƣơng tác ức chế yếu tố phiên mã E2F làm cho protein pRb đóng vai trò quan trọng việc điều hòa chu kỳ tế bào, ức chế G1/S hạn chế tăng trƣởng [49] Do đó, đột biến nằm vùng điểm nóng đột biến cho thấy tần số cao hình thành khối u nhiều loại ung thƣ, bao gồm u nguyên bào võng mạc [51] Trong số 30 bệnh nhân, đột biến dẫn đến vắng mặt kết thúc chuỗi sớm bao gồm đột biến thêm mất, đột biến vô nghĩa đột biến dịch khung liên quan đến khả tiến triển bệnh cao đƣợc tìm thấy 60% bệnh nhân Ngƣợc lại, đột biến sai nghĩa đột biến vị trí cắt nối splicing có liên quan đến khả tiến triển bệnh thấp đƣợc tìm thấy 20% bệnh nhân Trong nghiên cứu này, 17 mẫu mẹ 10 mẫu bố có dƣơng t nh với đột biến đƣợc kiểm tra để xác định di truyền đột biến Có ba đột biến điểm hai đột biến đoạn lớn đƣợc truyền t ngƣời bố Trong có đột biến đƣợc xác định bệnh nhi nam tháng tuổi (RB17) cha bệnh nhi có mắt phải đƣợc loại bỏ nhãn cầu Đột biến điểm thứ hai có nguồn gốc t bố đứa trẻ đƣợc xác định đột biến vị trí cắt nối 50 slipcing (c.1960G>A) đƣợc phát hai chị em (RB15, UNBVM hai bên mắt; RB24, UNBVM bên mắt) nhiên đột biến bố hai bệnh nhi không phát triển thành bệnh Đột biến thể khảm đƣợc tìm thấy mẹ bệnh nhi RB35 có mắt phải bị loại bỏ nhãn cầu gái có đột biến trạng thái dị hợp tử (Hình 4.2) Trong nghiên cứu này, có đột biến thêm nucleotide hai đột biến nucleotide gen RB1 đƣợc tìm thấy, chiếm 16.67% (3/18) tất đột biến xác định đƣợc nhóm bệnh nhi nghiên cứu Đáng ý, tất đột biến nằm vị trí gắn protein quan trọng vùng chức A pocket pRb (c.1337insTA exon 14, c.1449–1450delTA exon 16, c.1312delT exon 13; Hình 4.1) Các đột biến nghiên cứu đột biến dịch khung, phần lớn đột biến dòng mầm liên quan đến UNVBM hai mắt khả biểu bệnh cao (> 90%) [52] Kiểu đột biến có tác động lớn đến kiểu hình làm hoàn toàn chức hoạt động alen Do đó, bệnh nhân có đột biến dịch khung phát triển khối u hai mắt [53] Hai bệnh nhân (RB7 RB12) đƣợc chẩn đoán bị UNBVM hai mắt Tuy nhiên, thay đổi khung đọc mở RB1 trƣờng hợp bệnh nhân RB6 (nữ) đƣợc chẩn đoán biểu khối u mắt lúc tháng tuổi Do đó, mắt lại bệnh nhi nên đƣợc theo dõi chặt chẽ để phát khả hình thành khối u 51 Hình 4.1: Hình ảnh minh họa trình tự đột biến đƣợc phát bệnh nhân UNBVM A: c.1337insTA đột biến dị hợp tử bệnh nhân RB6 B: c.1449–1450delTA đột biến dị hợp tử bệnh nhân RB7 C: c.1312delT đột biến dị hợp tử bệnh nhân RB12 52 Hình 4.2: Sơ đồ phả hệ gia đình mắc UNBVM A: Một đột biến c.1960G>A gây biến đổi điểm cắt nối bệnh nhân anh chị em ruột RB15 RB24 B: đột biến dị hợp tử c.1494T> G bệnh nhân RB35 mẹ bệnh nhân C: đột biến c.1939–1940delTC gây lệch khung bệnh nhân RB45 Các ký hiệu màu đen nửa màu đen tƣơng ứng với Rb hai mắt mắt 53 MLPA gần đƣợc xem nhƣ kỹ thuật có độ nhạy cao đặc hiệu để phát bất thƣờng tế bào học exon đơn lẻ lƣợng nhỏ mẫu DNA ngƣời [54] Khoảng 15-25% trƣờng hợp UNBVM đột biến thêm/mất đoạn lớn đƣợc báo cáo nghiên cứu trƣớc [11, 55] Trong nghiên cứu này, phƣơng pháp kết hợp giải trình tự DNA MLPA nâng cao hiệu suất chẩn đoán phát đột biến gen RB1 (80%) tỷ lệ phát cách sử dụng giải trình tự DNA 60% Do hai phƣơng pháp (giải trình tự DNA MLPA) nên đƣợc sử dụng để thực x t nghiệm di truyền gen RB1 bệnh nhân Việt Nam mắc UNBVM Trong nghiên cứu có sáu ca khơng tìm thấy đột biến gen RB1 mẫu máu bệnh nhân phƣơng pháp giải trình tự Sanger MLPA, chiếm 20% tổng số bệnh nhân đƣợc nghiên cứu Trong