Mục tiêu nghiên cứu của bài viết nhằm đánh giá mối liên quan giữa đa hình nucleotid đơn R72P của gen TP53 với khả năng mắc ung thư tế bào gan nguyên phát ở bệnh nhân nhiễm HBV mạn tính.
TẠP CHÍ NGHIÊN CỨU Y HỌC ĐA HÌNH NUCLEOTID ĐƠN R72P TRÊN GEN TP53 VÀ ĐÁNH GIÁ NGUY CƠ MẮC UNG THƯ TẾ BÀO GAN NGUYÊN PHÁT Ở NGƯỜI NHIỄM HEPATITIS B VIRUS Trịnh Quốc Đạt, Trần Huy Thịnh Trường Đại học Y Hà Nội Đa hình nucleotid đơn (SNP) R72P vùng exon gen áp chế ung thư TP53 liên quan đến hình thành phát triển nhiều loại hình ung thư, có ung thư tế bào gan ngun phát Với mục đích tìm kiếm mối liên quan kiểu gen SNP R72P HBV hình thành khối u gan, tiến hành đánh giá khả mắc ung thư tế bào gan nguyên phát kiểu gen R72P người nhiễm HBV mạn tính Đối tượng nghiên cứu 280 bệnh nhân ung thư tế bào gan nguyên phát có 171 trường hợp nhiễm HBV, nhóm chứng 267 đối tượng có 36 trường hợp nhiễm HBV Sử dụng kỹ thuật enzym cắt giới hạn (RFLP) để phân tích kiểu gen R72P, sau đánh giá tỷ lệ phân bố khả mắc bệnh kiểu gen Kết cho thấy, kiểu gen P72P SNP R72P làm tăng khả mắc ung thư tế bào gan nguyên phát cho người nhiễm HBV OR = 3,23 ; 95% ; CI (1,12 – 9,45) Từ khóa: TP53 R72P, HBV, ung thư gan tế bào gan nguyên phát I ĐẶT VẤN ĐỀ TP53 gen áp chế ung thư nằm vị trí p13.3 nhiễm sắc thể số 17, mã hóa protein p53 có trọng lượng phân tử 53kDa - protein nhóm điều hòa chu kỳ tế bào TP53 hoạt động yếu tố phiên mã, đóng vai trò quan trọng đường chuyển hóa số trình hoạt động tế bào như: sửa chữa DNA, tạo mạch, kìm hãm xem gen ức chế khối u Gần hướng nghiên cứu quan tâm đa hình nucleotid đơn TP53 có liên quan đến bệnh ung thư Kết nghiên cứu công bố cho thấy có 200 SNP tìm thấy vùng mã hóa khơng mã hóa gen TP53 [5; 6] Các SNP tạo kiểu gen khác chu trình tế bào, tế bào chết theo chương trình [1 - 3] Khi có tổn thương DNA, TP53 làm ngừng chu trình tế bào DNA bị tổn thương sửa chữa TP53 làm cho tế bào chết theo chương trình (apoptosis) khơng khả sửa chữa DNA [3; 4] Chính đặc tính sinh học mà TP53 TP53 cộng đồng Các nghiên cứu có khác khả mắc ung thư kiểu gen Đây coi yếu tố nguy cần quan tâm Một SNP biết đến nhiều R72P, SNP vị trí codon 72 trên exon gen TP53 Sự thay trình tự nucleotid codon 72 dẫn đến ba CGC mã hóa cho arginin chuyển thành ba CCC mã hóa cho prolin [6; 7] Sự thay dẫn đến thay đổi khả bám p53 đoạn trình tự đặc hiệu gen đích, thay đổi q trình hồn thiện, tính ổn định protein Địa liên hệ: Trần Huy Thịnh, Bộ mơn Hóa sinh, Trường Đại học Y Hà Nội Email: tranhuythinh@hmu.edu.vn Ngày nhận: 21/4/2017 Ngày chấp nhận: 26/6/2017 16 TCNCYH 108 (3) - 2017 TẠP CHÍ NGHIÊN CỨU Y HỌC thay đổi khả tương tác p53 với protein nội bào [2; 3] Đây yếu tố nguy cho ổn định tế bào mầm mống cho xuất ung thư Virus viêm gan B từ lâu khẳng định yếu tố nguy gây