Xác định đa hình gen AhR trên các đối tượng phơi nhiễm Dioxin

Mục tiêu nghiên cứu bài viết là tìm mối tương quan giữa các đa hình gen AhR với các nhóm đối tượng phơi nhiễm dioxin khác nhau. Mời các bạn cùng tham khảo nội dung chi tiết của tài liệu.

TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ CHUYÊN ĐỀ HÌNH THÁI HỌC-2017 XÁC ĐỊNH ĐA HÌNH GEN AhR TRÊN CÁC ĐỐI TƢỢNG PHƠI NHIỄM DIOXIN Lê Kim Dung*; Nơng Văn Hải**; Nguyễn Huy Hồng** Nguyễn Thị Kim Liên**; Nguyễn Ngọc Lan** TĨM TẮT Mục tiêu:tìm mối tương quan đa hình gen AhR với nhóm đối tượng phơi nhiễm dioxin khác Đối tượng phương pháp: tổng số mẫu máu phân tích 114 mẫu, bao gồm 94 mẫu vùng phơi nhiễm, 27 mẫu máu xác định có hàm lượng TCDD cao mắc bệnh liên quan đến dioxin; 34 mẫu có hàm lượng TCDD cao không mắc bệnh liên quan dioxin 20 mẫu vùng khơng phơi nhiễm Kết quả:tồn 11 exon gen AhR đọc trình tự so sánh với gen AhR tham chiếu Phát đa hình rs17779352 (c.132T>C, p.N44N) exon 2, ba đa hình rs75519181 (c.1459A>G, p.N487D), rs779531731 (c.1541T>C, p.I514T), rs2066853 (c.1661G>A; p R554K) exon 10 đa hình rs3802082 vùng intron Đa hình rs2066853 xuất 73 trường hợp, với tần suất cao 0,64 Phân tích sâu đa hình này, phát tần suất kiểu gen GG GA khác biệt có ý nghĩa thống kê (p < 0,05) nhóm có nồng độ dioxin khác Kết luận:có mối tương quan có ý nghĩa thống kê (p < 0,05) nhóm có TCDD máu cao bị bệnh liên quan đến dioxin với nhóm có TCDD cao khơng bị bệnh liên quan dioxin * Từ khóa: Đa hình gen AhR; Phơi nhiễm dioxin; p R554K Identification of Single Nucleotide Polymorphism in AhR Gene from Dioxin Exposed Populations in Vietnam Summary Objectives: To find correlations between the AhR gene polymorphisms and the different groups of dioxin exposed populations Subjects and methods: The total sample size was 114 samples, including: 94 samples in the dioxin exposed areas of which 27 blood samples had high levels of TCDD and dioxin-associated diseases; 34 samples had high levels of TCDD but no dioxin-associated disease; and 20 samples in the non-exposed areas Results: All 11 exons of the AhR gene were sequenced and compared with the reference AhR gene We detected a SNPrs17779352 (c.132T>C, p.N44N) in exon 2, three SNPrs75519181 (c.1459A>G, p.N487D), rs779531731 (c.1541T>C, p.I514T), rs2066853 (c.1661G>A; p.R554K) in exon 10, and a SNP rs3802082 in intron The SNP rs2066853 occurred in 73 cases and with the highest frequency of 0.64 In deeper analysis of this SNP, we found that the GG and GA genotype differed significantly (p < 0.05) between groups with different dioxin levels Conclusion: There was a statistically significant correlation (p < 0.05) between the group had high levels of TCDD and dioxinassociated diseases and the group had high levels of TCDD