số ca có bốn ca bị UNBVM bên mắt (66.67%) hai ca bị UNBVM hai bên mắt (33.33%) Nguyên nhân gây bệnh có bệnh nhân bị hai đột biến sinh dƣỡng (soma) alen gen RB1 yếu tố khác, chẳng hạn nhƣ gen sinh ung thƣ MYCN (ID Gene: 4613; OMIM 164840) [56], thay đổi phosphoryl pRB gen PIN1 (ID Gene: 5300; OMIM 601052) [57] , nhiễm virus[58] methyl hóa mức đảo giàu CpG vùng promoter gen RB1 [59] Do đó, nghiên cứu sâu sàng lọc yếu tố khác cần đƣợc kiểm tra để tìm nguyên nhân gây bệnh Tuy nhiên, bệnh nhân mang đột biến khảm mức độ thấp đột biến nằm sâu intron, không phát đƣợc với phƣơng pháp sàng lọc Trong trƣờng hợp này, cách tiếp cận khác để phát đột biến nhƣ giải trình tự hệ cần thiết [25] 54 CHƢƠNG KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 4.1 KẾT LUẬN U nguyên bào võng mạc bệnh u ác tính mắt thƣờng gặp trẻ em dƣới tuổi, gây đột biến gen RB1 (retinoblastoma 1) Khoảng 40% trẻ bị ảnh hƣởng thuộc thể di truyền cho thấy vai trò quan trọng xét nghiệm gen RB1 việc quản lý bệnh Nghiên cứu xây dựng hoàn thiện đƣợc điều kiện kỹ thuật cho ph p xác định đột biến gen RB1 30 mẫu bệnh nhi mắc UNBVM với việc sử dụng kết hợp phƣơng pháp giải trình tự gen nhằm phát đột biến điểm gen RB1 phƣơng pháp MLPA phát thay đổi cấu trúc gen Kết giải trình tự cho thấy tỷ lệ đột biến dị hợp tử gây bệnh 60% (18/30), có 13 trƣờng hợp bị ảnh hƣởng hai mắt trƣờng hợp bị ảnh hƣởng bên mắt Trong số 18 đột biến có đột biến vơ nghĩa, đột biến dịch khung, đột biến ảnh hƣởng tới splicing đột biến sai nghĩa Luận văn sử dụng phƣơng pháp MLPA để phát thay đổi cấu trúc gen phát bệnh nhân bị toàn phần gen trạng thái dị hợp tử tất các bệnh nhân bị UNBVM hai bên mắt Với kết đạt đƣợc, nghiên cứu cung cấp liệu đột biến dòng mầm gen RB1 bệnh nhân UNBVM ph a Bắc Việt Nam Sàng lọc đột biến gen RB1 có vai trò quan trọng việc xác định nguyên nhân di truyền bệnh UNBVM, làm sở cho cơng tác chẩn đốn, chữa trị tƣ vấn di truyền cho bệnh nhân gia đình ngƣời bệnh UNBVM 55 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng Việt Nguyễn Công kiệt, Nguyễn Tr Dũng, 2005, Đặc điểm di truyền u nguyên bào võng mạc, ạp í Y ọ àn p ố Hồ C í M n , (9), pp 99-103 Nguyễn Hải Hà, Đỗ Mạnh Hƣng, Lê Thúy Quỳnh, Nguyễn Thùy Dƣơng, Nguyễn Đăng Tôn, 2014, Phát đột biến gen RB1 trẻ em u nguyên bào võng mạc, ạp í ôn n ệ s n ọ , (1), pp 23-29 Vũ Phƣơng Nhung, Lê Thúy Quỳnh, Nguyễn Đăng Tôn, Nguyễn Thị Xuân, Nguyễn Hải Hà, 2016, Xây dựng phƣơng pháp sàng lọc gen RB1 thông qua mRNA, ạp í ôn n ệsn ọ 14(2) Vu Phuong Nhung, Nguyễn Thị Thanh Hoa, Ma Thi Huyen Thuong, Tran Thi Bich Ngoc, Nguyen Dang Ton, Nguyen Thuy Duong, Nong Van Hai, Nguyen Hai Ha, 2017, Study on application of multiplex ligation-dependent probe amplification (MLPA) in molecular diagnosis of retinoblastoma, Journal of Biotechnology, 4(15), p 625-631 Tiếng Anh F, Vogel, 1979, Genetics of retinoblastoma, Hum Genet, (52), pp 1-54 T, Kivela, 2009, The epidemiological challenge of the most frequent eye cancer: retinoblastoma, an issue of birth and death, Br J Ophthalmol (93), pp 1129-31 Dimaras H, Kimani K, Dimba EA, Gronsdahl P, White A, Chan HS, Gallie BL , 2012, Retinoblastoma, Lancet (37), pp 1436-46 Li WL, Buckley J, Sanchez-Lara PA, Maglinte DT, Viduetsky L, Tatarinova TV, Aparicio JG, Kim JW, Au M, Ostrow D, Lee TC, O'Gorman M, Judkins A, Cobrinik D, Triche TJ, 2016, A Rapid and Sensitive Next-Generation