ung thư tế bào gan nguyên phát [8; 9] Việt Nam quốc gia WHO xếp vào vùng dịch tễ nhiễm virus viêm gan B cao giới Các kết nghiên cứu trước đây, công bố SNP R72P của gen TP53 liên quan đến nguy mắc ung thư tế bào gan nguyên phát Câu hỏi nghiên cứu đặt kiểu gen đa hình nucleotid đơn có làm tăng khả mắc ung thư tế bào gan cho người nhiễm HBV mạn tính hay khơng? Do nghiên cứu tiến hành nhằm đánh giá mối liên quan đa hình nucleotid đơn R72P gen TP53 với khả mắc ung thư tế bào gan nguyên phát bệnh nhân nhiễm HBV mạn tính II ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP Đối tượng - 280 mẫu máu bệnh nhân ung thư tế bào gan nguyên phát, điều trị khoa Nội Tiêu hoá bệnh viện Bạch Mai Trung tâm Ung bướu Thanh Hoá từ tháng 11 năm 2013 đến tháng năm 2015 - 267 mẫu máu lựa chọn ngẫu nhiên, người đến khám điều trị số bệnh mạn tính Bệnh viện Đa khoa tỉnh Thanh Hố dùng làm nhóm đối chứng Những bệnh nhân khám kiểm tra cận lâm sàng kết luận không mắc ung thư tế bào gan nguyên phát hay loại hình ung thư khác Nghiên cứu thực Trung tâm Nghiên cứu Gen - Protein, Trường Đại học Y Hà Nội Phương pháp TCNCYH 108 (3) - 2017 2.1 Quy trình - Thu thập mẫu máu bệnh nhân ung thư tế bào gan nguyên phát mẫu chứng - Sử dụng kỹ thuật sinh học phân tử xác định kiểu gen SNP R72P - Phỏng vấn tiền sử hồi cứu bệnh án điều trị để xác định nhiễm HBV - Sử dụng phần mềm thống kê để phân tích xử lý kết 2.2 Tách chiết DNA - DNA tách chiết theo phương pháp phenol/chloroform từ máu ngoại vi bệnh nhân Ung thư tế bào gan nguyên phát người lành đối chứng - Kiểm tra độ tinh đo nồng độ DNA tách chiết phương pháp đo quang, dựa vào tỷ lệ A260nm/A280nm = 1,8 - 2,0 2.3 Xác định kiểu gen TP53 codon 72 Arg/72/Pro kỹ thuật RFLP Khuyếch đại vùng gen chứa SNP R72P gen TP53 phương pháp PCR sử dụng cặp mồi đặc hiệu: Mồi xuôi: 5’- CTG GTA AGG ACA AGG GTT GG - 3’; Mồi ngược: 5’- ACT GAC CGT GCA AGT CAC AG - 3’ Sau khuếch đại cặp mồi đặc hiệu, sản phẩm PCR kiểm tra cắt enzym giới hạn BstUI điều kiện 37oC qua đêm Sản phẩm cắt điện di với thang chuẩn 100bp gel agarose 2% Các băng DNA nhuộm ethidium bromide chụp ảnh hệ thống máy EC3 Imaging system Đoạn gen nghiên cứu chứa trình tự nhận biết enzyme BstUI (CG CG) vị trí codon 72 Khi BstUI cắt đoạn gen tạo đoạn DNA có kích thước 165 bp 231 bp, tương ứng với allen R72 (wild type-GG) Khi nucleotid G bị thay C làm trình tự nhận biết enzym BstUI, đoạn 17 TẠP CHÍ NGHIÊN CỨU Y HỌC gen không bị cắt, tương ứng với allen P72 (mutant type - CC) Do vậy, kiểu gen R72R có hai băng, kiểu gen P72P có băng kiểu gen R72P có ba băng hình ảnh điện di Kết này, kiểm tra lại giải trình tự trực tiếp mắc ung thư tế bào gan nguyên phát người nhiễm HBV Ước tính qua tỷ suất OR, với khoảng tin cậy mức ý nghĩa 95% Đạo đức nghiên cứu