but no dioxin-associated disease * Keywords: AhR gene polymorphism; Dioxin exposure; p.R554K * Học viện Quân y * Viện Nghiên cứu Hệ gen, Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam Người phản hồi (Corresponding): Lê Thị Kim Dung (dunghvqy@gmail.com) Ngày nhận bài: 27/07/2017; Ngày phản biện đánh giá báo: 29/08/2017 Ngày báo đăng: 04/09/2017 305 TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ CHUYÊN ĐỀ-2017 ĐẶT VẤN ĐỀ Aryl hydrocarbon receptor (AhR) - gọi thụ thể dioxin, nhân tố phiên mã hoạt hóa cấu tử (ligand) Chất 2,3,7,8-tetrachlorodibenzop-dioxin, thường gọi ngắn gọn TCDD, chất độc chất dioxin ligand điển hình thụ thể AhR [4].Có nhiều nghiên cứu in vitro tế bào người, nghiên cứu in vivo động vật, với điều tra dịch tễ tiến hành quần thể người phơi nhiễm dioxin cho thấy đa hình gen AhR điều chỉnh đáp ứng thể với chất độc dioxin Ở khu vực bị ô nhiễm nặng, mức độ dioxin cao đất, nước chuỗi thức ăn làm gia tăng tỷ lệ mắc loại ung thư Mặc dù vậy, có nhiều cư dân sống vùng nhiễm lại không mắc ung thư hay bệnh liên quan đến dioxin Điều này, giải thích dựa sở lực liên kết dioxin với thụ thể AhR, người ta cho khác biệt cá thể mức độ nhạy cảm với dioxin do: (i) Các đa hình gen AhR khác mã hóa thụ thể có lực khác với TCDD (ii) Các ligand khác có tế bào hay môi trường cạnh tranh với TCDD liên kết với AhR[3] Mục tiêu: Tìm hiểu mối tương quan đa hình gen AhR nhóm đối tượng phơi nhiễm với dioxin khác ĐỐI TƢỢNGVÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Đối tƣợng nghiên cứu Người dân sống khu vực sân bay Biên Hòa sân bay Đà Nẵng, 306 coi điểm nóng nồng độ dioxin Việt Nam Các bệnh liên quan đến dioxin theo quy định Bộ Y tế Việt Nam mà đối tượng mắc phải bao gồm: ung thư, tiểu đường týp II, bất thường sinh sản dị dạng bẩm sinh Mẫu máu đối tượng nghiên cứu xác định hàm lượng dioxin tổng số kỹ thuật DR CALUX Trung tâm Nghiên cứu Y dược học Quân sự, Học viện Quân y Hàm lượng đồng phân dioxin xác định kỹ thuật GC-MS Labo xét nghiệm dioxin Trung tâm nhiệt đới Việt Nga Nhóm đối chứng người sống khu vực phía Bắc Việt Nam, nơi khơng bị ảnh hưởng dioxin Tổng số mẫu máu phân tích 114 mẫu, bao gồm: 94 mẫu vùng phơi nhiễm (trong 27 mẫu máu xác định có hàm lượng TCDD cao ≥ 10 ppt mắc bệnh liên quan đến dioxin; 34 mẫu có hàm lượng TCDD cao ≥ 10 ppt không mắc bệnh liên quan đến dioxin) 20 mẫu vùng không phơi nhiễm Phƣơng pháp nghiên cứu Các mẫu máu nghiên cứu tách chiết ADN kit GeneJetTM Genomic DNA Purificationcủa (Hãng Fermentas) Toàn 11 exon gen AhR nhân lên phương pháp PCR sử dụng cặp mồi đặc hiệu trình bày (bảng 1) Tinh Sản phẩm PCR kit GeneJet Gel Extractioncủa (Hãng Fermentas) giải trình tự máy ABI 3500 Genetic Analyzer Kết đọc trình tự, phân tích phần TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ CHUYÊN ĐỀ HÌNH THÁI HỌC-2017 mềm Expasy 2.5 BioEdit 7.0 để phát biến đổi Trình tự so sánh gen AhR người lấy từ sở liệu Ensemble có số hiệu ENSG00000106546 So sánh kết với liệu dbSNP sở liệu NCBI https://www.ncbi.nlm.nih.gov/snp/ Xử lý số liệu phần mềm SPSS 20.0 Bảng 1: Danh sách mồi dùng nhân đoạn exon gen AhR Exon Tên mồi 1F Tr nh tự mồi (5’ 3’) Exon GCCTATGCACGAAGATGGCT Tên mồi Tr nh tự mồi (5’ 3’) 6F GGTCACAAAGAGCCTGATG 6R TAAGGCAAATCCAAGCTG 78F AGAACCCTAGAGGCAGCCAT 78R CCAAGCAAAACTTCATGGGC 9F GCCCATGAAGTTTTGCTTGG 9R AGCTCTGCACATGTAGCTCTCA 10F GCACCAGTCATGAGAATAATTGAG 10R AATGCTGTCTCCATGAATGC 11F GTCCTCAGTATGTCTTCACTGTGT 11R CCAAACCTTGCTATCTGC 1R CCCAGGATCGCAGGGATTTG 2F GCTAATGCATTTGAGAGGG 7-8 2R GGCTGCATCTGTTGGGTGAA 3F TCACCACCACCAGTTCCCTA 3R ATCGCAGTTCAGATGAAAGTGG 4F ATCTTTGCCTCCTGTTTCCCT 10 4R GACCCTACGTGCCTGAAAGT 5F CATCACCACTAGCAAGCACC 11 5R ACAGGTTCCCAGCCTCCTTT KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ BÀN LUẬN Hình 1: Kết giải trịnh tự gen AhR (Biến đổi phát exon c.132T>C, pN44N (A) Biến đổi phát intron dạng dị hợp c.575-199A>T (B) Biến đổi phát intron dạng đồng hợp 307 TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ CHUYÊN ĐỀ-2017 c.575-199TT (C) Biến đổi phát exon 10 bao gồm c.1459A>G, p.N487D (D); c.1541T>C, p.I514T (E); c.1661G>A, p.R554K dạng dị hợp tử (F);D c.1661G>A, p.R554K dạng đồng hợp tử (G) Bảng 2: Các biến đổi gen AhR phát nghiên cứu Số hiệu đa hình Tần suất vùng Tần suất vùng không phơi phơi nhiễm nhiễm Vị trí gen Thay đổi nucleotide Thay đổi axít amin rs17779352 Exon c.132T>C N44N 1/12 (0.083) 1/22 (0,045) rs3802082 Intron c.575199A>T - 9/12 (0.75) 6/10 (0.6) 15/22 (0,682) rs75519181 Exon 10 c.1459A>G N487D 2/94 (0.021) 2/114 (0,018) rs779531731 Exon 10 c.1541T>C I514T 1/94 (0.010) 1/114 (0,009) rs2066853 Exon 10 c.1661G>A R554K 60/94 (0.638) 13/20 (0.65) 73/114 (0,64) Chúng tơi tiến hành phân tích giải trình tự11 exons 22 mẫu (12 mẫu vùng phơi nhiễm 10 mẫu vùng không phơi nhiễm) Riêng với exon 10, tiến hành phân tíchtrên 114 mẫu.Kết phát biến đổi vùng exon biến đổi vùng intron (hình 1, bảng 2) Khơng phát thấy biến đổi exon lại nhóm nghiên cứu nhóm đối chứng Phát biến đổi thay nucleotid thymine thành cytosine vị trí 132 cADN (c.132T>C) Biến đổi công bố sở liệu SNP NCBI với số hiệu rs17779352 Biến đổi không làm thay đổi axít (p.N44N), xuất dạng dị hợp mẫu thuộc vùng phơi nhiễm dioxin với tần suất 0,083 Đối tượng mang biến đổi có nồng độ TCDD máu cao (53,57 ppt), chẩn đoán mắc bệnh ung thư khí quản tiểu đường týp II Kết phù hợp với nghiên cứu Rowlands CS [7 , đa hình phát 308 Tần suất chung nhóm người châu Âu, Mỹ gốc Phi, Nhật Bản, Trung Quốc với tần suất tương ứng 0,077; 0,077; 0,0286; 0,056 Khi phân tích trình tự đoạn exon 6, chúng tơi khơng