Sequencing Method to Detect RB1 Mutations Improves Care for Retinoblastoma Patients and Their Families, J Mol Diagn 4(18), pp 480-93 T, Kivelä, 2009, 200 years of success initiated by James Wardrop’s 1809 monograph on retinoblastoma, Actaophthalmologic, (8), pp 810–2 56 10 Gao YJ, Qian J, Yue H, Yuan YF, Xue K, Yao YQ, 2011, Clinical characteristics and treatment outcome of children with intraocular retinoblastoma: a report from a Chinese cooperative group, Pediatr Blood cancer (57), pp 1113-6 11 Ming-yan He, Yu An, Yi-jinGao, Xiao-wen Qian, Gang Li, Jiang Qian, 2014, Screening of RB1 gene mutation in Chinese patients with retinoblastoma and preliminary exploration of genotype-phenotype correlations, Mol Vis (20), pp 545-552 12 Abramson DH, Beaverson K, Sangani P, Vora RA, Lee TC, Hochberg HM, Kirszrot J, Ranjithan M, 2003, Screening for retinoblastoma: presenting signs as prognosticators of patient and ocular survival, (112), pp 1248–55 13 Robson ME, Storm CD, Weitzel J, Wollins DS, Offit K, 2010, American Society of Clinical Oncology policy statement update: genetic and genomic testing for cancer susceptibility, J Clin Oncol 5(28), pp 893-901 14 Broaddus E, Topham A, Singh AD, 2009, Survival with retinoblastoma in the USA: 1975–2004, Br J Ophthalmol, (93), pp 24–7 15 MacCarthy A, Birch JM, Draper GJ, Hungerford JL, Kingston JE, Kroll ME, Stiller CA, Vincent TJ, Murphy MF, 2009, Retinoblastoma: treatment and survival in Great Britain 1963 to 2002, Br J Ophthalmol, (93), pp 38–9 16 MacCarthy A, Draper GJ, Steliarova-Foucher E, Kingston JE, 2006, Retinoblastoma incidence and survival in European children (1978–1997) Report from the Automated Childhood Cancer Information System project, Eur J Cancer, (42), pp 2092–102 17 DH, Abramson, 2005, Retinoblastoma in the 20th century: past success and future challenges the Weisenfeld lecture, Invest Ophthalmol & Vis Sci, (46), pp 2684–91 18 Ha Hai Nguyen, Hoa Thi Thanh Nguyen, Nhung Phuong Vu, Quynh Thuy Le, Chau Minh Pham, Thuong Thi Huyen Ma, Hung Manh Do, Hang Le Bich Pham, Ton Dang Nguyen, Hien Thi Thu Le, Hai Van Nong, 2018, Mutational 57 screening of germline RB1 gene in Vietnamese patients with retinoblastoma reveals three novel mutations, Molecular vision, (24), pp 231-238 19 Nguyen Cong Kiet, Le Thai Khuong, Do Duc Minh, Nguyen The Vinh, Nguyen Huynh Minh Quan, Phan Thi Xinh, Nguyen Ngoc Chau Trang, Nguyen Thanh Luan, Nguyen Minh Khai, Hoang Anh Vu, 2019, Spectrum of mutations in the RB1 gene in Vietnamese patients with retinoblastoma, Molecular Vision, (25), pp 215-221 20 Dietmar R Lohmann, MD and Brenda L Gallie, MD, 2015, Retinoblastoma., GenReviews 21 Balmer A1, Zografos L, Munier F, 2006, Diagnosis and current management of retinoblastoma, Oncogene, (38), pp 5341-9 22 Singh AD, Shields CL, Shields JA, 2000, Prognosis factors in retinoblastoma, Journal of Pediatric Ophthalmology and Strabismus, (3), pp 134-141 23 Moll AC, Hoekstra OS, Imhof SM, Comans EF, Schouten-van Meeteren AY, van der Valk P, Boers M, 2004, Fluorine-18 fluorodeoxyglucose positron emission tomography (PET) to detect vital retinoblastoma in the eye: preliminary experience, Ophthalmic Genet, (25), pp 31–5 24 Richter S, Vandezande K, Chen N, Zhang K, Sutherland J, Anderson J, Han L, Panton R, Branco P, Gallie, 2003, Sensitive and efficient detection of RB1 gen