Đề tài thông qua hội đồng đạo đức nghiên cứu y sinh học Trường Đại học Y Hà Nội chấp thuận số 118/HĐĐĐĐHYHN Bệnh nhân hoàn toàn tự nguyện tham gia vào nghiên cứu Bệnh nhân có quyền rút lui khỏi nghiên cứu khơng đồng ý tiếp tục tham 2.4 Phân tích số liệu Sử dụng phần mềm thống kê SPSS 16,0 để phân tích số liệu Dùng kiểm định χ² để so sánh tỷ lệ kiểu gen SNP R72P nhóm bệnh chứng Phân tích đa biến phương trình hồi quy logistic đa biến để đánh giá mối liên quan kiểu gen R72P khả gia vào nghiên cứu Các thông tin cá nhân đảm bảo bí mật III KẾT QUẢ Bảng Đặc điểm nhóm đối tượng nghiên cứu Bệnh Đặc điểm Giới Chứng n % n % Nam 239 85,4 214 80,1 Nữ 41 14,6 53 19,9 Tuổi (năm) 57 ± 11,6 56 ± 15,5 p 0,06 0,2 Nghiện rượu 23 8,2 3,3 Nhiễm HBV 171 61,1 36 13,5 Nhiễm HCV 12 4,3 1,5 Trong 547 đối tượng nghiên cứu có 280 bệnh nhân ung thư tế bào gan nguyên phát 267 người đối chứng Kết cho thấy khơng có khác biệt có ý nghĩa thống kê độ tuổi trung bình tỷ lệ giới tính nhóm bệnh nhóm chứng Điều đồng nghĩa với việc nhóm bệnh nhóm chứng tương đồng tuổi, điều phù hợp với nghiên cứu bệnh chứng Ngoài ra, kết cho thấy tỷ lệ mắc bệnh nam cao nữ nhiều, với 5,8 nam nữ Kết bảng cho thấy tỷ lệ bệnh nhân ung thư tế bào gan nguyên phát có HBV dương tính cao, 171/280 bệnh nhân, chiếm 61,1% Đây yếu tố ghi nhận nhiều số yếu tố nguy ung thư tế bào gan ngun phát, chúng tơi tìm kiếm Trong đó, tỷ lệ nhiễm HCV nghiện rượu thấp nhiều Lần lượt 4,3% 8,2% 18 TCNCYH 108 (3) - 2017 TẠP CHÍ NGHIÊN CỨU Y HỌC Hình Sản phẩm cắt đoạn gen mang SNP R72P enzym BstUI MK: Thang chuẩn 100-1000bp; (+) mẫu biết trước kiểu gen dị hợp R72P (GC) làm chứng dương Kiểu gen đồng hợp tử P72P (CC) có vạch, xuất mẫu chứng B85 mẫu bệnh KG75, KG76 Kiểu gen dị hợp tử R72P (GC) có ba vạch, xuất mẫu chứng B31, B33, B36 mẫu bệnh KG85, KG87 Kiểu gen đồng hợp tử R72R (GG) có hai vạch xuất mẫu chứng B35 mẫu bệnh KG86 Bảng Kiểu gen SNP R72P khả mắc ung thư tế bào gan nguyên phát người nhiễm HBV Đa hình kiểu gen TP53 R72P HBV (+) OR* CI (95%) HBV (-) OR* CI (95%) R72R 1,00 1,00 R72P 1,43 (0,51 – 4,01) 1,07 (0,95 – 3,31) P72P 3,23 (1,12 – 9,45) 1,39 (0,99 – 2,71) * OR điều chỉnh từ biến: tuổi, giới, HBV, HCV, nghiện rượu, theo mơ hình hồi quy logistic đa biến Kết bảng cho thấy, kiểu gen SNP R72P gen TP53 có liên quan với nguy mắc Ung thư tế bào gan nguyên phát người nhiễm virus HBV Đặc biệt kiểu gen P72P làm tăng khả mắc bệnh người nhiễm HBV lên cách có ý nghĩa OR = 3,23 ; 95% ; CI (1,12 – 9,45) Khi so sánh nhóm nhiễm HBV với nhóm khơng nhiễm HBV, thấy có khác biệt tỷ suất OR kiểu gen SNP R72P Bảng So sánh nguy mắc ung thư tế bào gan nguyên phát kiểu gen SNP R72P yếu tố nguy Yếu tố nguy OR* CI (95%) Nam giới 1,35 (0,78 – 2,30) > 40 tuổi 2,26 (1,33 - 2,86) TCNCYH 108 (3) - 