Mục tiêu nghiên cứu của đề tài này nhằm xây dựng hệ thống định lượng alpha fetoprotein từ kháng thể đơn dòng kháng alpha fetoprotein được sản xuất từ tế bào lymphô B của chuột lou. Mời các bạn cùng tham khảo bài viết để nắm rõ nội dung chi tiết của đề tài nghiên cứu này.
XÂY DỰNG HỆ THỐNG ĐỊNH LƯỢNG ALPHA-FETOPROTEIN TỪ KHÁNG THỂ ĐƠN DÒNG KHÁNG ALPHA-FETOPROTEIN ĐƯỢC SẢN XUẤT TỪ TẾ BÀO LYMPHƠ B CỦA CHUỘT LOU Phan Ngọc Tiến* TĨMTẮT Mục tiêu nghiên cứu: Xây dựng hệ thống định lượng alpha-fetoprotein huyết từ kháng thể đơn dòng kháng alpha-fetoprotein (AFP) Phương pháp nghiên cứu: Nghiên cứu thực nghiệm Kết quả: Hệ thống định lượng Alpha-fetoprotein kỹ thuật ELISA sử dụng kháng thể đơn dòng kháng AFP, sản xuất từ tế bào lymphô B chuột LOU mẫn cảm với AFP dòng tế bào IR983F, định lượng nồng độ AFP huyết từ 0,5ng/ml Nghiên cứu định lượng AFP 90 mẫu huyết thanh, 35 mẫu huyết người bình thường, 14 mẫu huyết bệnh nhân có HBsAg (+), 16 mẫu huyết bệnh nhân viêm gan siêu vi B cấp, 25 mẫu huyết bệnh nhân u gan Giá trị AFP tương ứng 2,8 ng/ml, 3,8 ng/ml, 32,1 ng/ml, nồng độ AFP huyết bệnh nhân u gan > 500 ng/ml (76%), AFP < 500 ng/ml (24%) Kết luận: Hệ thống định lượng AFP sử dụng kháng thể đơn dòng kháng AFP sản xuất từ chuột LOU có khả định lượng AFP huyết từ 0,5-350ng/ml ABSTRACT THE SYSTEM FOR ALPHA-FETOPROTEIN QUANTITATVE DETERMINATION USING ANTIALPHA-FETOPROTEIN MONOCLONAL ANTIBODIES OF THE B LYMPHOCYTES OF LOU RAT Phan Ngoc Tien * Y Hoc TP Ho Chi Minh * Vol 11 - No - 2007: 208 - 212 Purpose: Set up the system for quantitative determination of alpha-fetoprotein in serum using monoclonal antibodies Method: Experimental research Results: The test ELISA for quantitative determination of alpha-fetoprotein in serum using monoclonal antibodies of LOU rat had realized and characterized by the sensitivity of 0,5ng/ml In the study for determination of alpha-fetoprotein in 90 serum samples, composed of 35 serum samples of normal donors, 14 serum samples of patients with HBsAg (+), 16 serum samples of patients with acute B hepatitis, 25 serum samples of patients with hepatoma, have the serum concentration of AFP 2,8 ng/ml, 3,8 ng/ml, 32,1 ng/ml, and the serum concentration of AFP of patients with hepatoma > 500 ng/ml (76%), AFP < 500 ng/ml (24%), respectively Conclusion: The system for quantitative determination of alpha-fetoprotein in serum using monoclonal antibodies of LOU rat can quantify from 0,5ng/ml to 350ng/ml nhiều lĩnh vực kỹ thuật nhận ĐẶTVẤNĐỀ diện định lượng kháng nguyên Kỹ thuật sản xuất kháng thể đơn dòng Georges Kohler César Milstein trình bày năm 1975(1), từ kháng thể đơn dòng ứng dụng Alpha-fetoprotein (AFP), glycoprotein, có trọng lượng phân tử