Bài báo thông báo kết quả phân lập hai dẫn chất catechin trong sinh khối tế bào Thông đỏ. Nghiên cứu đã sử dụng phương pháp chiết xuất phân đoạn, sắc ký cột, nhận dạng dựa vào các thông số lý hóa. Kết quả nghiên cứu cho thấy hợp chất (-)-epicatechin lần đầu tiên được tìm thấy trong sinh khối tế bào của Taxus wallichiana Zucc.
TạP CHí Y - DƯợc học quân số chuyên ®Ị d−ỵc-2016 PHÂN LẬP HAI DẪN CHẤT CATECHIN TỪ SINH KHỐI TẾ BÀO THÔNG ĐỎ (Taxus wallichiana Zucc.) Trịnh Nam Trung*; Vũ Bình Dương*; Nguyễn Minh Chính* TĨM TẮT Mục tiêu: chiết xuất phân lập dẫn chất catechin Phương pháp: chiết xuất phân đoạn, sắc ký cột, nhận dạng dựa vào thơng số lý hóa Kết quả: phân lập hai dẫn chất (+)-catechin (1) (-)-epicatechin (2) từ dịch chiết methanol sinh khối Thông đỏ Kết luận: hợp chất (-)-epicatechin lần tìm thấy sinh khối tế bào Taxus wallichiana Zucc * Từ khóa: Thơng đỏ; Taxus wallichiana; Sinh khối; (+)-catechin; (-)-epicatechin Isolation of Two Catechin Derivatives from Cultured Cells of Taxus wallichiana Zucc Summary Objectives: To isolate catechin derivatives Methods: fractional extraction, column chromatography, structural elucidation based on physicochemical data Results: Two compounds (+)-catechin (1) and (-)-epicatechin (2) were isolated from methanol extract of biomass of Taxus wallichiana Conclusion: (-)-epicatechin was isolated from cultured cells of Taxus wallichiana for the first time * Key words: Taxus wallichiana; Biomass; (+)-catechin; (-)-epicatechin ĐẶT VẤN ĐỀ Hiện nay, công nghệ sinh khối tế bào thực vật hướng có nhiều triển vọng để sản xuất hoạt chất từ dược liệu quy mô lớn [1] Học viện Quân y tiến hành nuôi cấy sinh khối tế bào Thơng đỏ nhằm mục đích sản xuất paclitaxel dẫn chất dùng để điều trị ung thư [2] Trong này, thông báo kết phân lập hai dẫn chất catechin sinh khối tế bào Thông đỏ NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Nguyên vật liệu thiết bị * Nguyên vật liệu: Sinh khối tế bào Thông đỏ Việt Nam thu từ q trình ni cấy mơi trường lỏng SH (Học viện Quân y cung cấp, Lô SX 08/2010) * Hóa chất, thiết bị: - Thiết bị chiết siêu âm gia nhiệt Memmert GmbH + Co.KG D-91126 Schwabach FRG (Đức) Máy cất quay Rotavapor R-200, Buchi (Đức) Máy Fraction collector DC-1200 (Nhật) * Học viện Quân y Người phản hồi (Corresponding): Trịnh Nam Trung (tntqy114@gmail.com) Ngày nhận bài: 20/07/2016; Ngày phản biện đánh giá báo: 22/08/2016 Ngày bỏo c ng: 12/09/2016 19 Tạp chí y - dợc học quân số chuyên đề dợc-2016 - Sc ký cột: sử dụng chất nhồi cột loại pha thuận silica gel cỡ hạt 70 - 230 mesh (0,04 - 