thấy có biến đổi vùng mã hóa exon 6, phát biến đổi vùng intron exon 6, nucleotid adenin thay Thymine (c.575199A>T) Biến đổi phù hợp với điểm đa hình cơng bố sở liệu SNP NCBI (rs3802082) Nghiên cứu chúng tôi, đa hình rs3802082 xuất 15 mẫu, bao gồm mẫu vùng phơi nhiễm mẫu đối chứng, tần suất đa hình tương ứng 0,75 0.6 Đối chiếu với sở liệu Human Genetic Variation Database (w.w.w.hgvd.genome.med-u.acjp) số chủng tộc người châu Á cho thấy, tần suất đa hình người Kinh sống Thành phố Hồ Chí Minh 0,574, người Nhật Bản 0,702 người Trung Quốc 0,704 Đa hình intron, khơng TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ CHUYÊN ĐỀ HÌNH THÁI HỌC-2017 dẫn đến thay đổi axít amin ảnh hưởng đến biểu chức gen AhR Các nghiên cứu gen AhR cho thấy đa hình gen AhR người chủ yếu xảy exon 10, mã hóa cho miền hoạt hóa thụ thể AhR, đóng vai trò quan trọng điều hòa biểu gen đích [1] Chúng tơi phát ba điểm đa hình exon 10: rs75519181,rs779531731 rs2066853 với tần suất tương ứng 0,018;0,009; 0,64 (bảng 2) Đa hình rs75519181 có thay nucleotid A>G dẫn đến vị trí 487 Asn thay Asp, đối tượng thuộc nhóm có nồng độ TCDD máu ≥ 10 ppt không bị bệnh liên quan đến dioxin Đa hình rs779531731xuất cá thể khác thuộc nhóm có nồng độ TCDD máu ≥ 10 ppt không bị bệnh liên quan dioxin Đa hình có thay nucleotid T>C dẫn đến Ile thay Thr vị trí 514 Đa hình ghi nhận phát lần cá thể người Nhật Bản nghiên cứu Fukushima Uesaka CS [5 với tần suất 0,01 Tuy nhiên, nghiên cứu Fukushima Uesaka [5 , đa hình rs779531731 phát BN ung thư Sự khác biệt kết nghiên cứu hạn chế cỡ mẫu (114 mẫu) số người bị ung thư nghiên cứu chúng tơi Đa hình rs2066853 xuất 73 trường hợp với tần suất cao 0,64 Đa hình thay nucleotid GA vị trí 1661 cADN, dẫn đến thay Argthành Lys vị trí 554 phân tử protein Tần suất alen kiểu gen đa hình rs2066853giữa nhóm nghiên cứu trình bày bảng Bảng 3: Tần suất alen kiểu gen đa hình rs2066853ở nhóm nghiên cứu Nhóm nghiên cứu Kiểu gen: n (tần suất) GG GA AA Tổng n (tần suất) Nhóm dioxin máu ≥ 10 ppt bị bệnh liên quan dioxin 15 27 (0,556) (0,296) (0,148) (1) Nhóm dioxin máu ≥ 10 ppt không bị bệnh liên quan dioxin 22 34 (0,235) (0,647) (0,118) (1) Nhóm dioxin máu < 10 ppt khơng bị bệnh liên quan dioxin 11 18 33 (0,333) (0,546) (0,121) (1) 11 20 (0,35) (0,55) (0,1) (1) Nhóm khơng phơi nhiễm dioxin Tần số kiểu gen GG GA khác biệt có ý nghĩa thống kê (p < 0,05) nhóm có TCDD máu cao bị bệnh liên quan đến dioxin với nhóm có TCDD cao khơng bị bệnh liên quan dioxin.Khơng có khác Tần suất alen G A 0,704 0,296 0,559 0,441 0,606 0,394 0,625 0,375 biệt tần số kiểu gen AA nhóm nghiên cứu Điều tra dịch tễ quần thể người phơi nhiễm dioxin cho thấy đa hình gen AhR điều chỉnh đáp ứng thể với chất độc dioxin [4] Nghiên 309 TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ CHUYÊN ĐỀ-2017 cứu Trung Quốc cho thấy, công nhân làm việc hầm lò mang kiểu gen AA có tỷ lệ phá hủy ADN bạch cầu cao công nhân có kiểu gen GG [3] Đa hình cho làm thay đổi tính nhạy cảm cá thể ung thư phổi ung thư vú [2] human semen quality Reprod Toxicol, 2014, 49, pp.65-73 KẾT LUẬN Chen Y et al Association of polymorphisms in AhR, CYP1A1, GSTM1 and GSTT1 genes with levels of DNA damage in peripheral blood lymphocytes among cokeoven workers Cancer epidemiology and Prevention Biomarkers 2006, 15 (9), pp.1703-1707 Trong nghiên cứu chúng tơi tiến hành giải trình tự tồn 11 exon gen AhR người có nồng độ dioxin khác Đã xác định ba đa hình rs17779352, rs75519181, rs779531731, rs2066853 exon đa hình rs3802082 intron Tần suất kiểu gen GG GA điểm đa hình rs2066853 khác biệt có ý nghĩa thống kê (p < 0,05) nhóm có TCDD máu cao bị bệnh liên quan đến dioxin với nhóm có TCDD cao khơng bị bệnh liên quan dioxin Kết nghiên cứu nhằm bổ sung sở liệu đa hình gen AhR người phơi nhiễm dioxin nói riêng quần thể người Việt Nam nói chung Chen D et al Association of human aryl hydrocarbon receptor gene polymorphisms with risk of lung cancer among cigarette smokers in a Chinese population Pharmacogenetics and genomics 2009, 19(1), pp.25-34 Fracchiolla N.S et al 2, 3, 7, 8Tetrachlorodibenzo-p-dioxin (TCDD) role in hematopoiesis and in hematologic diseases:A critical review Toxicology 2016, 374, pp.60-68 Fukushima-Uesaka H et al Genetic variations of the AhR gene encoding aryl hydrocarbon receptor in a Japanese population Drug metabolism and pharmacokinetics 2004, 19 (4), pp.320-326 TÀI LIỆU THAM KHẢO Ridolfi R et al AhR (aryl hydrocarbon receptor) polymorphisms: A possible role in TCDD (dioxins)-AHR binding and carcinogenesis International Journal of Biology 2014, 6(4), p.82 Brokken L.J et al Interactions between polymorphisms in the aryl hydrocarbon receptor signalling pathway and exposure to persistent organochlorine pollutants affect Rowlands C.J et al The human AhR: identification of single nucleotide polymorphisms from six ethnic populations Pharmacogenetics and genomics 2010, 20 (5), pp.283-290 310 ... 0,704 Đa hình intron, khơng TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ CHUYÊN ĐỀ HÌNH THÁI HỌC-2017 dẫn đến thay đổi axít amin ảnh hưởng đến biểu chức gen AhR Các nghiên cứu gen AhR cho thấy đa hình gen AhR. .. toàn 11 exon gen AhR người có nồng độ dioxin khác Đã xác định ba đa hình rs17779352, rs75519181, rs779531731, rs2066853 exon đa hình rs3802082 intron Tần suất kiểu gen GG GA điểm đa hình rs2066853... p.R554K dạng đồng hợp tử (G) Bảng 2: Các biến đổi gen AhR phát nghiên cứu Số hiệu đa hình Tần suất vùng Tần suất vùng không phơi phơi nhiễm nhiễm Vị trí gen Thay đổi nucleotide Thay đổi axít