khoảng 70.000 dalton, tổng hợp gan phôi thai túi ối, nồng độ AFP bình thường dịch ối huyết * Trung Tâm Đào Tạo Bồi Dưỡng Cán Bộ Y Tế TP Hồ Chí Minh 209 bào thai người cao Tuy nhiên AFP có huyết người sau sinh người trưởng thành thấp, khoảng 3ng/ml(7,9,11) Trong bệnh ung thư tế bào gan nguyên phát AFP tăng cao, việc định lượng AFP huyết gốp phần chẩn đoán bệnh ung thư gan nguyên phát Với kháng thể đơn dòng kháng AFP, sản xuất từ tế bào lymphô B chuột LOU mẫn cảm với AFP dòng tế bào IR983(3), xây dựng hệ thống định lượng AFP huyết người kỹ thuật ELISA(5,10) Mục tiêu nghiên cứu Xây dựng hệ thống định lượng alphafetoprotein sử dụng kháng thể đơn dòng kháng alpha-fetoprotein sản xuất từ tế bào lymphô B chuột LOU mẫn cảm với AFP dòng tế bào IR983 ĐỐITƯỢNG-PHƯƠNGPHÁPNGHIÊNCỨU Thiết kế nghiên cứu Nghiên cứu thực nghiệm Đối tượng cỡ mẫu nghiên cứu - Kháng thể đơn dòng kháng AFP, kháng thể đơn dòng kháng AFP có gắn men peroxidase - Và 90 mẫu huyết thanh, thu thập Trung Tâm Đào Tạo Bồi Dưỡng Cán Bộ Y Tế Trung Tâm Ung Bướu TP Hồ Chí Minh Trong 25 mẫu huyết bệnh nhân có siêu âm CT scan phát u gan, 20 nam nữ, 16 mẫu huyết bệnh nhân chẩn đoán viêm gan siêu vi B cấp HBsAg (+), nam nữ, 14 mẫu huyết có HBsAg (+) khơng có biểu lâm sàng, 10 nam – nữ, 35 mẫu huyết người bình thường khỏe mạnh, HBsAg (-) Phương pháp thu thập số liệu - Xác định mối quan hệ tuyến tính hai đại lượng nồng độ AFP giá trị mật độ quang tương ứng (DO): dùng phương pháp ELISA 350, 400, 500 ng/ml Chúng sử dụng AFP tinh chế chuẩn độ Viện Pasteur Tp HCM - Xác định nồng độ AFP thấp định lượng kháng thể đơn dòng từ chuột LOU: dùng phương pháp ELISA - Xác định mật độ quang tương ứng nồng độ thấp AFP: 0; 0,25; 0,5; 0,6; 0,8; 1; 2,5; ng/ml Từ xác định nồng độ AFP thấp định lượng kháng thể đơn dòng từ chuột LOU với phương pháp ELISA - Định lượng AFP mẫu huyết hệ thống định lượng sử dụng kháng thể đơn dòng chuột LOU: dùng phương pháp ELISA Chuẩn bị 90 mẫu huyết đánh số thứ tự từ đến 90, 35 mẫu huyết người bình thường đánh số từ đến 35, 14 mẫu huyết bệnh nhân có HBsAg (+) đánh số từ số 36 đến 49, 16 mẫu huyết bệnh nhân viêm gan siêu vi B cấp đánh số từ 50 đến 65, 25 mẫu huyết bệnh nhân u gan đánh số từ 66 đến 90 Lần mẫu huyết định lượng khơng pha lỗng, lần mẫu huyết có nồng độ 350 ng/ml lần pha loãng với tỉ lệ 1:2 Những mẫu huyết tiếp tục có nồng độ 350ng/ml chúng tơi định lấy kết cuối 500 ng/ml Xử lý số liệu Chương trình Point To Point, chương trình dùng cho xử lý số liệu kỹ thuật Elisa để tính kết định lượng nồng độ AFP Chương trình SPSS 11.5 KẾTQUẢ Quan hệ tuyến tính hai đại lượng nồng độ AFP giá trị mật độ quang tương ứng Với kết thu nhận thấy nồng độ AFP tăng DO tăng theo Nhưng đến nồng độ AFP 350, 