2017 19 TẠP CHÍ NGHIÊN CỨU Y HỌC HBV (+) 11,67 (7,48 - 18,23) HCV (+) 7,15 (2,10 - 24,3) Nghiện rượu 3,72 (1,50 – 9,21) Kiểu gen P72P 1,77 (1,03 - 3,14) * OR điều chỉnh từ biến: tuổi, giới, HBV, HCV, nghiện rượu, theo mô hình hồi quy logistic đa biến Kết cho thấy tỷ xuất OR nhiễm HBV cao nhất, nam so với nữ thấp ý nghĩa thống kê khoảng tin cậy chứa Tỷ suất OR kiểu gen P72P cao so với kiểu gen R72P 1,77 lần cách có ý nghĩa Đây tỷ suất OR chung cho nhóm đối tượng nghiên cứu IV BÀN LUẬN Virus viêm gan B làm yếu tố nguy lớn ung thư tế bào gan nguyên phát phạm vi toàn giới Việt Nam nằm vùng dịch tễ nhiễm HBV cao, nên số trường hợp ung thư tế bào gan nguyên phát có tiền sử nhiễm HBV nhiều Tuy nhiên, thực tế có nhiều trường hợp có tiền sử viêm gan virus B không tiến triển thành ung thư tế bào gan Hoặc nhiễm HBV có người khởi phát ung thư gan trẻ có người khởi phát chậm Các kiểu gen TP53 có vai trò tượng khơng Nhóm nghiên cứu tiến hành vấn tiền sử nhiễm virus đối tượng nghiên cứu kết hợp với hồi cứu bệnh án điều trị bệnh nhân ung thư gan Kết cho thấy tỷ lệ nhiễm HBV cao nhóm bệnh Sử dụng phân tích đa biến để tìm mối tương quan kiểu gen SNP R72P với tình trạng nhiễm HBV nguy mắc ung thư tế bào gan nguyên phát, thu kết đáng ý Khi phân tích liên quan kiểu gen với khả mắc ung thư cho 207 trường 20 hợp nhiễm HBV (171 trường hợp thuộc nhóm ung thư tế bào gan nguyên phát 36 trường hợp thuộc nhóm chứng) húng thấy kiểu gen P72P SNP R72P gen TP53 làm tăng khả mắc ung thư tế bào gan lên cách có ý nghĩa Chỉ số cao so với nhóm khơng nhiễm HBV cao so với phân tích nhóm 547 đối tượng nghiên cứu (bảng 3) Kết nghiên cứu phù hợp với số nghiên cứu công bố Đặc biệt nghiên cứu khu vực Đông Á [10 - 12] Một nghiên cứu Hàn Quốc có kết quả, người nhiễm HBV mang kiểu gen P72P SNP R72P gen TP53 tăng khả mắc ung thư tế bào gan nguyên phát cao người mang kiểu gen nguyên thuỷ R/R [9] Đặc biệt, nghiên cứu Đài Loan năm 2005 Zhu cộng cho thấy, allen 72P SNP TP53 R72P làm tăng nguy mắc bệnh cho người nhiễm HBV lên 11 lần [12] Tuy kết có khác kết luận nghiên cứu chúng tôi, khẳng định kiểu gen P72P SNP R72P làm tăng khả mắc bệnh cho người nhiễm HBV Điều này, cho phép nhóm nghiên cứu đưa nhận định tương tác gen TP53 với virus viêm gan B Sự tương tác theo chiều hướng mắc bệnh kiểu gen TP53 đột biến Con đường tín hiệu p53, dòng tín hiệu nội bào mà TP53 thành tố trung tâm, bị kích hoạt yếu tố nguy tổn hại gen có TCNCYH 108 (3) - 2017 TẠP CHÍ NGHIÊN CỨU Y HỌC virus Các virus xâm nhập tế bào kích hoạt dòng tín hiệu sinh trưởng bất thường oncogen Hay gặp p14ARF Đây protein nội bào có khả ức chế MDM2 Một gen điều hoà đường tín hiệu p53, có chức điều hồ ngược âm tính TP53 Khi tín hiệu virus xâm nhập p14ARF cảnh báo đến TP53 gián tiếp qua việc ức