0,063 mm) 230 - 400 mesh (0,063 - 0,200 mm) (Merck), loại pha đảo YMC RP-18 resin cỡ hạt 30 - 50 µm (Fuji Silysia Chemical Ltd.) - Nhiệt độ nóng chảy: đo máy Electrothermal 9100 (Anh) - Năng suất quay cực: đo máy Jasco DIP-370 (Nhật) - Phổ tử ngoại (UV): đo máy Speccord 40 (Đức) - Phổ hồng ngoại (IR): đo máy Hitachi-730-30 (Nhật) - Phổ khối lượng (ESI-MS): đo máy LC-MSD Agilent 6310 Ion Trap (Mỹ) - Phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NMR): đo máy Bruker Avance 500 (Đức) Phương pháp nghiên cứu * Chiết xuất, phân lập: Bột dược liệu khô chiết siêu âm với methanol Cắn thu sau cất loại ethanol, hòa vào nước chiết phân đoạn với n-hexan, ethyl acetat n-butanol Phân lập cắn ethyl acetat sắc ký cột pha thuận với chất hấp phụ silicagel Tinh chế sắc ký cột pha đảo lặp lại với chất hấp phụ YMC * Xác định cấu trúc hóa học: Đo nhiệt độ nóng chảy chất phân lập, suất quay cực ghi loại phổ: phổ tử ngoại (UV), phổ hồng ngoại (IR), phổ khối lượng (MS), phổ cộng hưởng từ hạt nhân chiều (1H-, 13C-NMR DEPT) Cấu trúc hóa học chất phân lập xác định cách so sánh với liệu công bố 20 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ BÀN LUẬN Kết chiết xuất, phân lập Xay nhỏ dược liệu (300 g) chiết với methanol (1 lít x lần) thiết bị chiết siêu âm Dịch methanol lần chiết lọc, gom lại cất loại dung môi nhiệt độ không 60oC áp suất giảm, thu 78 g cắn dịch ethanol Hòa cắn vào nước (tỷ lệ 1/1), lắc siêu âm chiết phân đoạn với dung môi n-hexan, ethyl acetat n-butanol theo tỷ lệ 1/1 (3 lần), thu cắn dịch tương ứng n-hexan (11 g), ethyl acetat (20 g), n-butanol (13 g) nước (16 g) Tiến hành phân tách thô cắn ethyl acetat sắc ký cột pha, thường sử dụng thang nồng độ hệ dung môi rửa giải cloroform/methanol từ 100/1 đến 75/1, 50/1, 25/1, 10/1, 5/1, 3/1, 1/1, thu phân đoạn tương ứng Rửa giải phân đoạn cloroform/methanol 10/1 (1,5 g), tiến hành tinh chế với sắc ký cột lặp lại sử dụng chất hấp phụ pha đảo YMC RP-18 hệ dung môi rửa giải nước/methanol 1/1, thu hợp chất (75 mg) hợp chất (24 mg) dạng chất bột có màu trắng Kết nhận dạng chất phân lập Chất chất đo nhiệt độ nóng chảy, suất quay cực ghi phổ UV, IR, ESI-MS NMR Kết cho thấy: - Chất 1: bột có màu trắng, nhiệt độ nóng chảy 173 - 175°C; suất quay 20 cực [α] D + 21,5° (MeOH, c 0,4); UV (MeOH) λmax: 240 280 nm; IR (KBr) νmax 3.325 (OH), 1.607; 1.519; 1.449 (C=C); 1.359; T¹P CHÝ Y - DƯợc học quân số chuyên đề dợc-2016 1.283; 1.141 cm-1; ESI-MS m/z 289 [M - H]– (C15H14O6, M = 290); 1H NMR (400 MHz, CD3OD) δ: 6,79 (1H, d, J = 1,9 Hz, H-2′); 6,71 (1H, d, J = 8,0 Hz, H-5′); 6,67 (1H, dd, J = 8,0, 1,9 Hz, H-6′); 5,88 (1H, d, J = 2,3 Hz, H-6); 5,81 (1H, d, J = 2,3 Hz, H-8); 4,52 (1H, d, J = 7,3 Hz, H-2); 3,93 (1H, m, H-3); 2,80 (1H, dd, J = 16,2, 5,4 Hz, Ha-4); 2,46 (1H, dd, J = 16,2, 8,2 Hz, Hb-4); 13C NMR (100 MHz, CD3OD) δ: 157,8 (C-9); 157,5 (C-5); 156,9 (C-7); 146,2 (C-3′); 146,2 (C-4′); 132,2 (C-1′); 120,0 (C-6′); 116,1 (C-5′); 115,2 (C-2′); 100,8 (C-10); 96,2 (C-6); 95,5 (C-8); 82,8 (C-2); 68,8 (C-3); 28,5 (C-4) - Chất 2: bột có màu trắng, nhiệt độ nóng chảy 230 - 232°C; suất quay 20 cực [α] D -21,0° (MeOH, c 0,6); UV (MeOH) λmax: 240 280 nm; IR (KBr) νmax 3325 (OH), 1.607; 1.519; 1.449 (C=C); 1.359; 1.283; 1.141 cm-1; EI-MS m/z 290 [M] (C15H14O6, M = 290); 1H NMR (400 MHz, CD3OD) δ: 6,93 (1H, d, J = 2,0 Hz, H-2′); 6,73 (1H, d, J = 8,1 Hz, H-5′); 6,70 (1H, dd, J = 8,1, 2,0 Hz, H-6′); 5,90 (1H, d, J = 2,3 Hz, H-6); 5,89 (1H, d, J = 2,3 Hz, H-8); 4,76 (1H, s, H-2); 4,13 (1H, m, H-3); 2,69 (1H, dd, J = 16,5, 3,2 Hz, Ha-4); 2,80 (1H, dd, J = 16,5, 4,6 Hz, Hb-4); 13C NMR (100 MHz, CD3OD) δ: 158,0 (C-9); 157,6 (C-5); 157,3 (C-7); 145,9 (C-4′); 145,7 (C-3′); 132,3 (C-1′); 119,4 (C-6′); 115,9 (C-5′); 115,3 (C-2′); 100,0 (C-10); 96,4 (C-6); 95,9 (C-8); 79,8 (C-2); 67,5 (C-3); 29,2 (C-4) Phổ 1H-NMR, 13C-NMR DEPT hợp chất cho tín hiệu cộng hưởng đặc trưng flavan-3-ol Đơn vị C3 hệ thống C6-C3-C6 thể tín hiệu nhóm methylen [δH 2,69 (1H, dd, J = 16,5; 3,2 Hz, Ha-4); 2,80 (1H, dd, J = 16,5; 4,6 Hz, Hb-4) δC 29,2 (CH2, C-4)] hai nhóm methin gắn với oxygen [δH 4,76 (1H, s tù, H-2); 4,13 (1H, m, H-3) δC 79,8 (CH, C-2); 67,5 (CH, C-3)] Ngồi ra, có tín hiệu cộng hưởng hai vòng benzen Vòng A thể tín hiệu đặc trưng nhân benzen thuộc hệ thống benzopyran [δH 5,90 (1H, d, J = 2,3 Hz, H-6); 5,89 (1H, d, J = 2,3 Hz, H-8) δC 157,6 (C-OH, C-5); 96,4 (CH, C-6); 157,3 (C-OH, C-7); 95,9 (CH, C-8); 158,0 (C-O, C-9); 100,0 (C, C-10)] Vòng B thể tín hiệu đặc trưng nhân benzen bị hai lần vị trí para meta [δH 6,93 (1H, d, J = 2,0 Hz, H-2′); 6,73 (1H, d, J = 8,1 Hz, H-5′); 6,70 (1H, dd, J = 8,1, 2,0 Hz, H-6′) δC 132,3 (C, C-1′); 115,3 (CH, C-2′); 145,7 (C-OH, C-3′); 145,9 (C-OH, C-4′); 115,9 (CH, C-5′); 119,4 (CH, C-6′)] - Dữ liệu phổ 1H-NMR, 13C-NMR DEPT cho thấy hợp chất có cấu trúc hóa học tương tự 2, khác vị trí carbon số [δH 4,52 (1H, d, J = 7,3 Hz, H-2); 3,93 (1H, m, H-3) δC 82,8 (CH, C-2); 68,8 (CH, C-3)] 20 Ngoài ra, suất quay cực ([α] D ) +21,5° (MeOH, c 0,4), -21,0° (MeOH, c 0,6) Cấu tạo chất phân lập khẳng định liệu phổ EI-MS với píc ion giả phân tử m/z 289 [M - H]– (C15H14O6, M = 290) píc ion phân tử