400, 500 ng/ml DO tăng không đáng kể - Xác định mật độ quang tương ứng nồng độ AFP: 0, 5, 20, 50, 75, 100, 150, 200, 300, 210 Do ứng dụng định lượng nồng độ AFP huyết đến mức cao 350ng/ml + Phương trình hồi qui tuyến tính có dạng: y = a + bx, đó: Như phương trình hồi qui tuyến tính là: y = 0,599 + 0,0055x Qua đường cong chuẩn hệ thống định lượng AFP dựa kháng thể đơn dòng kháng AFP chuột LOU (đồ thị 1), nhận thấy hai đại lượng DO nồng độ AFP có mối quan hệ tuyến tính thuận + P = 0,002 (< 0,01): chứng tỏ mối liên quan tuyến tính theo chiều thuận hai đại lượng DO nồng độ AFP rõ rệt, tương quan có ý nghĩa thống kê DO + r = 0,880: chứng tỏ hai đại lượng DO nồng độ AFP có mối liên hệ thuận chặt chẽ 3,0 2,5 2,0 300 350 1,5 1,0 ,5 0,0 50 100 150 200 250 400 450 500 AFP (ng/ml) DO Đồ thị 1: Đưông cong chuẩn hệ thống định lượng AFP với kháng thể đơn dòng từ chuột Lou ,30 ,25 ,20 ,15 ,10 ,05 0,00 AFP (ng/ml) Đồ thị 2: Đồ thị biểu diễn giá trị thấp nồng độ AFP độ AFP giảm giá trị DO giảm theo, Kết nồng độ AFP chuẩn thấp mà hệ đến nồng độ 0,5 ng/ml đường biểu diễn thống định lượng AFP dựa kháng thể ngang Do giá trị thấp mà hệ thống đơn dòng kháng AFP chuột LOU định lượng AFP dựa kháng thể đơn dòng định lượng (đồ thị 2) kháng AFP chuột LOU định lượng Qua đường biểu diễn ta thấy nồng 211 0,5 ng/ml KẾTLUẬN Kết định lượng nồng độ AFP mẫu huyết hệ thống định lượng AFP dựa kháng thể đơn dòng kháng AFP chuột LOU Hệ thống định lượng Alpha-fetoprotein kỹ thuật ELISA sử dụng kháng thể đơn dòng kháng AFP, sản xuất từ tế bào lymphơ B chuột LOU mẫn cảm với AFP dòng tế bào IR983, định lượng nồng độ AFP huyết từ 0,5ng đến 350ng/ml Số thứ tự Số mẫu Giá trị Giá trị lớn Giá trị mẫu huyết huyết nhỏ nhất trung bình thanh 1-35 35 1,08 7,26 2,7780 36-49 14 0,91 6,08 3,7993 50-65 16 6,2 113,53 32,1806 Giá trị trung bình nồng độ AFP bệnh nhân u gan (những mẫu huyết từ số 66 đến 90) đa số > 500 ng/ml (76%), mẫu có nồng độ AFP < 500 ng/ml (24%) BÀNLUẬN Hệ thống định lượng Alpha-fetoprotein huyết người phương pháp Elisa sử dụng kháng thể đơn dòng sản xuất từ tế bào lymphơ B chuột Lou dòng tế bào IR983F (AFP-L) có độ nhạy độ đặc hiệu cao có khả định lượng AFP nồng độ thấp 0,5ng/ml so với hệ thống định lượng hãng khác Abbott 0,4ng/ml(2) Maxim Biotech 2ng/ml(6), AFP-L định lượng nồng độ AFP cao 350ng/ml so với hãng Abbott 350ng/ml(2) Maxim Biotech 300mg/ml(6) Hệ thống AFP-L có độ đặc hiệu cao qua thử nghiệm đặc tính định lượng khơng có phản ứng chéo với protein huyết với albumin, protein có trọng lượng phân tử cấu trúc gần giống với AFP Kết định lượng nồng độ AFP 90 mẫu huyết có kết tương đồng với nghiên cứu ngồi nước(2,6,8) Vì vậy, hệ thống định lượng AFP sử dụng kháng thể đơn dòng sản