mutations enhances care for families with retinoblastoma, Am J Hum Gent, (2), pp 253-69 25 Reese AB, Ellsworth RM, 1963, The evaluation and current concept of retinoblastoma therapy, Trans Am Acad Ophthalmol Otolaryngol 67, pp 16472 26 Shields CL, Mashayekhi A, Au AK, Czyz C, Leahey A, Meadows AT, Shields JA., 2006, The International Classification of Retinoblastoma predicts chemoreduction success, Ophthalmology 113, pp 2276–80 27 A, Linn Murphree, 2005, Intraocular retinoblastoma: the case for a new group classification., Ophthalmol Clin North Am 18(1), pp 41-53 58 28 Al-Nawaiseh I1, Jammal HM, Khader YS, Jaradat I, Barham R, 2014, Retinoblastoma in Jordan, 2003-2013: ocular survival and associated factors, Ophthalmic Epidemiol 6, pp 406-11 29 Chantada G, Fandiño A, Dávila MT, Manzitti J, Raslawski E, Casak S, Schvartzman E, 2004, Results of a prospective study for the treatment of retinoblastoma, Cancer, (4), pp 834-42 30 Honavar SG, Manjandavida FP, Reddy VA, 2017, Orbital retinoblastoma: An update , Indian J Ophthalmol, pp 65:435 31 Chawla B, Hasan F, Seth R, Pathy S, Pattebahadur R, Sharma S, Upadhyaya A, Azad R., 2016, Multimodal therapy for stage III retinoblastoma (International Retinoblastoma Staging System): A prospective comparative study, Ophthalmology, (123), pp 1933–9 32 Chawla B, Hasan F, Azad R, Seth R, Upadhyay AD, Pathy S, Pandey RM, 2015, Clinical presentation and survival of retinoblastoma in Indian children, Br J Ophthalmol, (100), pp 172–8 33 Skalet AH, Gombos DS, Gallie BL, Kim JW, Shields CL, Marr BP, Plon SE, Chévez-Barrios P, 2018, Screening children at risk for retinoblastoma: consensus report from the American Association of Ophthalmic Oncologists and Pathologists, Ophthalmology, (125), pp 453-8 34 AlAli, A., et al., 2018, Retinoblastoma for Pediatric Ophthalmologists, Asia Pac J Ophthalmol (Phila) 35 Lee WH, Bookstein R, Hong F, Young LJ, Shew JY, Lee EY, 1987, Human retinoblastoma susceptibility gen: cloning, identification, and sequence, Science, (4794), pp 1394-9 36 Jr, Knudson AG, 1971, Mutation and cancer: statistical study of retinoblastoma, Proc Natl Acad Sci U S A, (4), pp 820-3 37 Ali MJ1, Parsam VL, Honavar SG, Kannabiran C, Vemuganti GK, Reddy VA, 2010, RB1 gen mutations in retinoblastoma and its clinical correlation, Saudi J Ophthalmol, (4), pp 119-23 59 38 Wiggs J, Nordenskjöld M, Yandell D, Rapaport J, Grondin V, Janson M, Werelius B, Petersen R, Craft A, Riedel K, 1988, Prediction of the risk of hereditary retinoblastoma, using DNA polymorphisms within the retinoblastoma gen, N Engl J Med, (3), pp 151-7 39 Cavenee WK, Dryja TP, Phillips RA, Benedict WF, Godbout R, Gallie BL, Murphree AL, Strong LC, White RL, 1983, Expression of recessive alens by chromosomal mechanisms in retinoblastoma, Nature, (305), pp 779-84 40 http://23pairsofchromosomes.com/search/RETINOBLASTOMA The Molecular and Cell Biology of Cancer 41 Sage, Deborah L.Burkhart & Julien, 2008, Cellular mechanisms of tumour suppression by the retinoblastoma gen, Nature Reviews Cancer, (8), pp 671682 42 JW, Harbour, 1998, Overview of RB gene mutations in patients with retinoblastoma Implications for clinical genetic screening, Ophthalmology 8(105), pp 1442-7 43 Valverde JR, Alonso J, Palacios I, Pestana A, 2005, RB1 gene mutation up-date, a meta-analysis based on 932 reported mutations available