Nghiên cứu được thiết kế nhằm tìm hiểu mối liên quan của các điểm biến đổi của gen FCAR với sự hình thành và tiến triển bệnh thận IgA cũng như sự ảnh hưởng của nồng độ sCD89-IgA trong huyết thanh của bệnh nhân bệnh thận IgA.
Y Học TP Hồ Chí Minh * Tập 16 * Phụ Số * 2012 Nghiên cứu Y học NGHIÊN CỨU PHÁT HIỆN CD89 NHƯ MỘT MARKER MỚI TRONG DỰ ĐOÁN TIẾN TRIỂN SUY THẬN Ở BỆNH THẬN IgA Vương Tuyết Mai*, Leonid Padyukov** TÓM TẮT Đặt vấn đề: Bệnh thận IgA dạng thường gặp viêm cầu thận, đặc trưng lắng đọng IgA khu vực gian mạch cầu thận Lưu thông huyết tương, globulin miễn dịch A (IgA) gắn với thụ thể Fc alpha (FCAR CD89) thành phức hợp hòa tan Phức hợp sCD89-IgA chứng minh có liên quan đến hình thành bệnh thận IgA Mục tiêu nghiên cứu: Tìm hiểu mối liên quan điểm biến đổi gen FCAR với hình thành tiến triển bệnh thận IgA ảnh hưởng nồng độ sCD89-IgA huyết bệnh nhân bệnh thận IgA Đối tượng phương pháp: Phương pháp ELISA gián tiếp phát sCD89-IgA huyết lần áp dụng cho nghiên cứu 177 bệnh nhân bệnh thận IgA 115 người khỏe mạnh Chúng tơi phân tích nồng độ sCD89-IgA 62 mẫu huyết từ bệnh nhân bệnh thận IgA theo chiều dọc 15 năm Kiểu gen 05 điểm biến đổi (SNPs) gen FCAR thực tất 689 mẫu DNA phương pháp phân tích di truyền allele dựa vào TaqMan Kết quả: Có khác biệt có ý nghĩa thống kê nồng độ thấp phức hợp sCD89-IgA nhóm bệnh thận IgA tiến triển nặng với nhóm không tiến triển (p = 0,002, Mann-Whitney thử nghiệm) Những bệnh nhân có chức thận ổn định khơng tiến triển bệnh có nồng độ ổn định sCD-IgA cao, trái ngược với nồng độ thấp sCD89 nhóm tiến triển suy thận nặng, kết nghiên cứu bệnh nhân có mẫu huyết theo dõi từ đến 15 năm Kết luận: Nghiên cứu chúng tơi cho thấy phức hợp sCD89-IgA có vai trò quan trọng dự đoán tiến triển suy thận bệnh thận IgA Từ khoá: Gen FCAR, phức hợp sCD-IgA, bệnh thận IgA, điểm biến đổi gen, SNP ABSTRACT CD89 AS ONE OF BIOMARKERS FOR PROGRESSIVE RENAL FAILURE OF IgA NEPHROPATHY Vuong Tuyet Mai, Leonid Padyukov * Y Hoc TP Ho Chi Minh * Vol 16 - Supplement of No 3- 2012: 223 - 228 Background:IgA nephropathy is the most common form of glomerulonephritis, characterized by IgA deposition in the mesangial region of the glomeruli Fc alpha receptor (FcαRI or CD89) is involved in immunoglobulin A (IgA) complex formation in the circulation CD89-IgA complexes have been suggested to be implicated in development of IgA nephropathy Objective:Investigate genetic variations of the Fc alpha receptor(FCAR) gene in relation to susceptibility to IgAN and the expression of soluble IgA receptor (sCD89) in plasma of IgAN patients with or without disease progression and in healthy controls Bộ môn Nội ĐH Y Hà Nội Tác giả liên lạc: TS Vương Tuyết Mai * Chuyên Đề Thận Niệu 2012 Viện Karolinska, Thụy Điển ĐT: 0915518775 Email: vuongtuyetmai@gmail.com ** 223 Nghiên cứu Y học Y Học TP Hồ Chí Minh * Tập 16 * Phụ Số * 2012 Patients and methods Two hundred and twelve unrelated patients (146 males and 66 females), mean age 38.5±14.4 years (range 17 to 77 years) with biopsy-proven IgAN and 477 healthy (321 males and 156 females), mean age 44.8 ± 13.0 years (range 18 to 80 years) were included in the study A sandwich ELISA method was developed Soluble CD89 (sCD89) bound to IgA in human sera was analyzed in 177 IgAN patients and 115 healthy controls