m/z 290 [M] (C15 H14O6 , M = 290) Từ liệu trên, kết hợp so sánh với số liệu công bố tài liệu tham khảo [3], kết luận chất (+)-catechin, 21 T¹p chÝ y - dợc học quân số chuyên đề dợc-2016 cht (-)-epicatechin (+)-catechin chứng minh có sinh khối Taxus wallichiana [4] hai hợp chất tìm thấy sinh khối tế bào số lồi Taxus khác [5] Tuy nhiên, cơng bố hợp chất (-) -epicatechin sinh khối tế bào Taxus wallichiana Zucc Hình 1: Cơng thức cấu tạo chất phân lập KẾT LUẬN Bằng phương pháp sắc ký cột pha thuận (chất hấp phụ silicagel) pha đảo (chất hấp phụ YMC), hợp chất (+)-catechin (1) (-)-epicatechin (2) phân lập từ sinh khối tế bào Thông đỏ (Taxus wallichiana Zucc.) Cấu trúc hóa học chất phân lập xác định dựa vào phương pháp phổ cộng hưởng từ hạt nhân chiều (1D NMR: 1H, 13CNMR DEPT) phổ khối lượng (MS) Hợp chất (-)-epicatechin lần tìm thấy sinh khối tế bào Taxus wallichiana Zucc Vũ Bình Dương, Nguyễn Văn Long, Hoàng Văn Lương, Nguyễn Tùng Linh, Sang Yo Byun Nghiên cứu quy trình tạo callus Thơng đỏ (Taxus wallichiana) Tạp chí Dược học 2008, 9, tr.24-27 Cai Y, Evans FJ, Roberts MF, Phillipson JD, Zenk MH, Gleba YY Biological and chemical investigation of dragon's blood from Croton species of South America Part Polyphenolic compounds from croton lechleri Phytochemistry 1991, 30 (6), pp.2033-2040 TÀI LIỆU THAM KHẢO Shipra Agrawal, Suchitra Banerjee, Sunil K Chattopadhyay, K V Shashidhar, Shiv Kumar Gupta, Sushil Kumar Synthesis of (+)catechin penta-acetat by callus culture of Himalayan Yew, Taxus wallichiana Zucc Indian Journal of Biotechnology 2003, 222 (2), pp.264-267 Vũ Bình Dương, Nguyễn Văn Long, Hồng Văn Lương, Lê Bách Quang Sinh khối tế bào thực vật, hướng sản xuất ngun liệu làm thuốc Tạp chí Thơng tin Y Dược 2008, 12, tr.6-9 Bulgakov VP, Tchernoded GK, Veselova MV, Fedoreyev SA, Muzarok TI, Zhuravlev YN Catechin production in cultured cells of Taxus cuspidata and Taxus baccata Biotechnology Letters 2011, 33 (9), pp.1879-1883 22 ... YMC), hợp chất (+) -catechin (1) (-)-epicatechin (2) phân lập từ sinh khối tế bào Thông đỏ (Taxus wallichiana Zucc.) Cấu trúc hóa học chất phân lập xác định dựa vào phương pháp phổ cộng hưởng từ hạt... luận chất (+) -catechin, 21 Tạp chí y - dợc học quân số chuyên đề dợc-2016 cht l (-)-epicatechin (+) -catechin ó c chứng minh có sinh khối Taxus wallichiana [4] hai hợp chất tìm thấy sinh khối tế bào. .. hợp chất (-) -epicatechin sinh khối tế bào Taxus wallichiana Zucc Hình 1: Cơng thức cấu tạo chất phân lập KẾT LUẬN Bằng phương pháp sắc ký cột pha thuận (chất hấp phụ silicagel) pha đảo (chất