in a searchable database., BMC Genet (6), pp 53 44 He MY, An Y, Gao YJ, Qian XW, Li G, Qian J, 2014, Screening of RB1 gene mutations in Chinese patients with retinoblastoma and preliminary exploration of genotype-phenotype correlations, Mol Vis, (20), pp 545-52 45 Mohd Khalid MK, Yakob Y, Md Yasin R, Wee Teik K, Siew CG, Rahmat J, Ramasamy S, Alagaratnam J, 2015, Spectrum of germ-line RB1 gene mutations in Malaysian patients with retinoblastoma, Mol Vis (21), pp 1185-90 46 Ahani A, Akbari MT, Saliminejad K, Behnam B, Akhondi MM, Vosoogh P, Ghassemi F, Naseripour M, Bahoush G, Khorshid HR, 2013, Screening for large rearrangements of the RB1 gene in Iranian patients with retinoblastoma using multiplex ligation-dependent probe amplification, Mol Vis (19), pp 45462 60 47 Barbosa RH, Aguiar FC, Silva MF, Costa RA, Vargas FR, Lucena E, Carvalho de Souza M, de Almeida LM, Bittar C, Ashton Prolla P and others 2013, 2013, Screening of RB1 alterations in Brazilian patients with retinoblastoma and relatives with retinoma: phenotypic and genotypic associations., Invest Ophthalmol Vis Sci 5(54), pp 3184-94 48 Parma D, Ferrer M, Luce L, Giliberto F, Szijan I, 2017, RB1 gene mutations in Argentine retinoblastoma patients Implications for genetic counseling, PLoS One 12(12) 49 RA, Weinberg, 1995, The retinoblastoma protein and cell cycle control., Cell 81, pp 323-30 50 Usmanov RH, Kivelä T, 2014, Predicted Trends in the Incidence of Retinoblastoma in the Asia-Pacific Region, Asia Pac J Ophthalmol (Phila) 3(151-7) 51 NJ., Dyson, 2016, RB1: a prototype tumor suppressor and an enigma., Genes Dev 30, pp 1492-502 52 Lohmann DR, Gallie BL , 2004, Retinoblastoma: Revisiting the model prototype of inherited cancer., Am J Med Genet C Semin Med Genet 129C, pp 23-8 53 De Falco G, Giordano A , 2006, pRb2/p130: a new candidate for retinoblastoma tumor formation., Oncogene 25, pp 5333 54 Schouten JP, McElgunn CJ, Waaijer R, Zwijnenburg D, Diepvens F, Pals G , 2002, Relative quantification of 40 nucleic acid sequences by multiplex ligationdependent probe amplification, Nucleic Acids Res 20, pp e57-57 55 Ahani A, Behnam B, Khorram Khorshid HR, Akbari MT , 2011, RB1 Gene mutations in Iranian patients with retinoblastoma: report of four novel mutations., Cancer Genet 204, pp 316- 22 56 Rushlow DE, Mol BM, Kennett JY, Yee S, Pajovic S, Théri- ault BL, PrigodaLee NL, Spencer C, Dimaras H, Corson TW, Pang R, Massey C, Godbout R, Jiang Z, Zacksenhaus E, Paton K, Moll AC, Houdayer C, Raizis A, Halliday W, 61 Lam WL, Boutros PC, Lohmann D, Dorsman JC, Gallie BL , 2013; , Characterisation of retinoblastomas without RB1 mutations: genomic, gene expression, and clinical studies, Lancet Oncol 14, pp 327-34 57 Rizzolio F, Lucchetti C, Caligiuri I, Marchesi I, Caputo M, Klein-Szanto AJ, Bagella L, Castronovo M, Giordano A , 2012, Retinoblastoma tumorsuppressor protein phosphorylation and inactivation depend on direct interaction with Pin1, Cell Death Differ 19, pp 1152-61 58 Palazzi MA, Yunes JA, Cardinalli IA, Stangenhaus GP, Bran- dalise SR, Ferreira SA, Sobrinho JSP, Villa LL , 2003, Detection of oncogenic human papillomavirus in sporadic retinoblastoma., Acta Ophthalmol Scand 81, pp 396-8 59 M, Esteller, 2002, CpG island hypermethylation and tumor suppressor genes: a booming present, a brighter future, Oncogene 21, pp 5427 62