chế MDM2 Khi MDM2 bị ức chế giải phóng TP53 để thực chức sinh học [1] Kết tế bào gan giữ ổn định gen trước tác động từ virus Tuy nhiên TP53 bất thường, tín hiệu virus xâm nhập truyền đến khơng giải giải không triệt để Hậu virus vô tư làm tổn thương gen tế bào, để tạo tế bào có đặc tính di truyền quái đản, hay tế bào ung thư Các kiểu gen đột biến SNP R72P bất thường Việc thay nucleotid codon 72 làm ảnh hưởng đến khả kích hoạt chết tế bào theo chương trình cuả TP53 [6; 7] Trong kích hoạt chết tế bào theo chương trình lại chế ức chế khối u quan trọng TP53 Trong nghiên cứu sử dụng thuật ngữ khả mắc bệnh để phiên giải tỷ suất OR khơng phải nguy mắc bệnh Đặc tính nghiên cứu bệnh chứng dừng mô tả gián tiếp nguy mắc bệnh qua tỷ suất OR Một thiết kế nghiên cứu khác sử dụng để xác định xác nguy mắc ung thư tế bào gan kiểu gen, bị nhiễm HBV Một nghiên cứu đưa số nguy RR (relative risk) Đó tiến cứu, tiến hành nhiều năm, sau xác định xác nhiễm HBV mạn Kết quan sát thời gian dài ghi nhận số bệnh nhân tiến triển thành ung thư tế bào gan nguyên phát Từ tỷ lệ phát bệnh thu được, tính tốn xác số nguy TCNCYH 108 (3) - 2017 (RR) mắc ung thư tế bào gan cho kiểu gen Hơn nữa, độ tuổi trung bình bệnh nhân ung thư cho biết tuổi khởi phát bệnh kiểu gen gây cho đối tượng nhiễm HBV Đây hạn chế lớn đề tài nghiên cứu mà hạn chế chung nghiên cứu bệnh chứng Tuy nhiên mơ hình tiến cứu, đòi hỏi phải tiến hành khoảng thời gian kéo dài nhiều năm phải quản lý đối tượng tham gia nghiên cứu suốt trình điều trị Tại Việt Nam, HBV nguyên nhân lớn ung thư tế bào gan Việc điều trị quản lý bệnh nhân viêm gan virus B ngày quan tâm Một nghiên cứu tiến cứu đối tượng có tính khả thi V KẾT LUẬN Đa hình nucleotid đơn R72P gen TP53 liên quan đến khả mắc ung thư tế bào gan nguyên phát người nhiễm HBV Kiểu gen P72P làm tăng khả mắc bệnh lên ba lần Lời cảm ơn Đề tài thực với hỗ trợ kinh phí đề tài nhánh cấp nhà nước “Đánh giá phân bố kiểu gen số gen liên quan đến ung thư phổi ung thư gan” thuộc đề tài nhiệm vụ Quỹ gen “Đánh giá đặc điểm di truyền người Việt Nam” Nhóm nghiên cứu trân trọng cảm ơn khoa Nội tiêu hoá- Bệnh viện Bạch Mai, Trung tâm Ung bướu Bệnh viện Đa khoa tỉnh Thanh Hoá, Trung tâm nghiên cứu GenProtein, Trường Đại học Y Hà Nội tạo điều kiện giúp đỡ trình nghiên cứu TÀI LIỆU THAM KHẢO Vogelstein, B., Lane, D & Levine, A J (2000) Surfing the p53 network Nature 408, 307 – 310 Vousden KH & Lane DP (2007) P53 in 21 TẠP CHÍ NGHIÊN CỨU Y HỌC health and disease Nature Rev Mol Cell Biol 275 – 283 Prives C & Hall PA (1999) The p53 pathway J Pathol 187, 112 – 126 Bode AM & Dong Z (2004) Posttranslational modification of p53 in tumorigenesis Nature Rev cancer 4, 793 805 Olivier M., et al (2008) Recent advances in p53 research: an interdisciplinary