We also analysis the levels of sCD89 of 62 serum samples from seven longitudinal IgAN patients, who had followed up 15 years Genotyping for single nucleotide polymorphisms (SNPs) of the FCAR gene was performed in all samples using a TaqMan allelic discrimination assay Results There was a significant difference between the levels of sCD89-IgA complexes in IgAN patients with and without disease progression (p=0.002, Mann-Whitney Test) and none significant difference was found in the disease control group (p=0.326, Mann-Whitney Test) The patients with non-progression had stable with high level of sCD89, in contrast to low level of sCD89 in progression group during up to 15 years of follow-up with repeated measures data Conclusions Our data ssuggested sCD89-IgA complexes in plasma as one of possible biomarkers for progressive renal failure of IgA Nephropathy Key words: FCAR gene, sCD89-IgA, IgA nephropathy, polymorphism, SNP (146 nam 66 nữ), tuổi trung bình 38,5 ± 14,4 ĐẶT VẤN ĐỀ (17 đến 77 tuổi) 477 đối tượng khỏe mạnh Trong bệnh lý cầu thận, bệnh thận IgA (321 nam 156 nữ), tuổi trung bình 44,8 ± 13,0 nhóm bệnh thường gặp (18 đến 80 tuổi) với tiêu chẩn đoán xác định bệnh lắng Tách chiết DNA thực đọng IgA gian mạch cầu thận Sau thời phương pháp “salting-out” từ máu toàn phần gian mắc bệnh từ 10-20 năm, khoảng 30% bệnh giữ trong EDTA từ phân nhân tiến triển đến bệnh thận giai đoạn đoạn tế bào máu có nhân Sau tách chiết chất cuối (end stage renal disease-ESRD) đòi hỏi phải lượng DNA hồ tan xác định bước đặt điều trị thận thay thế(1; 2) Khi lưu thông 260/280 nm với spectrophotometer DU600 series huyết thanh, IgA gắn với CD89 thành phức (Beckman Coulter, Bromma, Thụy Điển) hợp hòa tan, với thụ thể tế bào(3; 4) Phương pháp phân tích di truyền Allele dựa Phức hợp IgA-CD89 xác định có vai trò vào TaqMan (Allele-specific TaqMan assays quan trọng lắng đọng IgA gian mạch Applied Biosystems, Foster City, Hoa Kỳ) (5) cầu thận Chúng đặt giả thiết phức sử dụng cho việc xác định kiểu gen rs hợp sCD89-IgA hồ tan huyết có thuộc gen FCAR thể maker quan trọng cho hình thành bệnh Kỹ thuật ELISA gián tiếp sử dụng để thận IgA yếu tố nguy tiến phát phức hợp CD89-IgA huyết triển đến suy thận bệnh nhân bệnh thận IgA Kháng thể sử dụng kháng thể Do chúng tơi tiến hành nghiên cứu nhằm đơn dòng chuột CD89 (A3) người (Abcam) mục đích tìm hiểu mối liên quan điểm kháng thể thứ sử dụng kháng thể biến đổi gen FCAR với hình thành thỏ cộng hợp alkaline phosphatase kháng IgA tiến triển bệnh thận IgA ảnh hưởng người (Dako, Glostrup, Denmark) Các mẫu nồng độ sCD89-IgA huyết huyết pha loãng hai mức độ (1:10 bệnh nhân bệnh thận IgA 1:1000) pha loãng mức độ theo số 10 ĐỐI TƯỢNG - PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU (1:10-1:10000) Phản ứng với alkaline Nghiên cứu thực 689 mẫu phosphatase chất (Sigma-Aldrich) đo DNA di truyền từ hai trăm mười hai bệnh nhân bước sóng (OD) 405 nm máy Multiscan bệnh thận IgA khơng có quan hệ huyết thống MS spectrophotometer (Labsystems, Finland) 224 Chuyên Đề Thận Niệu 2012 Y Học TP Hồ Chí Minh * Tập 16 * Phụ Số * 2012 Để so sánh tỷ lệ phần trăm kiểu gen, allele kiểu hình, test X bình phương Fisher’s exact sử dụng với phần mềm SPSS Nghiên cứu Y học Haplotype phân tích chương trình HaploView KẾT QUẢ Tỷ lệ kiểu