xuất từ chuột Lou có khả định lượng AFP huyết từ 0,5-350ng/ml, chúng tơi hy vọng góp phần nhỏ việc sử dụng hệ thống định lượng AFP Mật độ quang nồng độ AFP có mối quan hệ tuyến tính thuận với r = 0,880, p = 0,002 (< 0,01), y = 0,599 + 0,0055x (y: DO; x: nồng độ AFP chuẩn) Kết nồng độ AFP định lượng hệ thống định lượng AFP sử dụng kháng thể đơn dòng kháng AFP chuột LOU Giá trị trung bình nồng độ AFP người bình thường 2,8 ng/ml Giá trị trung bình nồng độ AFP bệnh nhân có HBsAg(+) 3,8 ng/ml Giá trị trung bình nồng độ AFP bệnh nhân Viêm gan siêu vi B cấp 32,1 ng/ml Giá trị trung bình nồng độ AFP bệnh nhân u gan đa số > 500 ng/ml (76%), mẫu có nồng độ AFP < 500 ng/ml (24%) Cám ơn: GS.TS Nguyễn Lê Trang, Viện Pasteur Tp HCM, BS Cao Đức Trùng Dương BS Lưu Thị Thanh Loan, BV Từ Dũ Tp HCM giúp thực nghiên cứu TÀILIỆUTHAMKHẢO Abbas AK., Lichtman AH., Jordan S.poder (1994), Cellular snd Molecular Immunology, W.B Sauders Company, A division of Harcourt Brace Company, USA Abbott laborarories Dignostics division (1992), In tumor marker/prenatal testing assay IM x AFP, No2257, pp.1-8 Bazin H (1990), Rat Hybridomas and Rat Monoclonal Antobody, CRC Press, USA Harrison’s (1993), Principles of internal medicine, 12th Edition, Vol 2, pp.1381-1383 Kemeny D.M (1991), A practiceal guide to Elisa, Department of Allergy Guy’s Hospital, London Maxim Biotech (2006), “Alpha-fetoprotein Enzyme Immunoassay test kit”, Catalog number: DP-1001, LA, USA Nguyễn Cao Cương (2000), “Tầm sóat ung thư gan nguyên phát”, Nội khoa y học, TTĐT&BDCBYT, tập 3(4), tr.24-28 Nguyễn Kim Lữ Hiếu, Lê Văn Đôn (1996), “Nồng độ Alpha-fetoprotein 37 bệnh nhân chẩn đoán lâm sàng viêm gan B cấp tính”, Tạp chí y học thực hành, (3), tr 1-3 212 10 11 Nguyễn Văn Vân (2000), “Ung thư gan”, Bách khoa thư bệnh học tập 1, nhà xuất tự điển bách khoa, Hà Nội, tr 303-306 Tijssen P (1985), Practice and Theory of enzyme immunoassays, Elsevier, The Netherlands Trần Thị Chính, Phan Thị Phi Phi, Trương Mộng Trang (1993), “Đánh giá khả chẩn đoán ung thư gan Alpha-fetoprotein”, Y học Việt Nam, (5), tr.31-35 213 214 ... tiêu nghiên cứu Xây dựng hệ thống định lượng alphafetoprotein sử dụng kháng thể đơn dòng kháng alpha- fetoprotein sản xuất từ tế b o lymphô B chuột LOU mẫn cảm với AFP dòng tế b o IR983 ĐỐITƯỢNG-PHƯƠNGPHÁPNGHIÊNCỨU... phần chẩn đoán b nh ung thư gan nguyên phát Với kháng thể đơn dòng kháng AFP, sản xuất từ tế b o lymphô B chuột LOU mẫn cảm với AFP dòng tế b o IR983(3), xây dựng hệ thống định lượng AFP huyết... đường biểu diễn thống định lượng AFP dựa kháng thể ngang Do giá trị thấp mà hệ thống đơn dòng kháng AFP chuột LOU định lượng AFP dựa kháng thể đơn dòng định lượng (đồ thị 2) kháng AFP chuột LOU định