perspective Cancer Gene Ther 125, 47 - 61 Whibley C., Pharoah PD., Hollstein M (2009) P53 polymorphisms: cancer implications Nat Rev Cancer 9, 95 - 107 Dumont, P., Leu, J I., Della Pietra, A C 3rd, George, D L & Murphy, M (2003) The codon 72 polymorphic variants of p53 have markedly different apoptotic potential Nature Genet 33, 357 – 365 Chan,H.L, et al (2006) Hepatocellular carcinoma and hepatitis B virus Semin Liver Dis 26, 153 – 161 Han,K.H, et al (2005) How to predict HCC development in patients with chronic B viral liver disease? Intervirology 48, 23 – 28 10 Kim,Y.J, et al (2005) Single nucleotide polymorphisms associated with hepatocellular carcinoma with chronic hepatitis B virus infection Intervir-ology 48, 10 – 15 11 Yoon YJ, Chang HY, Ahn SH, Kim JK, Park YK, Kang DR, et al (2008) MDM2 and p53 polymorphisms are associated with the development of hepatocellular carcinoma in patients with chronic hepatitis B virus infection Carcinogenesis 29, 1192 - 1196 12 Zhu ZZ, Cong WM, Liu SF, Xian ZH, Wu WQ, et al (2005) A p53 polymorphism modifies the risk of hepatocellular carcinoma among non-carriers but not carriers of chronic hepatitis B virus infection Cancer Lett 229, 77 – 83 Summary THE TP53 R72P POLYMORPHISM AND HEPATOCELLULAR CARCINOMA RISK OF HBV INFECTED PEOPLE Single nucleotide polymorphism (SNP) R72P located in exon of TP53 is involved in cancer development and tumor onset: including hepatocellular carcinoma (HCC) For the purpose of finding correlations between the genotypes of SNP R72P and HBV in hepatic tumor formation, we evaluated the correlation between SNP R72P and the risk of HCC in people who are HBV infected The study population is 280 HCC patients, with 171 HBV infected cases The control has 267 peoples with 36 HBV infected cases The restriction fragment length polymorphism (RFLP) technique was used for genotyping R72P SNP, then we detected frequency and risk of genotypes The outcome show evidence that P72P genotype increases the risk of HCC in HBV infected people OR = 3,23 ; 95% ; CI (1,12 – 9,45) Keywords: TP53 R72P, HBV, hepatocellular carcinoma 22 TCNCYH 108 (3) - 2017 ... HBV, HCV, nghiện rượu, theo mô hình hồi quy logistic đa biến Kết b ng cho thấy, kiểu gen SNP R72P gen TP53 có liên quan với nguy mắc Ung thư tế b o gan nguy n phát người nhiễm virus HBV Đặc biệt... B3 1, B3 3, B3 6 mẫu b nh KG85, KG87 Kiểu gen đồng hợp tử R72R (GG) có hai vạch xuất mẫu chứng B3 5 mẫu b nh KG86 B ng Kiểu gen SNP R72P khả mắc ung thư tế b o gan nguy n phát người nhiễm HBV Đa hình. .. hợp ung thư tế b o gan nguy n phát có tiền sử nhiễm HBV nhiều Tuy nhiên, thực tế có nhiều trường hợp có tiền sử viêm gan virus B không tiến triển thành ung thư tế b o gan Hoặc nhiễm HBV có người