gen allele SNPs thuộc gen FCAR bệnh thận IgA Bảng 1: Tỷ lệ kiểu gen SNPs thuộc gen FCAR bệnh thận IgA nhóm chứng Tỷ lệ kiểu gen mơ hình đồng phối hợp gen SNPs FCAR rs11084377 Total AA AG GG Chứng 312 36 (11.5%) 130 (41.7%) 146 (46.8%) Bệnh 139 (4.3%) 67 (48.2%) 66 (47.5%) FCAR rs4806605 Nhóm n=451 Total CC CT TT Chứng Bệnh 310 140 207 (66.8%) 96 (68.6%) 93 (30%) 40 (28.6%) 10 (3.2%) (2.8%) FCAR rs10402324 Chứng Nhóm Total 302 AA 135 (44.7%) AG 138 (45.7%) GG 29 (9.6%) n=444 Bệnh 142 51 (35.9%) 71 (50%) 20 (14.1%) FCAR rs1865097 Nhóm n=450 Total AA AG GG Chứng Bệnh 312 131 33 (10.6%) 20 (15.3%) 143 (45.8%) 59 (45%) 136 (43.6%) 52 (39.7%) FCAR rs16986050 Total AA AG GG Chứng 319 210 (65.8%) 93 (29.2%) 16 (5%) Bệnh 137 90 (65.7%) 44 (32.1%) (2.2%) Nhóm n=443 Nhóm n=456 X p-value 6.335 0.04 0.155 0.93 3.918 0.14 2.039 0.36 2.117 0.35 Bảng 2: Tỷ lệ allele SNPs thuộc gen FCAR bệnh thận IgA nhóm chứng Gen FCAR SNPs Số allele bệnh, chứng Tỷ lệ allele bệnh, chứng X P value rs11084377 309:117, 643:281 0.725, 0.696 1.218 0.27 rs4806605 88:342, 176:746 0.205, 0.191 0.353 0.55 rs10402324 158:272, 288:608 0.367, 0.321 2.756 0.09 rs1865097 144:256, 305:617 0.360, 0.331 1.060 0.30 rs16986050 338:68, 755:173 0.833, 0.814 0.684 0.41 Chuyên Đề Thận Niệu 2012 225 Nghiên cứu Y học Y Học TP Hồ Chí Minh * Tập 16 * Phụ Số * 2012 Nồng độ phức hợp sCD89-IgA nhóm bệnh thận IgA tiến triển đến bệnh thận mạn tính giai đoạn cuối nhóm khơng có suy thận Nhóm bệnh thận IgA khơng có tiến triển suy thận Nhóm bệnh thận IgA tiến triển đến ESRD Biểu đồ: Phân bố nồng độ phức hợp sCD89-IgA nhóm bệnh thận IgA tiến triển đến bệnh thận mạn tính giai đoạn cuối nhóm khơng có suy thận phân tử sCD89 tiếp xúc với kháng thể Phân bố cho thấy rõ nhóm bệnh thận Do phức hợp phân ly IgA khơng tiến triển đến suy thận có nồng độ ống nghiệm chất tẩy rửa mạnh mà phức hợp sCD89-IgA cao khác biệt có ý phản ứng trường hợp không thực nghĩa thống kê với nhóm bệnh thận IgA tiến biến tính kháng thể Đây triển đến ESRD lý sCD89 chưa công bố BÀN LUẬN định lượng huyết người cho dù Trong nghiên cứu này, phát triển nghiên cứu sCD89 tiết hành đa phương pháp để phát CD89 hòa dạng phòng thí nghiệm tan huyết thông qua xác định phức nghiên cứu thực nghiệm chuột (transgenic hợp sCD89-IgA huyết người mice)(5) phương pháp áp dụng cho 177 Western blotting có hiệu áp dụng bệnh nhân bệnh thận IgA 115 người khỏe cao phương pháp mạnh định lượng xác Chính chúng tơi Trước chúng tơi có nhiều nhóm nghiên cứu khác cố gắng để định lượng sCD89 trực tiếp huyết thất bại Thực tế cho thấy tất sCD89 phân tử kết hợp chặt chẽ để IgA phức hợp CD89-IgA phần nhỏ 226 định giải vấn đề cách định lượng phức hợp sCD89-IgA thay sCD89 phân tử đơn độc, thơng qua việc sử dụng kháng thể kháng IgA loại kháng thể thứ hai sandwich ELISA Kết hợp với sCD89 huyết với kháng thể đặc hiệu thứ Chuyên Đề Thận Niệu 2012 Y Học TP Hồ Chí Minh * Tập 16 * Phụ Số * 2012 nhất, đơn dòng kháng thể CD89 đảm bảo độ đặc hiệu phản ứng Từ nghiên cứu bước đầu thành công cho thấy phương pháp sử dụng để phát lưu hành sCD89 huyết thanh/plasma nhiều loại bệnh lý khác Kết nghiên cứu của cho thấy khác biệt có ý nghĩa thống kê nồng độ thấp phức hợp sCD89-IgA huyết bệnh nhân bệnh thận IgA tiến triển đến bệnh thận mạn tính giai đoạn cuối so với nhóm chứng Điều quan trọng xét nghiệm thời điểm nồng độ phức hợp sCD89-IgA creatinine huyết nhóm bệnh thận IgA tiến triển đến bệnh thận mạn tính giai đoạn cuối nhóm khơng có suy thận cho thấy phân bố nồng độ phức hợp sCD89-IgAổn định mức thấp nồng độ creatinine huyết nhóm bệnh thận IgA tiến triển đến bệnh thận mạn tính giai đoạn cuối Ngược lại nhóm khơng có suy thận nồng độ sCD89-IgA ổn định mức cao giai đoạn theo dõi liên tiếp từ 5-15 năm Khi bắt bắt đầu tiến hành nghiên cứu, bước đầu tiên, xác định kiểu gen FCAR phân tích phân bố bệnh nhân bệnh thận IgA người khoẻ mạnh Việc lựa chọn maker dựa kinh nghiệm nghiên cứu trước xác định kiểu gen vị trí khác gen chọn SNP vị trí khác cho bao phủ hầu hết chiều dài gen Kết nghiên cứu cho thấy tái tổ hợp gen tương đối thấp chủng tộc da trắng: tổng số 32 tái tổ hợp gen có ghi nhận tái tổ hợp phổ biến nhóm đối tượng nghiên cứu Bằng chứng LD mạnh khu vực này, mặt lý thuyết tăng khả cho phát mối liên quan SNP với bệnh thận IgA haplotype Tuy nhiên chúng tơi khơng tìm thấy khác biệt có ý nghĩa thống kê tỷ lệ kiểu gen allele Chuyên Đề Thận Niệu 2012 Nghiên cứu Y học nhóm bệnh nhân bệnh thận IgA nhóm chứng Điều quan trọng nghiên cứu cho thấy nồng độ huyết sCD89-IgA ổn định mức thấp bệnh nhân bị bệnh thận IgA tiến triển đến bệnh thận mạn tính giai đoạn cuối liên tục cao bệnh nhân bị bệnh thận IgA triệu chứng ổn định khơng có dấu hiệu tiến triển chế đằng sau tác dụng chưa rõ ràng Chúng tơi suy đốn thiếu hụt sCD89 yếu tố tham gia vào làm tăng tiến triển nặng bệnh nhân bệnh thận IgA phức hợp sử dụng biomarker cho dự đoán tiến triển nặng bệnh nhân viêm cầu thận IgA KẾT LUẬN Kết thí nghiệm chúng tơi cho phép kết luận có mối liên quan nồng độ thấp phức hợp sCD89-IgA huyết tương nguy suy thận nặng bệnh thận IgA Có khả có tham gia yếu tố gen di truyền tổng hợp ảnh hưởng tới nồng độ sCD89-IgA huyết Những nghiên cứu vai trò gen FCAR lưu hành phức hợp sCD89-IgA huyết ảnh hưởng đến chế bệnh sinh bệnh thận IgA cần thực TÀI LIỆU THAM KHẢO Berthoux FC, Mohey H, Afiani A Natural history of primary IgA nephropathy Semin Nephrol 2008; 28: 4–9 Donadio JV, Grande JP IgA nephropathy N Engl J Med Sep 2002;347(10):738-748 Floege J, Feehally J IgA nephropathy: recent developments J Am Soc Nephrol Dec 2000;11(12):2395-2403 Van der Boog PJ, van Kooten C, de Fijter JW, Daha MR Role of macromolecular IgA in IgA nephropathy Kidney Int Mar 2005;67(3):813-821 Launay P, Grossetete B, Arcos-Fajardo M, et al Fcalpha receptor (CD89) mediates the development of immunoglobulin A (IgA) nephropathy (Berger's disease) Evidence for pathogenic soluble receptor-Iga complexes in patients and CD89 transgenic mice J Exp Med Jun 2000;191(11):1999-2009 227 ... khơng có suy thận Nhóm bệnh thận IgA khơng có tiến triển suy thận Nhóm bệnh thận IgA tiến triển đến ESRD Biểu đồ: Phân bố nồng độ phức hợp sCD89 -IgA nhóm bệnh thận IgA tiến triển đến bệnh thận mạn... bệnh thận IgA tiến triển đến bệnh thận mạn tính giai đoạn cuối nhóm khơng có suy thận cho thấy phân bố nồng độ phức hợp sCD89 -IgA n định mức thấp nồng độ creatinine huyết nhóm bệnh thận IgA tiến. .. Y học nhóm bệnh nhân bệnh thận IgA nhóm chứng Điều quan trọng nghiên cứu cho thấy nồng độ huyết sCD89 -IgA ổn định mức thấp bệnh nhân bị bệnh thận IgA tiến triển đến bệnh thận mạn tính giai đoạn